大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。

细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。

在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。

1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。

探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。

功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。

2*破3S停10S，破个二三十次看看。

3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。

另外可以从菌浓度方面考虑。

在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。

使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL 大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。

重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。

这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。

下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。

一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。

常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。

不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。

例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。

2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。

常用的表达载体有质粒、病毒载体等。

质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。

3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。

转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。

转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。

4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。

常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。

二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。

细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。

分离方法包括离心、电泳、柱层析等。

2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。

常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。

3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。

例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。

这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。

三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。

例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。

超声波破碎细胞的常见问题大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。

细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。

在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。

1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。

探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。

功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。

2*破3S停10S，破个二三十次看看。

3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。

另外可以从菌浓度方面考虑。

在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

问：链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？答：前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。

使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40mL大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2. 方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。

取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。

直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。

2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。

（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。

这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。

2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。

可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。

3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。

只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。

4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。

这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。

5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。

使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。

6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。

这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。

7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。

以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。

具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。

含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。

将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。

通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。

2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。

3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。

4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。

5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。

细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。

生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。

生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。

低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。

IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。

所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。

6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。

二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。

2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小时，至对数生长中期。

纯化大肠杆菌的方法
首先，准备工作是非常重要的。

在进行大肠杆菌的纯化前，需要准备好所需的实验器材和试剂，包括培养基、离心管、离心机、超声波破碎机等。

同时，要确保实验室环境的清洁和无菌操作。

其次，进行大肠杆菌的培养和收获。

首先将大肠杆菌接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。

培养时间和条件根据具体实验而定，一般需要在37摄氏度下培养12-16小时。

培养后，使用离心机将培养液进行离心，收集细菌沉淀。

接下来是大肠杆菌的破碎和裂解。

将收集到的细菌沉淀用适当的缓冲液进行悬浮，然后使用超声波破碎机进行破碎和裂解。

这一步是为了破坏细菌细胞壁，释放细胞内的目标蛋白。

然后进行蛋白的纯化和分离。

通过离心、过滤、层析等方法，将目标蛋白从混合物中分离出来，得到较纯的蛋白样品。

这一步需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等。

最后是对纯化后的蛋白进行检测和分析。

使用SDS-PAGE凝胶电
泳、Western blotting等方法对纯化后的蛋白进行检测和鉴定，确
保蛋白的纯度和活性。

通过以上步骤，可以得到较为纯净和活性较高的大肠杆菌蛋白
样品。

这种方法不仅适用于纯化大肠杆菌蛋白，也可以根据具体情
况进行相应的改进和优化，以满足不同实验的需求。

总之，纯化大肠杆菌的方法是一个复杂而又重要的过程，需要
仔细操作和科学设计。

只有通过严格的实验操作和精准的技术手段，才能得到理想的纯化效果。

希望本文介绍的方法对您有所帮助，谢
谢阅读。

重组人抗血栓蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达及纯化龚志飞;杨翔;颜法宝;陈强;孙小强;华子春【摘要】旨在优化重组人抗血栓蛋白(rHAP)工程菌的自诱导培养基,以提高菌体产量及可溶性的重组rHAP蛋白含量.选取蛋白胨、酵母提取物、甘油、葡萄糖为因素,各取4个水平,采用正交表L16(45)进行试验设计,时影响菌体生长和可溶性rHAP表达水平的乳糖浓度进行了优化.结果表明自诱导培养基碳氮源的最优配比:2％蛋白胨,1.5％酵母,0.5％甘油,0.03％葡萄糖,0.2％乳糖.此时表达菌密度OD600和可溶性rHAP目标蛋白表达量分别是未优化前的2.04倍和2.85倍.在20 L发酵表达时,rHAP工程菌OD600值高迭93,菌体温量为1 620 g/20L.利用Q-Sepharose和SP-Sepharose纯化,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】7页(P192-198)【关键词】抗血栓蛋白;优化培养;发酵;纯化;鉴定【作者】龚志飞;杨翔;颜法宝;陈强;孙小强;华子春【作者单位】常州大学石油化工学院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州靶标生物医药研究所有限公司,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164;常州大学石油化工学院,常州213164;南京大学常州高新技术研究院,常州213164【正文语种】中文重组人抗血栓蛋白（rHAP）[1]正是利用蛋白质工程和基因工程技术，将人胎盘抗凝蛋白与水蛭素C端结构域结合在一起的一种新的抗凝蛋白，分子量大小约为38 kD。

初步研究表明，重组人胎盘抗凝蛋白变体保留了Annexin V和血小板结合的性质，同时又具有明显的凝血酶抑制活性，而且其凝血酶抑制活性具有明显的剂量依赖关系[2]。

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达陈光;吴铭;王刚;孙旸【摘要】目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发酵条件,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化分析.结果:菌株在37℃、接种量为2%、摇瓶培养约2.5h后,加入终浓度为0.5mmol· L-1的IPTG,37℃诱导5h,收获的蛋白产量最高为31.52 mg· L-1,Western blotting分析该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力.结论:优化工程菌高效表达重组人胶原蛋白,纯化重组蛋白.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P656-660)【关键词】重组胶原蛋白肽;重组蛋白纯化;大肠杆菌【作者】陈光;吴铭;王刚;孙旸【作者单位】吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q78胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分[1]。

由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。

目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的开发[2]。

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1.仪器与材料：-80。

觥箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5; 50ml离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4仙心15min,弃上活。

2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS或50mM Tris-HCl （选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬:菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF 和EDTA（带His标签不加），PMSF终浓度为100 g/ml, EDTA的终浓度为。

取20 匝悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2超声波处理（对超声波及热敏感的蛋白慎用）2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液pH>8.0,加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。

直至菌体溶液变活澈为止，大约花费时间。

2.2.2取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上活和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。

（4）可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

超声破碎细胞问题汇总2008年12月11日星期四 15:31大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。

细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以.在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。

？1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。

探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。

功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。

2*破3S停10S，破个二三十次看看。

3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。

另外可以从菌浓度方面考虑。

在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%.4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。

使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜．超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。

大肠杆菌裂解液澄清方案
1. 澄清方法，一般来说，大肠杆菌裂解液中含有大量的蛋白质、DNA和RNA等杂质，需要通过离心、过滤、超声波处理、添加混凝
剂等方法来去除这些杂质，从而使裂解液变得清澈透明。

2. 离心，通过高速离心可以沉淀大部分的细胞碎片和蛋白质等
杂质，得到相对清澈的上清液。

3. 过滤，使用微孔滤膜对裂解液进行过滤，可以去除较小的杂
质颗粒，使液体更加清澈。

4. 超声波处理，超声波可以破坏细胞碎片的结构，有助于杂质
的去除，同时可以提高澄清效果。

5. 混凝剂，添加适量的混凝剂如聚乙烯吡咯烷酮（PEI）或聚
丙烯酰胺（PAM）等可以促使蛋白质凝聚沉淀，有助于澄清。

6. 应用领域，裂解液澄清后可用于后续的蛋白质纯化、酶活性
测定、蛋白质组学研究等领域。

总的来说，大肠杆菌裂解液澄清方案是一个涉及到多种技术手
段的过程，需要根据具体的实验目的和条件选择合适的方法来去除
杂质，从而得到清澈透明的裂解液。

这样的处理可以提高后续实验
的准确性和可重复性，对于生物制药和生物技术研究具有重要意义。

板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。

）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。

常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。

因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。

我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。

二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。

我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。

至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。

我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。

看着没问题，实际上是有毛病的。

关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。

缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。

那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。

我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。

三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。

我要说都是文章的作者在忽悠。

不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。

且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。

在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。

重组人胶原蛋白肽的表达及纯化工艺的优化摘要:将重组大肠杆菌pC6-BL21活化后,用IPTG诱导表达,探讨了大肠杆菌中重组胶原蛋白肽的最佳表达及纯化条件｡结果表明,菌株在37 ℃,接种量为2%,摇瓶培养3.0 h后,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,30 ℃诱导5.0 h,收获的蛋白产量最高,经Ni-NTA柱亲和层析纯化,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白,Western blotting分析显示该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力｡关键词:重组人胶原蛋白肽;纯化;表达Optimization of Expression and Purification Procedure of Recombinant Human Collagen PeptideAbstract: To optimize the fermentation and purification conditions of recombinant human collagen peptide(CP6) in E. coli pC6-BL21, the temperature, opportunity and time for induction as well as inducer concentration for CP6 expression in recombinant E. coli was optimized. The optimal induction and expression conditions were as follows, after inoculating at an amount of 2%, the bacteria were fermented for 3.0 h at 37 ℃; then 0.5 mmol/L IPTG was added as inducer; and the peptide was expressed under 30 ℃for 5.0 h. After fermented under the optimal conditions, the lysate of bacteria was purified by nickel ion affinity; and purity of target protein was determined by SDS-PAGE. Results showed that pure protein could be obtained if eluted by 150 mmol/L imidazole buffer after being purified, and western blotting showed that the expressed protein could specifically bind with human monoclonal antibody COL6A2.Key words: recombinant human collagen peptide; expression; purification胶原蛋白是一类广泛分布于动物结缔组织的蛋白质[1],对维护机体的正常生理功能和损伤修复有重要作用｡目前胶原蛋白的生产主要是用酸､碱水解法从动物结缔组织提取,提取过程中会或多或少地丧失胶原蛋白的生物活性,应用于人体时还可能会产生排异反应,且存在着极大的病毒隐患[2,3]｡鉴于胶原蛋白有广阔的应用前景,特别是医用材料､保健品领域迫切需要大量优质的胶原蛋白,寻找新的安全可靠的手段制备胶原蛋白十分重要,利用基因工程手段重组表达人胶原蛋白成为研究热点[4-6]｡本实验以LB培养基为基础,采用单因素实验对重组人胶原蛋白在大肠杆菌中诱导表达的一系列条件,如接种量､诱导时机､诱导物浓度､诱导温度和表达时间等进行了优化[7],并对所得的胶原蛋白进行了纯化和鉴定,为进一步研究发酵工艺提供了实验基础｡1材料与方法1.1材料和试剂实验菌种为重组大肠杆菌pC6-BL21(DE3),由吉林农业大学生物物理实验室构建并保存｡质粒提取试剂盒､胶回收试剂盒､IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)､蛋白胨(OXOID)､酵母提取物(Yeast extract,YE)均购自北京鼎国生物工程有限公司;Ni-NTA His·Bind树脂和Ni-NTA缓冲液试剂盒均购自MERCK公司,其他试剂和药品均为国产分析纯｡1.2表达条件的优化挑取一环-80 ℃､25%甘油保存的工程菌,接种于LB固体培养基中,37 ℃培养24 h,然后挑单菌落于100 mL LB液体培养基中,37 ℃,200 r/min振荡培养过夜,以活化菌种｡活化后按不同接种量､诱导时机､诱导物IPTG浓度､诱导温度和表达时间设置单因素实验,诱导胶原蛋白的表达,单因素实验每个处理设置3个重复｡①接种量:设置1%､2%､3%､4%､5% 5个接种量水平,将活化的菌种接种到含有50 mL LB培养基的250 mL的三角烧瓶中,37 ℃､200 r/min振荡培养4.0 h至OD600为0.7时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,37 ℃发酵培养4.0 h;②诱导时机:将过夜活化的种子液按2%的接种量接种于50 mL LB培养基中,37 ℃,200 r/min分别培养1.0､1.5､2.0､2.5､3.0､3.5､4.0 h后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导,37 ℃发酵培养4.0 h;③IPTG浓度:活化的菌种接种后在37 ℃培养2.5 h后加入IPTG至终浓度分别为0.1､0.3､0.5､0.7､1.0 mmol/L,分别诱导培养5.0 h;④诱导温度:按最佳接种量和最佳诱导物浓度,在不同的诱导温度下(28､30､33､37 ℃)诱导胶原蛋白的表达,确定最佳诱导温度;⑤表达时间:使用①~④所得的实验条件,分别在菌种诱导表达后2.0､3.0､4.0､5.0､6.0､7.0 h取样,以确定最佳表达时间长度｡1.3重组蛋白含量的测定①细胞密度测定:发酵液经稀释1~10倍后,用可见分光光度计在600 nm处测其光吸收值｡②重组蛋白含量的测定:工程菌发酵结束后,取50 mL经诱导的摇瓶培养发酵液,10 000 r/min离心1 min,用0.5 mL pH值为7.4､50 mmol/L的Tris-HCl 缓冲液洗涤沉淀,吸净上清液｡用1~5 μL的蒸馏水重悬菌体,并立即加入等量的2×SDS聚丙烯酰胺凝胶加样缓冲液,混匀后,沸水浴5 min｡吸取裂解后的样品液作聚丙烯酰胺凝胶电泳,考马斯亮蓝染色测定菌体总蛋白后,采用Bandscan软件扫描SDS-PAGE电泳图,分析出每条泳道重组蛋白占菌体总蛋白的百分含量并计算出重组蛋白含量｡1.4表达产物的分离纯化菌体经超声破碎后离心,上清经Ni-NTA柱亲和层析,用10倍体积20 mmol/L Tris-HCl(含0.3 mol/L NaCl,pH 8.0)平衡柱体,然后分别用60､100､120､150 mmol/L 的咪唑缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱,收集各个洗脱峰,SDS-PAGE分析收集的成分｡1.5重组蛋白的Western blotting鉴定将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE,转印至醋酸纤维素膜上,然后将膜在含5%的PBS中室温封闭2.0 h,洗膜后加入小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体(1∶2 000稀释)在4 ℃放置2.0 h,洗膜后再加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000稀释)在4 ℃放置2.0 h,充分漂洗后加入化学发光底物Super Signal检测试剂,暗室X光片暗匣曝光､显影｡2结果与分析2.1接种量的优化从图1可以看出,菌体的生物量随着接种量的增加而提高,而重组蛋白产量在接种量为2%时最高,继续增大接种量,其产量反而下降｡这可能是由于接种量增加导致菌体生长过快过稠,造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵产蛋白[8]｡考虑到在大规模发酵过程中,接种量过小会导致菌体增殖缓慢,而接种量过大对菌体生长和酶转化得率会产生一定抑制作用,确定2%为最佳接种量｡2.2IPTG诱导时机的优化诱导时机对目的蛋白表达效果的影响比较大(图2),培养3.0 h后,即对数生长中后期再添加诱导剂,蛋白的表达量最高｡过早添加诱导剂会抑制菌体的增殖,导致生物量减少,在培养时间内获得的表达量也就低;过晚添加诱导剂,菌体已处于生长稳定期,培养基内营养成分减少,细胞代谢速度减缓,合成蛋白的能力降低,表达量也会减少｡因此选择在对数生长中后期即培养3.0 h后加入诱导剂｡2.3IPTG诱导浓度的优化如图3所示,不同浓度的IPTG对外源蛋白的表达有一定的影响｡低浓度条件下,随着IPTG的浓度增加,外源蛋白的表达量也增加,在IPTG浓度为0.5 mmol/L时达到最大值,此后随着IPTG浓度的增加表达量反而下降｡由于高浓度的IPTG会对菌体生长造成毒害作用,同时为了节约成本,选择0.5 mmol/L为最适诱导浓度｡2.4诱导温度的优化过低或过高的温度都会使菌体代谢缓慢,不利于外源基因的表达[9]｡实验结果(图4)表明,随着温度升高,收获的菌体生物量先升后降,在30 ℃时菌体生物量最高｡而重组蛋白的表达随着温度的升高而加强,在37 ℃时最高,因此选择37 ℃为最佳诱导温度｡2.5表达时间的优化如图5所示,诱导5.0 h时蛋白表达量和生物量均达到最大值｡继续诱导,生物量和表达量均下降｡收集时间过早,蛋白的表达还不充分,收集时间过迟则可能导致细胞老化,自溶,发酵液中杂蛋白多,不利于纯化,综合考虑确定最佳诱导时间为5.0 h｡2.6目的蛋白的分离纯化大量诱导表达融合蛋白,经超声破碎､离心后,收集上清液,经Ni-NTA柱亲和层析提纯重组蛋白,用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白,150 mmol/L咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白｡SDS-PAGE检测见图6,重组蛋白相对分子质量约为46 ku,与预期相符｡2.7重组蛋白的Western blotting鉴定Western blotting(图7)分析显示,1号泳道空白对照无特异性反应条带,而2号泳道中纯化产物与小鼠抗人COL6A2的单克隆抗体有特异性反应｡3结论本实验研究了不同的培养条件对重组蛋白表达的影响,结果表明接种量对重组蛋白表达影响较大,当接种量过大时,会直接影响菌体生长状态,从而抑制重组蛋白的表达;ITPG有毒性,培养基中IPTG浓度过低会使诱导力度不够,蛋白表达少,过高则可能会影响菌体生长;诱导时机和诱导后的培养时间都对目的蛋白的产量有重要的影响｡确定了重组蛋白表达的最佳培养条件:接种量为2%,培养3.0 h后添加终浓度为0.5 mmol/L的ITPG,37 ℃下诱导表达5.0 h,表达的重组蛋白含量最高｡本研究使用重组质粒pET22b-CP6转化的大肠杆菌pC6-BL21(DE3),经IPTG 诱导表达,得到可溶性重组蛋白,经Ni-NTA柱亲和层析纯化获得重组蛋白,方法简单易行｡本实验的结果为进一步在发酵罐内进行分批发酵和补料发酵提供了参考｡参考文献:[1] 蒋挺大,张春萍. 胶原蛋白[M]. 北京:化学工业出版社,2001.[2] TOMITA M, MUNETSUNA H, SATO T, et al. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons[J]. Nat Biotechnol,2002,21(1):52-56.[3] RUGGIERO F, EXPOSITO J Y, BOURNAT P, et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants[J]. FEBs Letters,2000,469(1): 132-136.[4] 杨立霞,修建新,朱欣杰,等. 重组生产胶原蛋白的研究进展[J]. 河北化工,2007,30(007):43-46.[5] LUO Y E,FAN D D,MA X X,et al. Process control for production of human-like collagen in fed-batch Escherichia coli BL21[J]. Chin J Chem Eng,2005,13(2):276-279.[6] 范代娣. 一种类人胶原蛋白及其生产方法[P]. 中国专利:ZL01 1067578,2005-04-13.[7] 沈宝明,谭新球,谭周进,等. 影响工程菌株目的基因表达的因素[J]. 生物技术通报,2010(3):6-12.[8] 戎晶晶,刁振宇,周国华. 大肠杆菌表达系统的研究进展[J].药物生物技术,2005,12(6):416-420.[9] MICHAEL J W, MARIA P, SHAWNR R C, et al. Stabilization of apoglobin by low temperature increases yield of soluble recombinant hemoglobin in Escherichia coli[J]. Applied and Environment Microbiology, 1997,63(11):4313-4320.。

第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。

⼤肠杆菌蛋⽩表达体系的构建实验报告⼤肠杆菌蛋⽩表达系统的构建与蛋⽩质的分离纯化●实验⽬的：1.学会氯化钙制备⼤肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作⽅法2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋⽩，掌握蛋⽩质诱导表达的原理，学习蛋⽩质诱导表达的⽅法3. 学会使⽤镍柱分离纯化蛋⽩质，利⽤PEPC试剂盒测定PEPC的活⼒。

●实验原理：1. 钙转法：Ca2+能与加⼊的DNA分⼦结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表⾯上。

当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发⽣剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分⼦提供了进⼊细胞的通道。

2. 诱导BL21(DE3)表达蛋⽩质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的⼀种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI 基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋⽩与lac操纵基因结合，从⽽不能进⾏外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常⽣长。

IPTG 为乳糖类似物，不能被细胞利⽤，可以特异结合阻遏蛋⽩，阻遏蛋⽩不能与操纵基因结合，则外源基因⼤量转录并⾼效表达。

3. 六聚组氨酸纯化蛋⽩的原理：亲和层析是⼀种通过⽣物分⼦之间的特异性的相互作⽤来分离物质的层析⽅法。

组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有⼀个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电⼦，对于带正电的化学物质有静电引⼒，亲和层析是利⽤这个原理来进⾏吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离⼦（⼀般是镍离⼦）带正电对组氨酸有亲和作⽤。

组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且⽆免疫原性,对蛋⽩质的分泌,折叠,功能基本上⽆影响.能⾼度亲和镍离⼦,⽤于蛋⽩质的亲和纯化.4. ⽬标蛋⽩：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.酸羧化酶的催化下，草酰⼄酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和⼆氧化碳。

[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。

大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。

但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。

包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。

但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。

现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。

第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。

包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。

包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。

有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。

超声波破碎仪在破碎大肠杆菌时的技巧
破碎大肠杆菌用于提取表达外源蛋白，在使用超声波破碎仪之前，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后再破碎效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。

细菌沉淀直接加样品1 buffer，再加5μl的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。

在表达重组蛋白后用超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s 停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率， pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。

1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。

超声波破碎仪探头一定要接近底部，约1cm（推荐是距底部0.5mm）。

功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。

2*破3s停10s，破碎20-30个循环观察效果。

3*探头位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。

另外可以从菌浓度方面考虑。

在使用超声波破碎时试着加大体积,振幅最好不要超过60%.
4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，通常方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

如果换用Branson超声波破碎仪来进行工作，由于热耗较小，停顿周期可适当减小。

⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化8.⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化⼤肠杆菌表达系统遗传背景清楚，⽬的基因表达⽔平⾼，培养周期短，抗污染能⼒强等特点, 是分⼦⽣物学研究和⽣物技术产业化发展进程中的重要⼯具。

因此熟练掌握并运⽤⼤肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每⼀个研究⽣来说是⾮常必要的。

本章节介绍了实验室常⽤的⼤肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利⽤⼤肠杆菌表达系统纯化重组蛋⽩的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

8.1⼤肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动⼦的不同这些载体⼤致可以分为热诱导启动⼦，如λPL，cspA 等和另外⼀类就是⼴泛使⽤的IPTG诱导的启动⼦，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。

根据表达蛋⽩质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。

融合表达是在⽬标蛋⽩的N端或C端添加特殊的序列，以提⾼蛋⽩的可溶性，促进蛋⽩的正确折叠，实现⽬的蛋⽩的快速亲和纯化，或者实现⽬标蛋⽩的表达定位。

常⽤的⽤于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。

其中His-Tag 和GST-Tag 是⽬前使⽤最多的。

His Tag ⼤多数是连续的六个His 融合于⽬标蛋⽩的N端或C端，通过His 与⾦属离⼦：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作⽤⽽实现亲和纯化，其中Ni2+是⽬前使⽤最⼴泛的。

His 标签具有较⼩的分⼦量，融合于⽬标蛋⽩的N端和C端不影响⽬标蛋⽩的活性，因此纯化过程中⼤多不需要去除。

⽬前常使⽤的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。

除了His 标签外，还原性⾕胱⽢肽S-转移酶是另⼀种实验室常⽤的融合标签。

它可以通过还原性⾕胱⽢肽琼脂糖亲和层析⽽快速纯化。