大肠杆菌高效表达重组蛋白策略

两阶段培养法
为了提高质粒稳定性,工程菌培养采 用两阶段培养法: ⑴先使菌体生长至一定密度 ⑵再诱导外源基因的表达
⑴使菌体生长至一定密度 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避 免由于基因表达造成基因不稳定性遗传， 使质粒稳定地遗传。 ⑵诱导外源基因的表达 在获得需要的菌体后，再去阻遏或诱导外源 基因的表达。
5.pH
• pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表 达都有影响，所以应根据工程菌的生长和 代谢情况，对pH进行适当的调节。
• 如重组Lactococcus lactis ctis(pIL252)对生长和质粒稳定性 的最适pH值分别为6.39和6.41。
选择合适的宿主菌
一般情况下，质粒的结构不稳定性可 以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消 除。 宿主菌通常有苏云金芽孢杆菌、根瘤 菌、酒精酵母和大肠杆菌等。 大肠杆菌由于具有生长周期短、方法 简便、价格低廉、表达水平高诸多优点成 为基因工程的首选表达系统。
• 在大肠杆菌表达系统中通常可以选用T7、 PRP、Ptac等强启动子，通过对翻译增强 序列和转录终止序列的改进和优化、实现 外源基因的高效表达。 • 可以按照大肠杆菌系统偏爱的密码子和 mRNA二级结构进行目的基因的设计和合成， 获得外源基因的高效表达。 • 在大肠杆菌表达系统中采用F质粒的ccd毒 素-抗毒素联合系统可在细胞分裂时杀死丢 失质粒的细胞，从而维持高的质粒稳定性。
1. 外源基因的拷贝数
• 一般来说细菌内基因拷贝数增加，基因 的表达产物也增加。外源基因是克隆到 载体上的，因此载体在宿主细胞中的拷 贝数就直接关系到外源基因的拷贝数。 将外源基因克隆到高拷贝数的表达质粒 上，含外源基因的重组表达质粒拷贝数 的增加，必然导致外源基因拷贝数的增 高，这对于外源基因的总体表达水平非 常有用。

大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种常用的重组蛋白表达方法，具有以下特点：
1. 简单易用：大肠杆菌是一种常见的细菌，易于培养和操作。

其表达体系基于质粒介导的转化和表达，具有操作简单、成本低廉的优点。

2. 高表达水平：大肠杆菌表达体系能够实现高表达水平，通常可以达到10-50%的总蛋白含量。

这一特点使其成为生物制药和科学研究领域中最受欢迎的表达体系之一。

3. 多种表达宿主：大肠杆菌表达体系有多种表达宿主，包括
BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。

这些表达宿主具有不同的特点，能够适应不同的表达需求。

4. 可定制化：大肠杆菌表达体系可以通过基因工程技术进行改造，实现蛋白质的定制化表达。

例如，可以通过融合表达标签、选择性培养、调控表达等方式来优化表达效果。

5. 可用于生物制药：大肠杆菌表达体系可以用于制备多种蛋白药物，如重组人胰岛素、干扰素、白介素等。

这些蛋白药物已经被广泛应用于临床治疗和研究领域。

总之，大肠杆菌表达体系是一种快速、高效、可定制化的表达系统，已经成为蛋白质表达和生物制药领域中最常用的表达系统之一。

- 1 -。

在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。

这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。

2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。

可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。

3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。

只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。

4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。

这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。

5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。

使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。

6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。

这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。

7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。

以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。

具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。

Vol.53,No.07. 2019DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展张真汪燕马振刚（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）摘要大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。

通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。

然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。

文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。

关键词外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:2095-1205(2019)07-37-04 Advances in Improving the Soluble Expression of EscherichiaColi Recombinant ProteinZhang Zhen Wang Yan Ma Zhengang（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University,Chongqing 401331）Abstract：Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.Key words：exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。

大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。

启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。

2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。

3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。

转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。

转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。

4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。

此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。

5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。

诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。

6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。

可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。

常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。

7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。

确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。

需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。

为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达陈光;吴铭;王刚;孙旸【摘要】目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发酵条件,并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化分析.结果:菌株在37℃、接种量为2%、摇瓶培养约2.5h后,加入终浓度为0.5mmol· L-1的IPTG,37℃诱导5h,收获的蛋白产量最高为31.52 mg· L-1,Western blotting分析该表达产物与人COL6A2单克隆抗体有特异结合能力.结论:优化工程菌高效表达重组人胶原蛋白,纯化重组蛋白.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(037)004【总页数】5页(P656-660)【关键词】重组胶原蛋白肽;重组蛋白纯化;大肠杆菌【作者】陈光;吴铭;王刚;孙旸【作者单位】吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院生物物理实验室,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】Q78胶原蛋白是由动物的成纤维细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，是细胞外基质的主要成分[1]。

由于其特有的生理活性和丰富的营养价值，被广泛地应用于医学、美容、化妆品、食品等领域。

目前胶原蛋白的制备大多采用常规方法，通常以含有结缔组织的屠宰陆生动物废弃物为原料，对其进行酸、碱和酶处理来提取胶原蛋白，但该方法提取的蛋白具有非水溶性、病毒传染性、异体免疫排斥性等缺点，限制了胶原蛋白许多潜在用途的开发[2]。

重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。

而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。

这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。

一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。

选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。

常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。

1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。

其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。

2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。

昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。

3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。

其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。

二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。

常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。

1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。

亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。

常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。

2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。

离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。

mar) 质粒,用无血清和无双抗的DME M 稀释至100μl ;另一支离心管加入10μl Lipofectamine R eag ent (脂质体) ,用无血清和无双抗的DME M 稀释至100μl 。

(2) 将上述DNA 稀释液和lipofectamine 稀释液混合, 室温下放臵40min ,使DNA 和脂质体作用,形成DNA - 脂质体复合物。

(3) 在上述DNA - 脂质体复合物转染液中加入800μl 无血清和无双抗的DMEM ,轻轻混合,将其覆盖在用无血清和无双抗的DME M 洗过的S H - SY5 Y细胞上,将6 孔板臵于37 ℃、5 %C O2 条件下培养4 - 6h 。

(4) 移去原来的转染液, 换新的生长培养基继续培养, 分别于转染后48h 、72h 和96h 在荧光显微镜下检查绿色荧光蛋白的表达情况并拍照。

转染方式如图1 。

2 结果转染后48h 、72h 和96h 在荧光显微镜下观察发现,转染过的细胞均有荧光出现。

在接种细胞密度为3. 0 ×105 cellsΠml 时,绿色荧光的表达比细胞密度为 3. 0 ×106 cellsΠml 时绿色荧光的表达要高,转染72h 的表达量高于转染48h 的表达,但与转染96h 的表达没有明显差别。

而且,在同样的接种密度及转染时间下转染p g fpΠmar 细胞的G FP 的表达要比转染pcmvΠg fp 的细胞表达高。

没有转染的细胞(对照组) 则不表达。

如图2 、3 、4 、5 、6 。

3 讨论自1984 年Mirkov itch 等在研究果蝇组蛋白基因结构时发现MAR 以来的10 年,人们已克隆和分析了多种生物许多基因的MAR 序列,如人的β- 干扰素基因、载脂蛋白B 基因、鸡的溶菌酶基因、卵清蛋白基因和球蛋白基因,兔的免疫球蛋白K 轻链基因、果蝇热休克基因等序列。

鸡α-珠蛋白基因5’端MAR 长1737b p ,含多种转录因子结合位点及大量的A - b ox 和T -b ox ,这些结构均利于基质与MAR 的结合。

c. 启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响
研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的 表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考 虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就 近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大 量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目 的基因的表达效率。
影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素
1.目的基因的特性 2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数 3.宿主的甲醇利用表型 4.分泌信号 5.产物稳定性 6.翻译后修饰
பைடு நூலகம்
b. 翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结 合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是 起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就 是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密 码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和 翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位 于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体 RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。 ５’--AGGAGGUXXXAUG--- mRNA ３’AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
构建表达载体的策略
⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列
的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。 ⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的 基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的 问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后 面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合 蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降 解，最后可以将融合多肽切除。
3. mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译 工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程； 4. 基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强 子序列存在。

大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。

大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。

本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。

大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。

表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。

启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。

参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。

大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。

2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。

3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。

4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。

5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。

6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。

大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。

2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。

3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。

4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。

总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。

大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略精编Document number：WTT-LKK-GBB-08921-EIGG-22986在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略赵军侯云德（病毒基因工程国家重点实验室 100052 北京）本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。

大肠杆菌具有两个显着特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。

尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。

这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA 的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。

但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。

大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。

另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。

如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。

国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。

我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。

有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。

表达载体的基本结构如图1所示[8]。

RBSPR -35 -10 SD codingsequence TT Tet Ori-35 -10Stop codonTTGACA(N)17TATAAT UAAUUGAUAGStart codonmRNA 5' UAAGGAGG(N)8 AUG(91%)16S rRNA 3'HO AUUCCUCC GUG(8%)UUG(1%)启动子(以杂和的tac启动子为例)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。

蛋白质超表达和纯化的技术和策略蛋白质是生命体内最基本的分子之一，具有多种重要的生物学功能，如催化酶、结构支持和细胞信号传递等。

因此，研究蛋白质的超表达和纯化技术，对于生命科学领域的基础研究和应用研究都具有非常重要的意义。

蛋白质超表达技术是指利用外源基因组序列进行组成的表达载体，在细胞中高效表达目标蛋白质的方法。

目前常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。

其中，大肠杆菌是被广泛采用的表达平台，因其生长速度快、易于培养和维护，表达高产量的重组蛋白质的能力极强。

蛋白质超表达的常用策略包括优化启动子、选择表达宿主株和表达载体、优化质粒和诱导条件等。

对于启动子的选择，一般常用的是T7、lac和trc启动子，可以通过在这些启动子中选取合适的序列，提高目标蛋白质的表达量。

表达载体的选择是提高产量的关键之一，一般载体分为表达载体、纯化载体和融合蛋白质表达载体等，选择适合的载体有助于提高表达效率。

此外，质粒特性也是表达效率的关键因素之一，包括质粒的大小、拓扑结构和复制起点等。

在选择宿主菌株时，需要考虑菌株的生长速度、表达能力和纯化难度等因素，同时根据目标蛋白质的特性进行选择。

蛋白质纯化的主要目的是获得高质量、高纯度、高活性的目标蛋白质，以满足各种研究需求。

蛋白质纯化的方法多种多样，可根据蛋白质特性不同，选择适合的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

其中，亲和层析是一种常用的选择性较强的纯化方法，可利用目标蛋白质与亲和分子的特异性结合，实现目标蛋白质的高纯度分离。

离子交换层析则是一种根据蛋白质带电性的分离纯化技术，可做到高效纯化目标蛋白质。

凝胶过滤层析则是一种分子量分离技术，常用于纯化较大分子量的蛋白质。

在进行蛋白质纯化时，需要充分考虑到目标蛋白质可能存在的 probllems，如聚集、不稳定、易降解等，进而采取相应的手段进行解决。

此外，还需考虑到纯化产物的稳定性，一些蛋白质在纯化过程中容易出现变性或损失活性等问题，需要通过添加辅助剂、调整 pH、温度等措施，减少纯化过程中的不良反应，获得高质量的产物。

(1 北京林业大学生物科学与技术学院 2 吉林大学生命科学学院 3 美国康涅狄克大学)
摘要 为了研究在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中重组蛋白的表达特点 ,探讨重组蛋白在大肠杆菌中表达时可溶性蛋白与包 涵体出现的特点 ,从表达载体中表达了植物 ACC 合成酶. 经 SDS2PAGE 电泳与双波长扫描分析 ,确定目的蛋白随表达 时间 、菌液密度的增加而增加. 但是其最佳表达时间为 215 h ,菌液密度 OD600 为 016 ,IPTG的最佳浓度为 016 mmolΠL ,此 时目的蛋白含量占全菌蛋白含量之比最高. 植物 ACC 合成酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 ,未能检测到 可溶性蛋白的表达. 关键词 ACC 合成酶 , SDS2PAGE , 包涵体 中图分类号 Q559 + . 1
责任作者 :蒋湘宁 ,男 ,1958 年生 ,教授. 主要研究方向 :植物分子生物学. Email :jiangxn @bjfu. edu. cn 工作单位 :100083 北京林业大学生 物学院森林生物学实验中心
© 1994-2010 China ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱcademic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
因此可以认为016mmollacc合成酶表达量与iptg浓度的sds2page分析泳道上方的数据为相应iptg浓度诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与细菌密度的sds2page分析011110是菌体密度为011110时诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与iptg浓度关系曲线分别为0100002010020102012014016018110acc合成酶表达量与iptg浓度的关系figuresds2pageod600acc合成酶表达量与细菌密度关系曲线acc合成酶表达量与细菌密度的关系figurebacteriadenisity215包涵体与可溶性蛋白的分析根据图沉淀与上清中都未出现明显的55kd蛋白带5a说明此时sds2page电泳未能检测到目的蛋白的表达012013诱导015od600214诱导表达量与iptg浓度的关系当菌液长到od600016时分别加入iptg37诱导培养收获细菌然后用sds2page分析011012013诱导因此可以认为对于acc合成酶用et载体在大肠杆菌中进行大量表达不会出现明显的可溶性蛋白表达

综 述重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展3郑海洲,刘晓志,宋　欣(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄　050015)摘　要　长期以来,大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统,重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N-端加工。

本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展,目的是为了提高外源蛋白的生物活性。

关键词　大肠杆菌,分泌表达,重组蛋白中图分类号:Q591.2 文献标识码:A 文章编号:100625687(2009)0420040203Advance i n the secretory expressi on of reco m b i n an t prote i n i n escher i ch i a coliZheng Haizhou,L iu Xiaozhi,S ong Xin(NCPC Ne w D rug Research and Devel opment Co.,L td,Shijiazhuang050015)ABSTRACT Escherichia coli is one of the most widely used hosts for the p r oducti on of recombinant p r oteins.Pr oducti on of secre2 t ory p r oteins in escherichia coli p r ovides several advantages over exp ressi on in the cyt op las m.Peri p las m p r ovides the oxidative en2 vir on ment t o facilitate correct disulfide bonding and p r otein folding.It als o all ows correct p r ocessing of N-ter m inal a m ino acid during secreti on.This revie w discusses recent advances in secret ory and extracellular p r oducti on of recombinant p r oteins s o as t oi m p r ove the bi ol ogical activity of the heter ol ogous p r oteins.KE Y WO RD S escherichia coli,secret ory exp ressi on,recombinant p r otein 大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点,是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统[1]。

重组胶原蛋白表达策略胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，在人体中占据着重要的地位。

它主要存在于皮肤、骨骼、血管、肌肉等组织中，具有提供支撑、保护和维持组织结构的功能。

由于其重要性，研究人员对胶原蛋白的表达策略进行了深入研究，希望能够通过重组技术来获得大量高质量的胶原蛋白。

重组胶原蛋白的表达策略主要包括基因工程、细胞培养和生物合成三个方面。

首先是基因工程。

基因工程是指通过改变胶原蛋白基因的DNA序列，使其能够在大肠杆菌等表达宿主中高效表达。

在重组胶原蛋白的基因工程中，研究人员通常选择具有高表达能力的质粒载体，将目标胶原蛋白基因插入到载体中，并转化到宿主细胞中，通过蛋白质合成机制使胶原蛋白得以表达。

此外，还可以通过引入其他的调控元件，如启动子、终止子、增强子等，来进一步提高胶原蛋白的表达水平。

其次是细胞培养。

细胞培养是一种常用的表达胶原蛋白的方法。

研究人员通常选择哺乳动物细胞作为表达宿主，如CHO细胞、HEK293细胞等。

在细胞培养过程中，研究人员需要提供适当的培养基、温度和气体环境等条件，以促进细胞的生长和表达胶原蛋白。

此外，还可以通过细胞工程技术，如基因敲除、基因过表达等手段，来改变细胞的代谢途径和蛋白质合成能力，从而进一步提高胶原蛋白的表达水平。

最后是生物合成。

胶原蛋白的生物合成过程是一个复杂的过程，涉及到多个酶和底物的参与。

研究人员可以通过生物合成技术来模拟胶原蛋白的合成过程，从而获得高质量的重组胶原蛋白。

生物合成的关键是选择适当的底物和酶，以及优化反应条件。

此外，还可以通过改变底物浓度、酶的活性等参数，来控制胶原蛋白的生物合成过程，从而获得所需的胶原蛋白产物。

重组胶原蛋白的表达策略主要包括基因工程、细胞培养和生物合成三个方面。

通过这些策略，研究人员能够获得大量高质量的胶原蛋白，为胶原蛋白的研究和应用提供了重要的工具和基础。

在未来的研究中，我们可以进一步改进这些策略，以提高胶原蛋白的表达效率和产量，从而更好地满足人们对胶原蛋白的需求。

第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。

大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。

本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

大肠杆菌表达系统的选择与构建表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG 诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。

根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。

融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。

常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。

其中His-Tag和GST-Tag 是目前使用最多的。

His Tag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。

His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。

目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。

除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。

它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。

此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。