大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望

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大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望
余波１’２，程安春１，一，汪铭书１，３
（１．动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安６２５０１４；２．贵州省畜牧兽医研究所 贵州贵阳，５５０００５；３．四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心，四川雅安６２５０１４） 中图分类号：￥８５２．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—７０３４（２００８）１０—００１９—０３ 杆菌中的表达形式分为３种，第１种为胞外分泌，即 目的蛋白被分泌到培养基中，这种方式表达的蛋白容 易纯化，不易被细菌蛋白酶裂解，但大肠杆菌在正常 情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外；第２种为 周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周浆间隙 中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在 向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有 可能产生目的蛋白的天然Ｎ末端；第３种为胞内表 达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐 的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。 ２提高重组蛋白可溶性表达的方法
ＴｒｉｔｏｎＸ一１００、乙醇等。由于一些非代谢性糖类如山 梨糖醇、多元醇、蔗糖、甜菜碱的存在会增加培养基 的渗透压，进而可导致细胞质内渗透压防护剂的积 累，如甘氨酰一三甲铵乙内酯能抑制细胞质中重组蛋 白的聚集，从而提高可溶性蛋白的表达水平。 为了增加外膜的通透性，研究者在培养基中添加 了甘氨酸、ＴｒｉｔｏｎＸ一１００，这两种物质均能破坏细胞外 膜的完整性，改变细胞外膜的通透性，且不引起明显 的细菌裂解。唐金宝等人在培养基中添加终浓度为 １％的Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００及１％的甘氨酸，可使ＰｒｏＺＺ— ＥＧＦＰ基因在培养液中的可溶性表达量提高６倍。 另外，杨军兰等人在培养基中加入乙醇，能够抑 制结核分枝杆菌Ｍｒ３８０００蛋白在大肠杆菌表达时的 聚集，促进其正确折卺形成可溶蛋白。由于乙醇是大 肠杆菌热休克反应最强的诱导剂之一，所以它在转录 水平上刺激ＤｎａＫＪ上调，通过诱导ＤｎａＫ和ＤｎａＪ蛋 白的表达促进重组蛋白的可溶性表达。
［１］ＢＡＲＲＹ Ｊ Ｌ，ＪＯＳＥＰＨ
ｅｉｎｅｓ：ｕｎｉｑｕｅ Ｍ
Ｊ，ＬＹＬＥ
Ｋ，ｅｔ
ａ１．Ｐｌａｎｔ—ｂａｓｅｄ
ｖａｃ－
ａｄｖａｎｔａｇｅｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１，１９：２７４２—２７４８．
ＪＧ，ＫＡＮＧＴ Ｊ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ
一个依赖Ａ即的过程帮助蛋白正确折叠。研究发
现，与分子伴侣共表达可提高目的蛋白的可溶性，并 且如将几种分子伴侣同时表达，有可能获得比单独使 用更好的效果。值得一提的是，共表达分子伴侣的选 择应根据重组蛋白自身的特点进行。吴小阳等人将 ＥＲＲＣＣｌ基因与大肠杆菌ＧｒｏＥＬ—ＥＳ进行共表达。 结果表明，ＧｒｏＥＬ—ＥＳ不能改善ＥＲＲＣＣｌ基因在大 肠杆菌中的可溶性。还有一个需要考虑的是培养温 度，温度可能会对共表达分子伴侣的效果产生重要的 影响。Ｈａｎ
《黑龙江畜牧兽医）２００８年第１０期 提取液后又进行了ＥＬＩＳＡ检测，发现血清和粪便中 有大量的抗原特异性ＩｇＧ及ＩｇＡ。值得一提的是，喂 食剂量为５ ｍｇ时所产生的免疫效果要比ｌ ｍｇ好得 多，这充分说明口服植物表达疫苗后所产生的免疫应 答具有一定的剂量依赖性。 ４．４其他猪病疫茵 猪瘟、猪细小病毒病、猪伪狂犬病等均为国内常 见的疾病，每年给养猪业带来巨大的经济损失。国外 有学者报道，将猪瘟病毒的Ｅ２糖蛋白基因分别转化 到莴苣和苜蓿中，给小鼠喂食植株叶片，３０ ｄ后血清 和粪便中的特异性ＩｇＧ和ＩｇＡ开始明显增多；还有学 者用烟草表达猪细小病毒的衣壳蛋白ＶＰ２基因，通 过注射或口服均可使试验动物获得特异性抗体。在 国内，肖少波等∞１用烟草表达猪伪狂犬病毒保护性 抗原ｇＤ基因，并证实了其抗原性。 ５存在的问题 转基因植物的抗原蛋白表达量可达到５％，然而 作为疫苗生产系统来说仍然是较低的水平，因此进一 步提高疫苗的表达量仍然是今后研究的一个重点。 优化表达的方法有许多，在研究出新的表达策略的同
［３］
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时，需要将各种方法有机地结合起来。另外，转基因 植物的食用安全性问题一直是全球争论的焦点，由于 利用转基因植物表达的疫苗不属于转基因食品的范 畴，人们对此必然会产生疑虑甚至排斥。对于利用转 基因植物表达动物疫苗的研究可先行一步，待其形成
成熟、稳定的产业化体系后，再实现在人类疾病预防
方面的应用。已有的研究结果表明，对于猪的各类胃 肠道传染病，率先投放使用的可能性很大。科学家们 也开始着手关于植物表达其他猪疫苗乃至寄生虫疫 苗的研究。相信在不久的将来，利用转基因植物表达 的疫苗会成为防制各类猪疾病的强而有力的工具。 参考文献：
外３个部分。根据表达部位的不同可将蛋白在大肠
２．１选择适合的载体与宿主菌 选用合适的载体与菌株结合可明显提高目的蛋 白可溶部分的比例及活性。研究者通过在载体上融 合一些自身溶解性高的多肽序列（或一些催化二硫 键形成的酶）和把信号肽序列引入表达载体来提高 重组蛋白的溶解性或正确折叠。 重组蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达
２．４
与分子伴侣或折叠酶共表达 分子伴侣是一类能帮助多肽链形成正确三维结
构的蛋白质，它主要通过阻止或校正出现不合理的疏 水结合来帮助肽链的折叠。大肠杆菌的分子伴侣是 由２个类型的蛋白质构成的，分别是６０ ｋｕ的Ｈｓｐ６０ 蛋白和１０ ｋｕ的Ｈｓｐｌ０蛋白，二者都包含疏水区域， 这些区域可与未折叠或错误折叠的多肽链结合，经过
万方数据
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ
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Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
№１ ０
２００８
时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解。因此，选择 蛋白酶缺失的宿主菌非常有利于重组蛋白的表达，尤 其是重组蛋白的可溶性表达，ＢＬ２１（ＤＥ３）是最常用 的表达菌。Ｉｇｎａｔｏｖａ Ｚ等人用ＢＬ２１（ＤＥ３）作为重组 青霉素酰胺酶的表达宿主菌，结果比其他宿主菌的可 溶性表达量高。重组蛋白在细菌细胞质中不能正确 折叠的原因是大肠杆菌的细胞质呈还原环境，不利于 二硫键的形成。针对大肠杆菌的还原环境，研究人员 构建了缺失硫氧还蛋白还原酶基冈的硫氧还蛋白还 原酶缺陷株细菌，降低细胞质还原状态，以利于二硫 键形成。如选用谷胱甘肽还原酶（ｇｏｒ）突变的菌株或 硫氧还蛋白还原酶（ｔｒｘＢ）突变的菌株，将有助于制造 次还原细胞质环境，进而利于二硫键的形成。还有研 究表明，把合成外膜元件的基因突变菌株引到重组蛋 白的表达中，这样既可产生可溶性的具有正确空间结 构的活性蛋白，还可避免细胞壁在重组蛋白跨膜转运 中的阻碍作用。如将Ｌ型细菌（缺少细胞壁和胞周 质）作为青霉素酰基转移酶的表达宿主菌。 ２．２降低童组蛋白合成的速率 蛋白质动力学模型研究表明，活性蛋白的产率取 决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的 速率。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超 过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此，降 低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶 性表达。常用的方法有降低培养温度、选择适当的启 动子、使用较低浓度的诱导剂。降低培养温度有利于 重组蛋白合成速率的降低，因为在低温条件下细菌生 长缓慢，蛋白质合成也相应较慢，新合成的蛋白质会 有更充分的时间折叠。同时降低培养温度也能降低 重组蛋白降解的速率，提高重组蛋白的稳定性。降低 培养温度虽能增加外源蛋白的可溶性，但也有一个下 限，一般为８～１０ ｃｃ，低于此温度，大肠杆菌将停止 生长，蛋白也基本停止表达。 目前，有许多启动子被应用于重组蛋白的表达， 启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导 性及经济因素等方面考虑。在胞内表达中，常采用 ，１７、ＰＬ等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的 １０％一７０％，重组蛋白多以包涵体形式存在。因此， 常采用强度较弱的ｌａｃ等启动子以达到一个与表达 能力相匹配的翻译速率。 ２．３改变培养基成分 培养基的组成对提高大肠杆菌中重组蛋白可溶 性表达有显著影响。首先，保持培养基ｐＨ值的稳定 性对可溶蛋白的表达将产生重要影响，需根据菌体和 重组蛋白的特点选择合适的ｐＨ值。ｐＨ值距重组蛋 白等电点越远，表达的蛋白产物就越不容易形成包涵 体。其次，加入一些化学物质将对重组蛋白的可溶性 表达有很大的提高，如一些非代谢性糖类、甘氨酸、
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源自文库ｂｙ
ａｎｉｍａｌｓ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ ｐｌａｎｔｓ
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ａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３。２１：
４０５２—４０５８．
肖少波，陈焕春，方六荣，等．伪狂犬病毒ｇＤ基因在转基因烟 草中的表达［Ｊ］．中国生物化学与分子生物学报．２００２，１８（４）：
大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的 重组蛋白表达系统。但由于大肠杆菌表达系统所表 达的蛋白常常形成无活性的包涵体，为此研究者摸索 出许多用来提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达 的方法，近年来在提高重组蛋白可溶性表达的策略方 面取得了一定进展，现介绍如下。
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重组蛋白在大肠杆菌中的表达形式 大肠杆菌被内膜和外膜隔开形成胞内、周质和胞
收稿日期：２００７—１０—１７：修回日期：２００７一１２—２０ 基金项目：国家科技攻关重大项目（２００４ＢＡ９０１Ａ０３）ｉ教育部 “新世纪优秀人才支持计划”项目（ＮＣＥＴ一０４一０９０６）；四川 省基础研究项目（０５ＪＹ０２９—１０９，２００６Ｊ１３—０４８）；四川省重点 建设学科项目（ＳＺＤ０４１８） 作者简介：余波（１９８１一），男，硕士． 通讯作者：程安春（１９６５一），男（布依族），教授，博士，博士生 导师；汪铭书（１９６４一），女（苗族），教授，博士，博士生导师．
Ｍ
Ｘ等人将内皮他丁基因与分子伴侣
ＧｒｏＥＬ—ＥＳ或ＤｎａＫ—ＤｎａＪ—ＧｒｐＥ共表达，并在 １６℃条件下培养，结果可溶性蛋白的表达量增加。 ＤｓｂＡ是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与 新生蛋白质折叠过程的催化二硫键形成的折叠酶。 ＤｓｂＡ无论是在体内与目标蛋白融合表达还是在体外 以折叠酶形式添加，都能有效地催化蛋白质的折叠， 同时ＤｓｂＡ还具有部分分子伴侣的活性。真核细胞 的二硫键异构酶（ＰＤＩ）也是一种常用的折叠酶。ＰＤＩ 不仅是催化半胱氨酸氧化、二硫键异构化的高效酶， 而且还具有分子伴侣的活性。 ２．５通过替换氨基酸增加町溶性 蛋白质的一级结构即氨基酸序列，是影响包涵体 形成的一个重要冈素。将蛋白质中的某个或几个氨 基酸进行替换，可抑制包涵体形成，增加表达产物的
万方数据
《黑龙江畜牧兽医）２００８年第１０期
２１
动物麻醉的研究进展
胡崇伟，于
枫，李
静，刘晓刚，付彦涛，高
利
（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０） 中图分类号：￥８５７．１２＋４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—７０３４（２００８）１０—００２１—０２ 的安全性更高、苏醒更快，成为新一代吸人麻醉药的 代表。 １．２静脉麻醉 １８７２年，Ｇｒｅ曾用水合氯醛静脉注射作全身麻 醉；１９０３年，Ｆｉｓｃｈｅｒ和Ｍｅｆｎｇ合成巴比妥；１９０９年， Ｂｉｅｒ用普鲁卡因作静脉麻醉产生镇痛作用；１９３２年， Ｌｕｎｄｙ报道用硫喷妥钠作静脉麻醉；以后相继出现普 尔安、羟丁酸钠、二甲基苯胺嚷嗪、氯胺酮、乙醚脂、异 丙酚等静脉注射的全身麻醉药。１９０８年，在动物临 床上将水合氯醛应用于马；２０世纪３０年代，又将巴 比妥应用于犬和猫。目前，临床研究得较多的麻醉药 物是氯胺酮、巴比妥类药、ｄ：受体激动剂和阿片受体 类药，并探索出一些较好的麻醉组合，也取得了较满 意的麻醉效果。 １．３复合麻醉 复合麻醉是指同时或先后应用两种或两种以上 的麻醉药物、麻醉方法及麻醉疗法的临床麻醉技术， 以达到满意的术中及术后镇痛效果，为外科手术创造 良好的条件，确保病人或动物的安全和术后的顺利康 复。其优点在于：麻醉用药剂量减少；减少药物的不 良反应；满足手术操作的要求；将麻醉对机体的不良 反应降至最低程度；提供完善的术后镇痛。 复合麻醉可分为吸人复合麻醉、静脉复合麻醉、