大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望

Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化摘要：Nanog蛋白能够维持胚胎干细胞的自我更新与多能性，是关键的转录因子。

目前Nanog蛋白的体外生产形式主要通过微生物进行异源表达，为了能够高效制备可溶性的人源Nanog蛋白，降低Nanog蛋白的应用成本，本研究通过分子克隆技术构建重组大肠杆菌，通过IPTG诱导来进行可溶性的融合表达。

关键词：Nanog;原核表达;蛋白质纯化;发酵优化Nanog蛋白于2003年被发现，一直以来主要通过动物细胞分离提取获得，这种获取方式的缺点在于过程过于繁琐且产率较低。

现阶段已经成功通过大肠杆菌实现了小鼠来源的Nanog蛋白表达，但其产物是包涵体。

通过大肠杆菌实现的人源Nanog假基因的蛋白原核表达，产物也是包涵体。

虽然目前市面上已经有人源Nanog蛋白销售，但并没有人源Nanog蛋白表达的相关研究报道，而且人源Nanog蛋白的售价十分昂贵，为了降低其应用成本和促进医学实验研究，便于后期大量制备Nanog多克隆抗体，本次研究通过pET32a-Nanog构建重组质粒转入到大肠杆菌中，实现人源Nanog蛋白和硫氧还蛋白的可溶性容和表达，最终通过肠激酶酶切后得到人源Nanog蛋白，通过摇瓶来对诱导温度、诱导剂含量以及补料碳源进行优化，在15L的发酵罐上进行补料发酵的分批考察，对不同的温度控制和溶氧水平对菌体产蛋白的影响进行观察，为后期大规模制备人源Nanog蛋白和多克隆抗体打下良好基础。

1、材料与方法1.1实验材料1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌、载体和均为本实验室保存。

1.1.2 试剂与培养基（1）种子培养基：胰蛋白胨、酵母提取物均在温度下进行的灭菌处理。

（2）斜面保藏培养基：胰蛋白胨酵母提取物、琼脂均在温度下进行的灭菌处理。

（3）发酵培养基：葡萄糖蛋白胨酵母粉5g/L，均在温度下进行的灭菌处理。

（4）补料培养基：的甘油溶液。

（5）试剂：加拿大产聚合酶、限制性内切酶；国产酵母膏、胰蛋白胨、质粒小量提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒；国产氨苄霉素、免抗Nanog多克隆抗体及羊抗兔的二抗、核糖核酸酶。

蛋白质表达和重组技术的研究进展近年来，随着生物技术的快速发展，蛋白质表达和重组技术在生命科学领域逐渐成为研究的热点。

蛋白质是生命体系中至关重要的分子，具有多种生物学功能。

研究蛋白质的表达和重组技术，对于深入了解蛋白质的结构和功能，以及开发新的药物和治疗方案具有重要意义。

本文将探讨蛋白质表达和重组技术的研究进展。

一、蛋白质表达技术1.1 原核表达系统原核表达系统是最简单直接的表达蛋白质的方式，其依赖于大肠杆菌等细菌对异源蛋白质的转录和翻译。

然而，原核表达系统存在缺点，如对毒性蛋白质的表达效率低、容易出现蛋白质降解和无法产生复杂的多肽等。

这些限制问题在一定程度上阻碍了蛋白质表达的广泛应用。

1.2 真核表达系统真核表达系统来源于真核生物细胞对RNA翻译的机制，包括CHO、293、HeLa等细胞。

真核表达系统不仅能够处理复杂的蛋白质结构，还可以避免对细菌产生的内毒素的依赖，提高表达效率。

但是，真核表达系统明显比原核表达系统更昂贵，并需要更多的时间和精力。

1.3 内含子释放策略内含子释放策略是实现高效蛋白质表达的新方法之一，它允许对特定蛋白质编码基因中的内含子进行剪切，以提高转录效率。

这种方法在真核表达系统中使用，可以在多种细胞系中表达高效的蛋白质。

二、蛋白质重组技术2.1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是最广泛使用的重组蛋白质表达系统之一。

该系统具有简单高效、价格低廉、容易操作和产量高等优点。

大肠杆菌表达系统借助贝塞尔表达和双重放大策略，可实现大量的蛋白质表达。

此外，大肠杆菌表达系统还可以通过调整分子量，实现对蛋白质结构和活性的改变，使得其在生物学和医学实验中被广泛应用。

2.2 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统即利用昆虫细胞（浮游细胞或培养细胞）作为重组蛋白质的宿主。

昆虫细胞表达系统具有产量高、保真度高等优点，而且方法简单，易于进行大规模生产。

不过，昆虫细胞表达系统的缺点是成本较高，而且目前开发出的细胞系较为有限。

大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战毫无疑问，重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。

以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。

对于每个研究者来说，如果他要开始一个项目，需要某种纯化的蛋白。

他马上就会想到，怎样通过重组表达的方式获得这种蛋白。

目的重组蛋白的大量表达使人们能够对其生物化学性质进行分析，将其应用于工业并发展成为商业化产品。

从理论上来讲，获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因，克隆到表达载体，转入表达宿主，诱导，纯化。

然而，实际上，事情通常并不是这样。

宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至无法获得任何蛋白，这些都是实验中会遇到的问题。

在过去，有许多综述详细地介绍了这个课题。

综合来说，这些论文收集了2000多个例子。

然而在重组蛋白表达纯化领域，一直都在进步着。

因此，在本综述中，我们对本领域最近取得的进展做了评述。

同时，对于那些那些对异源表达还不大熟练的研究人员，我们通过回答项目开始就需要解决的问题，提供的许多选择和方法，。

这些选择和方法，在过去的几十年里，曾被成功的用来表达一系列的蛋白。

问题一：选择哪种生物体作为表达宿主？整个过程的开始就是要选择宿主细胞，利用它的蛋白合成机制来获得珍贵的蛋白。

宿主的选择决定了我们以后所需要的技术，包括各种分子工具，仪器或者试剂。

在这些微生物体中，现有的宿主系统包括细菌，酵母，filamentous fungi, 和 unicellular algae。

他们各有优点和缺点，宿主的选择可能取决于我们要表达的蛋白。

例如，如果目的蛋白需要翻译后的修饰，那么我们就要选择真核表达系统。

在本篇综述里，我们主要详细介绍大肠杆菌表达系统。

众所周知，利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。

1.它有无可比拟的快速生长机制，在glucose-salts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。

Vol.53,No.07. 2019DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展张真汪燕马振刚（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）摘要大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。

通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。

然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。

文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。

关键词外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:2095-1205(2019)07-37-04 Advances in Improving the Soluble Expression of EscherichiaColi Recombinant ProteinZhang Zhen Wang Yan Ma Zhengang（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University,Chongqing 401331）Abstract：Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.Key words：exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。

大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展随着生物技术的不断发展和进步，外源性蛋白表达在医药、工业和生物制品等领域中扮演着越来越重要的角色。

然而，对于外源性蛋白表达的技术瓶颈和提高表达效率的研究，已成为了当前生物技术的热点领域之一。

而大肠杆菌作为一种广泛应用于分子生物学领域的微生物，也成为了外源性蛋白表达的研究热点之一。

本文将就大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展展开论述。

第一部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的特点外源性蛋白表达主要分为原核和真核系统两类。

而大肠杆菌则被广泛应用于原核系统中。

大肠杆菌在外源性蛋白表达方面的突出特点是其具有较高的表达效率和易于操作。

其表达的蛋白质具有良好的纯度和活性。

而在表达的技术方面，大肠杆菌可以利用各种载体进行转化。

同时，其遗传背景较为简单，为碱基序列仅为4.6MB的圆形染色体。

这一特点促使大肠杆菌成为了外源性蛋白表达的优选菌株。

第二部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的常用载体常用载体主要包括pUC、pET和pBAD等。

其中pUC是一种常用的负责编码外源性蛋白质的表达载体，具有高效、快速、经济等特点。

同时，pUC载体可用于亚克隆、磷酸化和DNA序列分析等相关实验。

而外源性蛋白表达的pET系列载体采用T7启动子进行表达，可以具有高效率的表达效果，还可以对靶向蛋白进行不同形式的标记，以便于在纯化时分别使用。

此外，pBAD载体也是一种经典且有效的大肠杆菌表达载体，该载体可以通过调节l-arabinose的浓度来调节目标基因的表达量。

在新型载体的研发中，通过人工合成的方法合成的RNA表达系统在蛋白表达方面也可以取得显著的进展。

第三部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的最新技术1. 合成生物学的应用：近年来合成生物学在外源性蛋白表达中的应用越来越受到重视。

这项技术通过重新设计和合成生物学的元件，再结合基因表达网络及传递过程等，从而改变微生物代谢的路线，进而提高微生物的表达效率及生产能力。

万方数据　万方数据　万方数据雷荣悦等：重组人ＢＭＰ６在大肠杆菌中可溶表达、纯化及活性分析４５５约占菌体总蛋白的８０％，但也是以包涵体形式存在。

改变诱导的时间和温度条件对于所诱导的目的蛋白的可溶性和产量没有什么变化（图１）。

图１ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析０．１ｍｍｏｌ，Ｉ。

ＩＰＴＧ２０。

Ｃ条件下ｐＥＴ－１５ｂ·ＢＭＰ６、ｐＥＴ－３２ａ－ＢＭＰ６转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）表达蛋白的溶解性Ｆｉｇ．１ＳＤＳ－Ｐ：ＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｏｌｕｂｌｅａｎｄｉｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｐＥＴ－１５ｂ·ＢＭＰ６．ｐＥＴ－３２ａ．ＢＭＰ６ｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＥＣＯｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｗｉｔｈ０．１ｍｍｏＩ，ＬＩＰＴＧａｔ２０。

ＣＢＭＰ６融合蛋白含量不高，我们将ｐＭＡＬ—ｅ２Ｘ．ＢＭＰ６转化ＴＢｌ，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳结果看到与未诱导菌比较，在分子量约５７ｋＤ处出现一条明显的诱导蛋白带。

同预期ＭＢＰ—ＢＭＰ６融合蛋白大小一致。

电泳胶薄层扫描显示所表达的新蛋白约占菌体总蛋白３０％，大部分ＭＢＰ—ＢＭＰ６融合蛋白存在于上清中（图４）。

ｐＭＡＬ－ｐ２Ｘ—ＢＭＰ６转化ＥｃＤｌｉＴＢｌ分别在图３ｓＤｓ—ＰＡＧＥ分析ｐＭＡＬ‘ｐ２≥。

ＢＭＰ６表达融合蛋白２０。

＆３７。

ＣＴ，不同浓度的ＩＰＴＧ诱导表达。

由图Ｆｉｇ．３Ａｎａｌ蛐：盎嚣嚣然麓ｒｏｔ。

ｉｎｅｘｐｒｅｓ。

ｉｏｎ看到，在其它条件一定的情况下２０。

Ｃ诱导表达的ｆｒｏｍｔｈｅｐＭＡＬ－ｐ２Ｘ－ＢＭＰ６ｕｓｉｎｇＳＤＳ－－ＰＡＧＥ目标蛋白比３７。

Ｃ条件下多；融合蛋白量并不随兰篡鬈篇嚣篡：：：罢锍品筛善：：：篇．曼篇盛三ＩＰＴＧ浓度的增大而增多，０．３ｍｍｏｌ／Ｌ时诱导量就达２旷ｃ３“ｎ８０，ｂｌｃｌ竺粤。

壁ｍ。

曼ｃ？“６ｒｏ粤“誓ｔｈ８０ｎｊｃ撕ｏｎ；到最大（图２，ｌａｎｅ４）。

电泳胶薄层扫描显示融合蛋白约占菌体总蛋白５％。

综 述重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展3郑海洲,刘晓志,宋　欣(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄　050015)摘　要　长期以来,大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统,重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N-端加工。

本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展,目的是为了提高外源蛋白的生物活性。

关键词　大肠杆菌,分泌表达,重组蛋白中图分类号:Q591.2 文献标识码:A 文章编号:100625687(2009)0420040203Advance i n the secretory expressi on of reco m b i n an t prote i n i n escher i ch i a coliZheng Haizhou,L iu Xiaozhi,S ong Xin(NCPC Ne w D rug Research and Devel opment Co.,L td,Shijiazhuang050015)ABSTRACT Escherichia coli is one of the most widely used hosts for the p r oducti on of recombinant p r oteins.Pr oducti on of secre2 t ory p r oteins in escherichia coli p r ovides several advantages over exp ressi on in the cyt op las m.Peri p las m p r ovides the oxidative en2 vir on ment t o facilitate correct disulfide bonding and p r otein folding.It als o all ows correct p r ocessing of N-ter m inal a m ino acid during secreti on.This revie w discusses recent advances in secret ory and extracellular p r oducti on of recombinant p r oteins s o as t oi m p r ove the bi ol ogical activity of the heter ol ogous p r oteins.KE Y WO RD S escherichia coli,secret ory exp ressi on,recombinant p r otein 大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点,是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统[1]。

重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。

其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。

本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。

一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。

由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。

二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。

该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。

但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。

2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。

在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。

其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。

三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。

该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。

在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。

2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。

其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。

四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。