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蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。
注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
名词解释蛋白质的复性蛋白质的复性：现象与意义在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。
复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。
本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。
1. 蛋白质的复性现象复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。
在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。
蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。
在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。
这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。
2. 蛋白质的复性机制复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。
解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。
这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。
折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。
折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。
此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。
在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。
这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。
3. 蛋白质复性的意义蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。
在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。
此外，蛋白质复性还与许多重要的生物过程密切相关。
例如，蛋白质折叠失常与多种神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病相关。
了解复性过程可以帮助我们深入了解这些疾病的发生机制，并为研发相关的治疗方法提供新的思路。
另外，蛋白质复性也对生物技术领域具有重要意义。
色谱法使蛋白质复性的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白前期准备
(1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点,标签等注意点。
(２）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理. （３）透析Buffer得选择可参考文献。
蛋白复性
包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子,它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性得结构称为包涵体（Iｎclｕsiｏn Bｏｄｉes，ＩB)。
在Ｅ、coｌi中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体.
包涵体得处理一般包括这么几步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中,那么通常有两个选择可以考虑：（1)退一步,优化表达条件；(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性.这里主要考虑第二种方案。
包涵体得洗涤
破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量得减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目得物质得提取。
洗涤Bufｆeｒ:50mM Tｒiｓ-HＣl（pH8、0）,2mM EDTA，２mＭD ＴT，１5０mＭＮaCl, 1% Triｔon X—1０0, 1mg/ml Leupeｐｔin, 1mg/ml Ｐepstatｉn，1ｍＭTCEP.
超声时用40－６０ml裂解液,因为我们得超声仪很适合用１0０ml小烧杯，装４0—60mｌ裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌多就延长超声时间（全程冰浴）.
包涵体得溶解
１、对于尿素与盐酸胍得选择：
尿素与盐酸胍属中强度变性剂,易经透析与超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强得可逆性变性作用，所需浓度尿素8-1０Ｍ，盐酸胍6—8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为７0－90％,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂
解形成氰酸盐,对重组蛋白质得氨基进行共价修饰,但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95％以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修饰。
但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀与对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
2、去垢剂：
温与去垢剂TrｉtonＸ—１０0洗涤去除膜碎片与膜蛋白。
如强得阴离子去垢剂ＳＤS，可以破坏蛋白内得疏水键,可以增溶几乎所有得蛋白。
问题就是由于ＳDS无法彻底得去除而不允许在制药过程中使用。
包涵体得复性
1复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性得完全伸展状态恢复到正常得折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
２复性得效率：
复性就是一个非常复杂得过程,蛋白质得复性效率在20％左右.影响复性
效率得因素有蛋白质得复性浓度，变性剂得起始浓度与去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂与其她添加剂得存在与否等。
４、复性中常采用得方法有:
稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点就是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。
透析复性：好处就是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，缺点就是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多得使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点就是不适合样品量较少得情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆得变性。
柱上复性：就是最近研究较多并成功得在生产中应用得一种复性方法，常用于复性得层析方法有ＳEＣ、HIC等。
复性得具体方法还要根据前期试验及筛选来确定!
包涵体得复性还要注意以下几点：
1、首先要获得较高纯度得包涵体.
2、包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3、复性前后均要离心
4、复性不能太快、
5、纯化得最佳条件要摸索与结合相关文献。
6、变性蛋白得浓度
浓度不要太高，一般０、4-0、5ｍg/ml 左右较适宜,若浓度高了，可稀释至适宜浓度。
有些蛋白可能更低,此时需要结合文献与实践,确定最佳浓度。
要结合透析前后得浓度,如果透析液加入甘油,这需要结合浓缩比（10％甘油可浓缩２0%左右).
复性Buffer得选择
包涵体复性液配方
对于包涵体复性,一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到２M左右时结束。
对于盐酸胍而言,可以从4M开始，到1、5M 时复性过程已经结束。
Ｔris 系统与PＢS系统都没有明确得规定，这些需要您在实验过程中不断试验，确定合适得缓冲系统；复性过程主要就是注意以下几个问题：
（1）最适pH值范围为8、0-9、０之间；(有时需要过酸或过碱性)
(2)温度适宜选择4℃；
(3)复性过程蛋白浓度不宜过大；(小于0、5mg/ｍl为宜)
（4）复性时间一般为2４—36小时;
(5)低分子化合物如L-Aｒg有助于增加复性中间产物得溶解度；脲、盐酸胍等,在非变性浓度下就是很有效得促进剂，都可阻止蛋白聚集;Trｉs对蛋白质复性有促进作用。
(6)氧化还原体系,如GSH/GSSG、DTT／GSSＧ等.常用得氧化方法有：空气氧化法:在碱性条件下通空气,或者加入二价铜离子，能够取得更好得效果，缺点就是不易控制氧化还原电势.
氧化还原电对（redox）:常采用ＧＳSG/GSＨ(1:５-１：１0)，通过调整两者得比例来控制较精确得氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如ＤTT,如:5 mM GＳSG/2 mM DTＴ＝ＧＳH/GＳSG(1、３３/1)。
（7)复性过程得添加剂：
１、共溶剂：如PEG６０0０-200０0,据说可以可逆得修饰折叠中间体得疏水集团,此外由于阻止了蛋白质分子间得相互接触得机会,也可能对复性效率得提高起作用。
一般得使用浓度在0、1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、0、4—０、６M Ｌ—Arg：促进蛋白溶解，(成功得应用于很多蛋白如ｔ-PＡ得复性中，也可以抑制二聚体得形成。
)
3、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会,一般使用浓度在5%—30%.
４、一定得盐浓度，可能就是为了降低某些带电集团间得斥力，有利于蛋白质得折叠.
5、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须得辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等(如分子伴侣等）很多时候对蛋白质正确得折叠就是有利得。
，MｇＣl2等特殊得金属离子，可参与蛋白质得正确６、特殊离子:如CaCl
２
折叠,促进活性得作用。
（此时勿加入ＥDTA。
)
例如复性Buffer：
５0ｍM Tris—HCl（pH８、0)，10mＭCａＣl2,0、4 M L—Arg, ２mM ＧSH ／０、4mM GSSG,10％甘油。
透析buffer：
5０mM Tris-HCｌ(ｐＨ8、0),1０ｍＭCaＣl2，2mM ＤＴＴ，1０％甘油.
复性中蛋白析出！
出现蛋白析出,肯定就是条件变化太剧烈。
复性应该采取复性液浓度与pH值逐渐变化得方法，例如根据包涵体得溶液成分，每隔１个pＨ或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。
此外透析时必须浓度极低,条件温与，使蛋白质能够正确折叠。
(１）蛋白析出最大得可能性：蛋白浓度太高,建议稀释以后再复性;
（２）透析得盐浓度（比如ｕrea）要平缓降低:8M—6M—2Ｍ—ＰBS；
（3）若加变性剂(尿素可加到２Ｍ，盐酸胍可加到1—1、5M);
(4）另外可将甘油浓度增加（范围可在≤30%），且在复性样品中也可加适量甘油；
(5）如果还不行，可以换新得复性缓冲液；
(６)纯度不够!出现纯化得目标蛋白纯度不够时，可以先过分子筛再复性；
带有二硫键蛋白得复性!
如果蛋白中存在两个以上得半胱氨酸,立即形成正确得二硫键就是不可能得。
随着二硫键得数目增加(分子间与分子内得），可能得组合数目也在剧烈上升（3个二硫键就就是15种可能组合，４个对应１05,5个对应９45等等）。
如果二硫键就是正确折叠所必须得话，应该在溶解时加入一种还原性试剂（如1-１0ｍM DＴT）。
这种还原性试剂能够被复性用二硫化物置换试剂所取代。
加入二硫化物置换试剂（如氧化型＋还
原型谷胱甘肽)就是为了提供氧化还原作用力。
这些试剂同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体。
这些二硫键得形成或断裂反应就是可逆得，直到最有利得蛋白二硫键形成,这种平衡才会被破坏.这个过程被称作氧化型折叠.。
