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蛋白质变复性

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蛋白质复性

蛋白质复性

在吸附型色谱复性中，蛋白质通过与介质发
生较强的吸附作用来抑制凝集。
反胶团中的蛋白质复性
利用反胶团溶解变性蛋白质，可将变性 蛋白质彼此分隔开，阻止分子间相互作用，
提高复性收率。
• 包含体的概念；包含体的形成原因及体 内抑制方法。 • 包含体分离纯化；包含体溶解方法。 • 蛋白质复性方法。
二、包含体的分离纯化和溶解
1 包含体的分离纯化
分离：包含体通常位于细胞质中，通过采用机械破碎 细胞的方法或者化学破碎（加变性剂）或者溶菌酶与机械 法结合的方法破碎细胞后，采用离心分离或者膜分离，即 可得到粗包含体沉淀物。
纯化：粗包含体中有质粒DNA、脂多糖和其他蛋白质存 在，会加速聚集体的生成，复性率降低。相反，纯化了的包 含体复性收率可大幅度提高。经常采用的包含体分离纯化过 程包括差速离心和反复洗涤。
③高表达的蛋白肽链来不及形成正常的折叠构像而
导致错误的二硫键连接，或者是高表达时细胞内氧化还
原条件不同而生成不同的二硫键连接；
④蛋白溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导。 但产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠 酶和一些后修饰酶及分子伴侣等，蛋白质就不能溶解。
2、包含体的性质
具有很多优势： •以大肠杆菌为宿主，过表达形成的高密度蛋白质聚集 体，利于大规模生产目标蛋白； •目的产物含量高，利于分离纯化； •对蛋白酶不敏感，不易水解； •可避免具有毒害或杀伤作用的目的产物对宿主的伤害。
色谱复性
以凝胶过滤色谱为代表的非吸附性色谱复性；吸附性 色谱（金属鳌和色谱、亲合色谱、离子交换色谱、疏水相 互作用色谱）复性；固定化辅助因子复性（将某些对蛋白 质复性有辅助作用的分子固定在凝胶介质表面，用该固定
化凝胶介质辅助蛋白质复性的方法）

蛋白质变性与复性

蛋白质变性与复性

蛋白质相互作用与复合物分离
蛋白质变性
利用变性剂分离和纯化蛋白质复合物 中的各个组分，有助于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物的组成。
蛋白质复性
在研究蛋白质相互作用和复合物分离 后，通过复性技术将蛋白质恢复其天 然状态，可用于进一步的功能和结构 研究。
蛋白质优化与改造
蛋白质变性
通过蛋白质变性技术可以去除非必需的氨基酸残基或引入突 变，从而优化蛋白质的稳定性、活性或选择性。
蛋白质复性
复性后的蛋白质可用于进一步的功能和结构研究，以验证优 化和改造的效果。
人工酶设计与合成
蛋白质变性
在人工酶设计与合成过程中，利用变性技术可以去除天然酶中的非必需部分，提 高酶的活性和选择性。
蛋白质复性
复性后的酶可用于催化特定化学反应，以验证人工酶的活性和效果。
生物制药与疫苗开发
蛋白质变性
医疗领域
改进蛋白质检测和诊断技术，提高疾病诊断的准 确性和效率，为患者提供更好的医疗服务。
感谢您的观看
THANKS
蛋白质变性与复性
目录
CONTENTS
• 蛋白质变性 • 蛋白质复性 • 蛋白质变性与复性的应用 • 蛋白质变性与复性的研究进展 • 蛋白质变性与复性的挑战与前景
01 蛋白质变性
定义
蛋白质变性是指蛋白质在某些物理和 化学因素作用下，其特定的空间构象 被破坏，导致理化性质发生改变，生 物学活性丧失的现象。
复性后的蛋白质溶解度增加，有利于其在溶液中的稳 定性。
Байду номын сангаас
03 蛋白质变性与复性的应用
蛋白质结构与功能关系
蛋白质变性
通过改变蛋白质的理化条件，使其空间构象发生改变，从而改变其生物学活性。 有助于研究蛋白质的结构与功能关系，深入了解蛋白质在生物体内的生理作用。

蛋白质复性ppt课件

蛋白质复性ppt课件

经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
复性有关理论
“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否
定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二 者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同， 各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假 说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控 制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简 单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复 性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排， 脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热 力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。
蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假 设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白 质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是 “热力学假说”。
该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性， 其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋 白质的天然构象应是能量最小构象。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分
子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用

第3章(2) 蛋白质变性与复性

第3章(2) 蛋白质变性与复性

其他——反胶束萃取复性法
反胶束萃取复性与稀释复性相比较
提高复性率的策略
1、二硫键的形成 拥有多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程， 要求氧化剂和还原剂都在最佳的浓度下，以便于二硫 键的形成。 2、小分子添加物
降低蛋白聚集的策略是使用小分子添加剂，如丙酮、乙 酰、尿素、去污剂、蔗糖、短链醇、DMSO和PEG等。 最常用的是Ｌ－精氨酸、低浓度（1-2M）尿素或盐 酸胍以及去污剂（SDS）。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。
最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理：
• 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， • 降低错误折叠蛋白质的稳定性， • 增加折叠复性中间体的溶解度， • 增加非折叠蛋白质的溶解度， • 减少复性中间体接触发生聚集反应。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
第二节 蛋白质变性与 复性
Unfolding and Refolding
变性与复性
• 1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。 若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、 尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白 质变性。 弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保 持一定构型；强变性条件下，蛋白质完全变性 肽链伸展成无序随机状态。
包涵体
在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质， 尤其是来自真核生物的蛋白质聚集，会形成不溶 性、无生物活性的聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
大肠杆菌中的胰乳酶原包含体电镜照片
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子；
• 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象条件；
亲合色谱复性
分子伴侣亲合色谱，又称为“折叠色谱”。 为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当 变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消 除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在 疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环 过程，直到恢复其天然的构象状态。

生物化学名词解释

生物化学名词解释

练习题一、名词解释1.复性:蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性2. 等电点（pI）当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。

3. 同工酶存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）4. 诱导契合：诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。

5. 变构效应:有些酶分子表面除了具有活性中心外，还存在被称为调节位点（或变构位点）的调节物特异结合位点，调节物结合到调节位点上引起酶的构象发生变化，导致酶的活性提高或下降，这种现象称为别构效应6. 糖酵解:糖酵解是将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是生物体内普遍存在的葡萄糖降解的途径。

该途径也称作Embden-Meyethof-Parnas途径，简称ＥＭＰ途径。

8. β－氧化脂肪酸在体内氧化时在羧基端的β-碳原子上进行氧化，碳链逐次断裂，每次断下一个二碳单位，即乙酰CoA，该过程称作β-氧化。

9. 半保留复制DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。

这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。

由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制10. 转录转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照碱基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。

蛋白质复性技术

蛋白质复性技术

一、基本原理
• （4）色谱复性：在色谱的过程中实现复性， 称为色谱复性法。优点在于，色谱固定相 对变性蛋白质吸附性能低，甚至完全消除， 变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集， 产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在 蛋白质复性 的同时可使目的蛋白质与杂质 蛋白质分离，达到复性和纯化的双重效果。
一、基本原理
蛋白质复性
一、基本原理
1、包含体 • 是指以大肠杆菌为宿主细胞的基因表达产物由 于不能分泌到细胞外，而在细胞内聚集形成的 没有生物活性的固体颗粒。 • 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体 元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以 及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很 高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶 性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
一、基本原理
• （2）洗涤：为了除去包含体上粘附的杂质， 如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包含体， 通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或 盐酸胍会使包含体溶解，如2M尿素洗涤。 此外可以用温和去垢剂洗涤去除膜碎片和 膜蛋白。
一、基本原理
• （3）溶解：一般用强的变性剂如尿素、盐 酸胍通过离子间的相互作用，打断包含体 蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使 多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使 尿素不能溶解的包含体溶解，而且尿素分 解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲 酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
一、基本原理
3、蛋白质复性
• 由于包含体中的重组蛋白缺乏生物学活性， 加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构 破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。 通去除还原剂使二硫键正常形成。
一、基本原理

蛋白质2

蛋白质2

（3） Temperature
0－40 ℃蛋白质的溶 解度随温度的提高而 提高。 温度超过40℃时，由 于热动能的增加导致 蛋白质结构的展开 （变性），蛋白质内 部的疏水基团暴露， 促进蛋白质聚集和沉 淀。
PDI和NSI已被确定为美国油脂化学家协会的法定方法
2.4 影响蛋白质溶解性的因素
（2）盐浓度


“盐溶”（salted in）：中性盐的离子在 0.1-1Ｍ能提高蛋白质的溶解度。 增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质 分子与水分子的作用。 “盐析” （salted out）中性盐的离子 大于１Ｍ，蛋白质的溶解度降低，并可能 导致蛋白质沉淀。 高浓度盐离子可夺取蛋白质分子的水化层， 使蛋白质失水，聚合沉淀。

3.3.2、化学因素
1.pH
蛋白质所处介质的pH 对变性过程有很大的 影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低， 在中性pH 环境中，除少数几个蛋白质带有正电 荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。

酸碱引起的蛋白质变性可能是因为蛋白质溶 液pH值的改变导致多肽链中某些基团的解离 程度发生变化，从而破坏了维持蛋白质分子 空间结构所必需的某些带相反电荷基团之间 因静电作用形成的键。

Several environmental factors, such as pH, ionic strength, type of salts, temperature, and protein conformation, influence the water binding capacity of proteins.
各种蛋白质的水合能力
a f c 0.4 f p 0.2 f N
a: g water/ g protein fC: charged residues in the protein fP: polar residues in the protein fN: nonpolar residues in the protein

蛋白质复性(二)

蛋白质复性(二)

蛋白质复性的主要挑战就是创造适宜的 复性条件，最大程度地抑制聚集体的生 成，提高复性收率。
包含体蛋白的复性被认为是一种复杂的、 经验性很强的工作。
8 稀释复性
最简单，最常用，传统方法
具体模式：直接稀释复性、透析复性、 流加复性
1）直接稀释复性：将变性蛋白质溶液直 接稀释到适宜的复性缓冲液中
复性剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度 有关
常需更长的复性操作时间
选用复性方法的原则：在包含体蛋白质的复性中， 若利用盐酸胍或尿素溶解包含体，应首先考虑通 过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效 果。只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添 加剂。
表面活性剂、添加剂的去除是必须考虑的问题。
1 包含体的分离纯化
从细胞破碎开始，常采用机械破碎、化 学裂解、酶解或联用
离心沉降是常用的分离手段 膜分离也可以用于包含体的分离回收 用适宜的缓冲液对包含体进行洗涤
分离纯化注意事项
包含体的纯度对于复性收率影响显著 （包含体的纯度对复性收率的影响？）
对于特定的表达系统和表达产物，需根 据具体情况进行纯化过程开发实验，确 定适宜的纯化方案
蛋白质复性（二）
本章内容
包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣
本章重点
蛋白质复性的概念 包含体的概念及性质 蛋白质折叠的简化动力学模型（形成的机理） 包含体体内抑制策略 包含体分离纯化的一般方法和步骤 包含体的溶解方法 稀释复性的原理 蛋白质复性中常用的辅助因子及其作用
信息，变性的蛋白质在一定条件下可以完全自 发地恢复活性。 变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中，降低变性 剂浓度至非变性浓度范围，就可引发蛋白质折 叠复性。

蛋白质变性与复性

蛋白质变性与复性

3、变性剂的影响
尿素、盐酸胍， 甲基乙酰胺、 尿素、盐酸胍，N-甲基乙酰胺、甲基胺等 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 有些蛋白质还发生凝集和沉淀 变性机制：破坏氢键？？？ 变性机制：破坏氢键？？？ 用途？ 用途？
牛胰核糖核酸酶的变性与复性 （rancreatic ribonuclease)
不少蛋白质的变性之所以不可逆, 不少蛋白质的变性之所以不可逆,主要是所需 条件复杂. 条件复杂. 折叠所需的辅因子 解离与缔合条件的掌握 巯基的保护
(二)蛋白质变性和复性的动力学模型 二 蛋白质变性和复性的动力学模型
二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 可逆体系, 可逆体系,存在平衡
（五）变性蛋白质经过的构象
1、经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 2、经过酸、碱以及热变性的蛋白质，肽链不 经过酸、碱以及热变性的蛋白质， 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 3、由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 变性的蛋白质，螺旋增加， 变性的蛋白质，螺旋增加，不存在疏水键
（二）变性概念
涉及构象变化， 涉及构象变化，二硫键的断裂及侧链基团的化学修饰 吴宪： 吴宪： 天然蛋白质分子从紧密有序的结构 松散无序结构的过程。 松散无序结构的过程。 缺点： 缺点：没有与生物活性的变化联系
由于外界因素的作用， 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子 构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的丧失以及物理、化学性质的异常变化 ， 的丧失以及物理、 以及物理 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation 。 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。

（3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。

这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。

超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。

包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

120 第十九章 蛋白质变性与复性

120 第十九章 蛋白质变性与复性
DTT 2-ME %
效价 x1000 0.1 0.2 0.5 1 2 5
8.5
9
10
5
3
3
粘稠剂对SCF复性的影响
尿素(M) 效价 x1000 0 7 0.5 8 1 8 1.5 10 2 10 2.5 9
PEG％
效价 X1000 环糊精 ％ 效价 X1000 甘油％
0.1
6
0.2
6
0.5
10
1
10
如果将还原剂和脲同时除去，并且 稀释还原的蛋白并将它于生理pH条件下 暴露在空气中，Rnase A会自发地获得 它的天然构象，恢复正确的二硫键和充 分的酶活性。实验表明正确的二硫键只 有当蛋白质折叠成它的天然构象后才能 形成。
疯牛病是由于蛋白变性引起的
一种名叫Prion（朊病毒 ）的蛋白质 （28KD）已经被证实是疯牛病以及其它相关 疾病，如羊的搔痒症以及人类的海绵状脑病的 致病介质。
2
10
5
8
0.1
8 0.1
0.2
8.5 0.2
0.5
10 0.5
1
10 1
2
9 2
5
9 5
效价 X1000
8.5
8.5
10.
10
9
9
缓冲液浓度对SCF复性的影响
浓度 mmol/ L 效价 x1000
20
50
100
200
500
1000
10
10
10
9
5
3
复性时间和温度对SCF活性的影响
复性时间 （h） 效价 x1000 24 9 48 10 72 10
加脲和 巯基乙醇
核糖核酸酶A变性，酶的三级结 构和活性完全丧失，生成含有8 个巯基的多肽链。

蛋白的变性和复性

蛋白的变性和复性

蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。

蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。

变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。

引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。

化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。

不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。

蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。

生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。

有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。

（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。

（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献,了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1—2mMDTT，全程低温，及时处理。

（3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来,这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(1）退一步，优化表达条件;(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。

这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8。

0), 2mM EDTA，2mM DTT，150mM NaCl，1％Triton X—100，1mg/ml Leupeptin，1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。

超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来。

菌多就延长超声时间(全程冰浴）。

包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8—10M，盐酸胍6—8M。

尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱,溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

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变复性的过程E.coli 中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物。

生产研究中为了得到较高的目的蛋白的表达量，通常会采用较强的启动子(如λPL 、T7 或串联启动子) ,使外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10 %～50 %. 然而胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性 .绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚集成不溶的、无活性的包涵体形式, 极大地影响到后续的结构分析和活性研究工作, 开展对这些包涵体的复性工作已成为一个重要的研究方向。

包涵体是由蛋白质折叠中间体的聚集而形成的,任何影响中间体稳定的因素(如pH 值、离子强度、温度等) 都可导致包涵体的形成.包涵体形成原因1. 表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2. 重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

3. 重组蛋白所处的环境，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

5. 有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

蛋白复性的必要性细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。

包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。

复性过程是变性蛋白的重折叠过程。

对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠（即变性溶解) ,然后采用合适的复性方法促进变性，蛋白再折叠进而恢复活性.一．包涵体的分离纯化①含包涵体的宿主菌细胞的破碎；②将破碎液离心除去可溶蛋白（9000r 15min 4℃），获得包涵体；③洗涤包涵体,以除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤，温和去垢剂TritonX-100等洗涤包涵体,然后离心（12000r 5min 4℃）取上清洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白。

二．包涵体的去折叠（即包涵体的溶解）极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体。

绝大多数是采用6 mol/ L 盐酸胍或8 mol/ L 脲并结合还原剂来溶解包涵体.高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性. 因此,包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。

三．复性由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。

对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

包涵体蛋白复性方法稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。

其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。

相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。

此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。

影响复性效率的因素：1蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在0.1-1mg/ml；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能导致蛋白重新凝聚。

2. pH：复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0。

[12]3.此外，影响复性效率的因素还有：温度（温度高时蛋白质易发生凝聚）、变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

提高包涵体蛋白的复性效率1.氧化-还原转换系统对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。

最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG。

氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。

通常使用还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10：1—5：1。

2.添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。

如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。

蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。

浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度，可以抑制二聚体的形成。

3. 分子伴侣和折叠酶等分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。

4.其它提高复性率的策略还有许多，如：非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂Triton X-100、磷脂、等对蛋白质复性有促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。

[五．复性效果的检测：检测方法1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

蛋白复性的流程透析法一、实验器材分析天平、烧杯、量筒、磁力搅拌器、pH计、透析袋、离心机二、试剂尿素、Tris-base、NaCl、浓HCl、GSH、GSSG、甘油、精氨酸、G250三、实验步骤1.8mol/l尿素溶解包涵体（从蛋白组取得），离心（12000r 4℃ 5min)，取上清2.用8mol/l尿素稀释包涵体到终浓度为0.5mg/ml，取10ul稀释后溶液与285ul G250显色，取5ul 1mg/ml的BSA溶液与285ul G250显色，通过对二者进行颜色对比确定稀释终点3.将稀释液装入透析袋中，稀释液与透析液按照1:20的比例进行透析，透析液依次为6mol/l尿素 pH8.6，4mol/l尿素 pH8.5，,3mol/l尿素 pH8.4，,2mol/l尿素 pH8.3，1.5mol/l 尿素 pH8.2，,1mol/l尿素 pH8.1，,0.5mol/l尿素 pH8.0,0mol/l尿素 pH8.0，每次换液至少透析6h.4.改变精氨酸的浓度再进行透析，将精氨酸的浓度从0.5mol/l降到0.25mol/l,从0.25mol/l降到0各透析一次5.对复性蛋白进行浓缩，将PEG20000撒在透析袋上，4℃浓缩到适合体积6.收集浓缩蛋白，并跑蛋白凝胶，对蛋白含量进行初步定量。

注意事项1.控制包涵体的浓度，不宜偏高或偏低，偏高蛋白易沉淀，偏低则浪费试剂。

其他物质的加入也必须控制比例2.透析液的pH对蛋白复性有较大的影响3.复性要在4℃进行，否则蛋白易积聚沉淀4.根据蛋白的稳定性确定透析液中是否需要加入EDTA等其他物质5.每次换液透析时间不得少于6h，否则会因为变性液去除速度过快导致蛋白聚沉加入试剂对复性的作用GSH/GSSG:氧化还原系统实际上给蛋白质形成的是一个还原环境。

正确形成的二硫键在这样的环境中还是有可能被还原的。

氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率加入浓度大于0．4mol／LTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率精氨酸：L-Arg抑制分子间作用，降低聚集体生成速度，有助于增加复性中间产物的溶解度甘油：稳定天然蛋白质的结构，促进正确折叠产物的生成试剂配方（1L体系）尿素/g GSH/g2mM/L GSSG/g0.2mMArg/g 甘油/ml Tris/g NaCl/g PH8mol/l尿素480 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.0 6mol/l尿素360 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.6 4mol/l尿素240 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.5 3mol/l尿素180 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.4 2mol/l尿素120 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.3 1.5mol/l尿素90 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.2 1.0mol/l尿素60 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.1 0.5mol/l尿素30 0.615 0.1225 87.10 50 6.06 14.61 8.0 0mol/l尿素0 0 0 87.10 50 6.06 14.61 8.0 0mol/l尿素0 0 0 43.55 50 6.06 14.61 8.0 0mol/l尿素0 0 0 0 50 6.06 14.61 8.0。