变性蛋白的复性

表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述高应瑞（译）目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。

因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。

如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。

至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。

其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。

然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。

包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。

包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。

在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。

包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。

溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。

包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。

蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。

在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。

本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。

小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。

小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。

在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。

实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。

由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。

许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。

练习题一、名词解释1.复性:蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性2. 等电点（pI）当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。

3. 同工酶存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）4. 诱导契合：诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。

5. 变构效应:有些酶分子表面除了具有活性中心外，还存在被称为调节位点（或变构位点）的调节物特异结合位点，调节物结合到调节位点上引起酶的构象发生变化，导致酶的活性提高或下降，这种现象称为别构效应6. 糖酵解:糖酵解是将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是生物体内普遍存在的葡萄糖降解的途径。

该途径也称作Embden-Meyethof-Parnas途径，简称ＥＭＰ途径。

8. β－氧化脂肪酸在体内氧化时在羧基端的β-碳原子上进行氧化，碳链逐次断裂，每次断下一个二碳单位，即乙酰CoA，该过程称作β-氧化。

9. 半保留复制DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。

这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。

由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制10. 转录转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照碱基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。

蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。

蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。

变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。

引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。

化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。

不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。

蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。

生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。

有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。

（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。

（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。

重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。

重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。

但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。

随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。

一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。

2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。

低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。

在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。

添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。

在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。

利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。

筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。

3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。

包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。

蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献,了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1—2mMDTT，全程低温，及时处理。

（3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体(Inclusion Bodies,IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来,这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(1）退一步，优化表达条件;(2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。

这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少,加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8。

0), 2mM EDTA，2mM DTT，150mM NaCl，1％Triton X—100，1mg/ml Leupeptin，1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。

超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来。

菌多就延长超声时间(全程冰浴）。

包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8—10M，盐酸胍6—8M。

尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱,溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。