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猪链球菌2型的鉴定及其毒力因子检测杨承槐;宁宜宝;赵启祖;宋立【期刊名称】《中国兽医学报》【年(卷),期】2009(29)3【摘要】猪链球菌的感染不仅对养猪业造成巨大的损失,同时对公共卫生尤其是相关从业人员的生命造成威胁,严重感染引起死亡。
根据参考文献,设计了1对猪链球菌2型特异性引物。
对四川分离的7株链球菌、江苏分离的1株、北京分离的6株和菌种中心保存的5株C群马链球菌兽疫亚种、1株D群链球菌、4株R型链球菌、2株S群链球菌和E、F、G、K、L、M、N、O、P群链球菌各1株进行了检测。
结果7株四川分离株均为2型;1株江苏分离株为2型;6株北京分离株有3株为2型;1株R群、2株S群链球菌为2型猪链球菌。
对检测出的14株猪链球菌2型的毒力因子做进一步检测。
MRP基因检出率为92.9%(13/14);EF基因检出率为100%(14/14);sly基因检出率为71.4%(10/14);Cps2A基因检出率为92.9%(13/14);gapdh基因检出率为64.3%(9/14);FBPS基因检出率为92.9%(13/14);orf2基因检出率为71.4%(10/14)。
毒力因子全为阳性的菌株有6株,MRP-EF+菌株有2株。
本研究从259份健康猪扁桃体中分离到16株2型猪链球菌,健康猪带菌率为6.2%(16/259)。
16株猪链球菌2型中,MRP、EF、Cps2A 全为阴性,只从1株2型猪链球菌中检测到了sly基因(1/16);gapdh基因检出率为56.25%(9/16);FBPS基因检出率为75.0%(12/16);Orf2基因检出率为37.5%(6/16)。
【总页数】4页(P304-307)【关键词】猪链球菌;2型;毒力因子【作者】杨承槐;宁宜宝;赵启祖;宋立【作者单位】中国兽医药品监察所【正文语种】中文【中图分类】S852.61【相关文献】1.荧光定量PCR检测猪链球菌2型主要毒力因子方法的建立 [J], 凌淑萍;赵健;陈国;叶宇飞;许秀琴;吕燕;吴银良2.荧光定量PCR检测猪链球菌2型主要毒力因子方法的建立 [J], 凌淑萍;赵健;陈国;叶宇飞;许秀琴;吕燕;吴银良3.2型猪链球菌分离鉴定及毒力基因检测 [J], 黎敏4.致病性猪链球菌2型的病原分离鉴定及毒力因子的PCR检测 [J], 胡杰;刘棋5.2型猪链球菌的毒力因子的鉴定及分布 [J], 徐引弟;王治方;张青娴;朱文豪;焦文强;李海利;郎利敏;王克领因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪2型链球菌毒力因子研究进展曹三杰;段丽丽;肖驰;文心田【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2007(023)001【摘要】猪链球菌根据菌体荚膜抗原特性的不同，可以分为35个血清型（1—34型及1／2型），其中以2型流行最广，对猪的致病性最强，其次是1、4、7、9型和1／2型等。
猪链球菌2型又称为猪链球菌血清2型或荚膜2型猪链球菌，分类上属于兰氏分类法的R群。
此菌通常以引起断奶仔猪关节炎、脑膜炎、败血症及支气管炎为特征，其还可引起人类感染胸膜炎、败血症等，导致严重疾患，甚至死亡。
猪2型链球菌已成为我国当前人兽共患病的一种重要的新病原菌。
【总页数】3页(P89-91)【作者】曹三杰;段丽丽;肖驰;文心田【作者单位】四川农业大学动物科技学院动物传染病与基因芯片实验室,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院动物传染病与基因芯片实验室,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院动物传染病与基因芯片实验室,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安,625014;四川农业大学动物科技学院动物传染病与基因芯片实验室,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安,625014【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.猪2型链球菌毒力因子分析 [J], 贾世玉2.猪链球菌2型毒力因子研究进展 [J], 杨卫军;郝永清;杨志彪3.猪链球菌2型毒力因子研究进展 [J], 吴立志;王金良;肖跃强;李书光;祖立闯;伍晓雄;沈志强4.猪链球菌2型毒力因子及疫苗候选蛋白研究进展 [J], 吴萍萍5.表观健康猪群携带猪链球菌2型毒力因子的分布特征 [J], 陈进喜;覃芳芸;熊毅;翟成兵;郑彦梓;黄梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪链球菌2型的分子流行病学研究何孔旺;倪艳秀;王继春;何家惠;王伟峰;杨瑛;陆承平;林继煌【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2002(018)005【摘要】目的了解猪链球菌2型高发地区(疫区)与少发地区(非疫区)猪群的带菌率及其毒力因子MRP与EF的分布情况,探讨猪链球菌2型的发生及其流行规律.方法分别从不同地区采集正常屠宰猪或活体采集成年猪扁桃体,经接种马丁汤培养基增菌培养后,用PCR方法进行2型猪链球菌的检测,同时检测各2型菌的主要毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)与细胞外蛋白因子(EF)基因(mrp和epf).结果除少数猪群外正常猪群中猪链球菌2型的带菌率普遍较高,为31.6%～77%,平均为40.9%,且疫区(39%)与非疫区(42%)差异不明显.但毒力因子mrp和epf的阳性率疫区与非疫区存在明显差异,非疫区的2型菌株除极少数表现为mrp+epf-(5%)或mrp-epf+(5%)外,绝大多数(90%)都表现为对猪无毒力的mrp-epf-表现型,无一株表现为mrp+epf+;来自疫区的所有16株2型菌株均为对猪有强毒力的mrp+epf+表现型.结论正常猪群中2型猪链球菌的带菌率与猪群是否暴发流行该病可能并无直接关系,但疫区猪群mrp+epf+表现型菌株检出比率较高,提示携带mrp+epf+表现型菌株的猪可能是本病的主要潜在传染源.【总页数】3页(P45-47)【作者】何孔旺;倪艳秀;王继春;何家惠;王伟峰;杨瑛;陆承平;林继煌【作者单位】江苏省农科院兽所农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室,南京,210014;江苏省农科院兽所农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室,南京,210014;江苏省农科院兽所农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室,南京,210014;江苏省农科院兽所农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室,南京,210014;江苏省兽医总站;江苏省兽医总站;南京农业大学动物医学院;江苏省农科院兽所农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室,南京,210014【正文语种】中文【中图分类】R378.1+2【相关文献】1.贵州省铜仁地区猪链球菌2型的分子流行病学分析 [J], 朱锋钊;杜秀园;高俊波;李秀富2.贵州省铜仁地区猪链球菌2型的分子流行病学分析 [J], 朱锋钊;杜秀园;高俊波;李秀富;3.贵州省铜仁地区猪链球菌2型的分子流行病学分析 [J], 朱锋钊;杜秀园;高俊波;李秀富4.广西屠宰猪的猪链球菌2型分子流行病学调查 [J], 胡杰;刘棋;陆承平5.猪链球菌2型疫苗候选分子FBP的表达及免疫学活性研究 [J], 刘丽娜;胡福泉;朱军民;赵岩;陈志瑾;唐家琪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Ⅱ型猪链球菌毒力因子基因的鉴定及其表达调控的开题报
告
题目：Ⅱ型猪链球菌毒力因子基因的鉴定及其表达调控
研究背景
链球菌是一种人和动物共同感染的致病菌，其中猪链球菌是猪类常见病原菌之一。
Ⅱ
型猪链球菌是猪链球菌中最常见的血清型，其致病能力强，引发严重的猪链球菌病。
猪链球菌毒力因子是影响病原菌致病性的关键性因素，目前已经鉴定出许多与猪链球
菌致病机制相关的毒力因子基因，但Ⅱ型猪链球菌毒力因子基因的相关研究相对较少。
研究内容
本研究将通过PCR扩增、测序和生物信息学方法，鉴定出Ⅱ型猪链球菌中可能存在的毒力因子基因，并进行生物学特性分析。
同时，通过RT-PCR技术分析毒力因子基因
的表达调控，探究其在猪链球菌致病过程中的作用机制。
研究意义
本研究可以深入了解Ⅱ型猪链球菌毒力因子基因及其作用机制，为猪链球菌病的防治
和治疗提供参考。
同时，还可以为其他病原菌致病机理的研究提供参考和借鉴。
研究方法
主要采用PCR技术、测序技术、生物信息学分析、RT-PCR技术等实验方法，结合文
献资料、生物学特性分析等方法，全面深入地研究Ⅱ型猪链球菌毒力因子基因及其表
达调控。
研究预期结果
预计可以鉴定出Ⅱ型猪链球菌中可能存在的毒力因子基因，并进行生物学特性分析。
同时，通过RT-PCR技术可以研究毒力因子基因的表达调控，揭示其在猪链球菌致病
过程中的作用机制。
最终，可以为猪链球菌病的防治和治疗提供参考，同时拓展病原
菌致病机理的研究领域。
2007-2009年东莞市屠宰猪体内猪链球菌2型带菌情况调查及分析洪伟彬;张险朋;黄炳炽【摘要】@@ 猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌.它不仅可以引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、败血症和突然死亡,而且可以感染相关从业人员,并导致死亡.1991年我国广东省首次分离到猪链球菌2型[1],此后全国各地陆续分离到该细菌.1998-1999年江苏省南通地区暴发猪链球菌2型疫情,并引起20多人感染,死亡14人[2].2005年7月,四川资阳地区再次暴发猪链球菌2型疫情,导致34人死亡[3].给养猪业和公共卫生安全带来重大危害.链球菌可隐性带菌,扁桃体是猪链球菌入侵猪体内首先定植的器官,也是猪隐性带菌的主要部位.通过监测猪群扁桃体内SS2的携带情况,可了解SS2在猪群内的感染.本研究用荧光PCR的方法对本市屠宰猪体内SS2隐性带菌情况进行监测,为进一步制定链球菌病预防控制措施奠定基础.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2010(027)011【总页数】2页(P48-49)【作者】洪伟彬;张险朋;黄炳炽【作者单位】东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞,523086;东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞,523086;东莞市动物疫病预防控制中心,广东东莞,523086【正文语种】中文【中图分类】S852.611猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2，SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌。
它不仅可以引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、败血症和突然死亡，而且可以感染相关从业人员，并导致死亡。
1991年我国广东省首次分离到猪链球菌2型[1]，此后全国各地陆续分离到该细菌。
1998－1999年江苏省南通地区暴发猪链球菌2型疫情，并引起20多人感染，死亡14人[2]。
2005年7月，四川资阳地区再次暴发猪链球菌2型疫情，导致34人死亡[3]。
2型猪链球菌89K致病岛进化途径分析的开题报告1. 研究背景和意义2型猪链球菌（Streptococcus suis）是一种常见的耐酸革兰氏阳性球菌，是猪类主要的病原菌之一，严重危害了猪类的健康，对养殖业造成了很大的经济损失。
其中，89K菌株是最具代表性的猪链球菌高毒菌株之一，能够引起败血症、脑膜炎、肺炎等多种疾病，有一定的致死率。
然而，引起89K菌株毒力的分子机制仍然不清楚。
为了深入了解89K菌株的病原机制和致病途径，必须研究其毒力因子和进化途径。
毒力因子是指影响病原菌致病能力的基因或蛋白质。
进化途径是指菌株进化过程中致病因子的改变和演化，包括基因重组、水平基因转移、插入序列等一系列变异现象。
深入研究89K菌株致病因素的进化途径，可以为猪链球菌毒力机制的研究提供新思路和新方法。
因此，开展2型猪链球菌89K致病岛进化途径分析具有重要的意义和广阔的应用前景。
2. 研究内容和方法本研究旨在分析2型猪链球菌89K致病岛的进化途径，探讨其毒力因子进化规律和病原演化机制。
具体的研究内容和方法如下：(1) 文献查阅：对2型猪链球菌的相关文献进行综述，了解89K菌株的病原机制和分子生物学特性。
(2) 基因组分析：利用2型猪链球菌89K菌株的基因组数据，通过基因注释、基因编码、基因结构等分析方法，确定其基因组图谱和基因组结构特征。
(3) 毒力因子筛选：根据基因组数据和已知的相关文献，筛选89K菌株的毒力因子，包括致病岛和其他相关基因。
(4) 进化途径分析：结合多序列比对、进化树构建和基因重组等分析方法，研究89K菌株毒力因子的演化规律和进化途径。
3. 预期结果和意义本研究预计能够深入探究2型猪链球菌89K菌株的致病机制和进化途径，为深入研究链球菌的致病机制提供新思路和新方法。
具体预期结果如下：(1) 确定2型猪链球菌89K菌株的基因组结构和特点。
(2) 筛选出89K菌株的主要毒力因子和其演化规律。
(3) 探究89K菌株毒力因子的进化途径和演变模式。
广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析陈经雕;刘美真;柯碧霞;谭海玲;李柏生;柯昌文【摘要】目的掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据.方法选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析.结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+ 、cps2J+/mrp+/sly-/gdh +/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/e f+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef为病猪菌株所特有；MLST分型结果显示,22株分为ST1 、ST7和ST28三个型别,其中ST1 、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有.结论广东地区病人、病猪的猪链球菌2型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2013(029)010【总页数】5页(P986-990)【关键词】猪链球菌2型;毒力基因;PCR;分子分型【作者】陈经雕;刘美真;柯碧霞;谭海玲;李柏生;柯昌文【作者单位】广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州511430;广东省疾病预防控制中心,广州 511430;广东省疾病预防控制中心,广州511430【正文语种】中文【中图分类】R378.1猪链球菌（Streptococcus suis）是一种能在猪群中正常携带，偶尔导致猪、人发病的人兽共患的动物源性微生物。
根据其荚膜多糖抗原的异同划分为35个血清型，其中猪链球菌2型为优势致病血清型，而不同猪链球菌2型菌株间的致病力又存在明显的差异，这种差异可能与各菌株所携带的毒力因子有很大关系［1］。
目前认为猪链球菌2型的毒力因子主要包括荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、溶血素（sly）、谷氨酸脱氢酶（gdh）、胞外因子（ef）、纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白（FBPS）和毒力相关序列ORF2等［2］。
为了解广东地区猪链球菌2型菌株毒力基因分布及分子分型情况，本研究选取了其中5个毒力基因对我省分离自病人和病猪的猪链球菌2型菌株进行PCR检测分析，并对菌株进行MLST分子分型，为诊断、治疗和制定猪链球菌疫情防控措施提供科学依据。
1 材料与方法1．1 实验菌株 2005－2008年共22株，其中17株来自病人（其中2005年5株分别来自潮州、阳江、深圳、韶关和佛山，2006年5株分别来自江门、广州、佛山、中山和惠州，2007年7株分别来自佛山、江门、深圳各2株和广州1株），5株来自病猪（均为2008年分别来自肇庆2株、河源、茂名、惠州各1株），阳性对照的猪链球菌2型标准株SS2（来自德国）核酸由江苏省疾控中心惠赠。
1．2 试剂来源诊断血清购自丹麦（STATENS SERUM INSTITUT）公司，API20Strep生化鉴定试验条购自法国梅里埃公司，分子生物学试剂购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司，引物由上海生工公司合成，均在有效期内使用。
测序反应用PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（v3．1，ABI）试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。
1．3 实验方法1．3．1 菌株鉴定［3］从菌落形态、血清学实验及API 20Strep生化鉴定分别对菌株进行种、型鉴定。
1．3．2 毒力因子检测［3］1．3．2．1 菌株DNA提取用煮沸法或细菌基因组DNA试剂盒提取所有菌株的基因组DNA，试剂盒提取可参考说明书操作。
1．3．2．2 引物见表1。
表1 5个毒力基因的引物序列及产物大小Tab．1 Five virulence genes’primer sequences and product sizesTarget genes Primer sequences Annealing temperature Size of product cps2J p1：5′－gttgagtccttatacacctgtt－3′p2：5′－cagaaaattcatattgtccacc－3′ 60℃ 450bp mrp p1：5′－ggtataccttgctggtaccgttc－3′p2：5′－agtctctacagctgtagctgg－3′ 60℃ 532bp sly p1：5′－agttcgcacttgattttaag－3′p2：5′－aatacattgccagattactc－3′ 51℃ 1 500bp gdh p1：5′－ggcgccgaattcgtcgacattatttagcaatttttgcg－3′p2：5′－cgccgcggatccgtagttaaagttggtattaac－3′ 45℃ 1 100bp ef p1：5′－acaaaggcgtaggttcaatc－3′p2：5′－cggcatcaagaatgtctttg－3′ 56℃ 269bp 1．3．2．3 PCR反应体系反应体系为25μL，10×PCR Premix缓冲液12．5μL，上、下游引物（10 mmol／L）各1μL，模板2μL，用去离子水调整终体积至25μL。
反应结束后各取5μL于1% 琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照。
1．4．1 多位点序列分析（MLST）1．4．1．1 提取细菌基因组DNA 按照细菌DNA提取试剂盒说明书严格操作，提取的基因组－20℃保存待用。
1．4．1．2 PCR 扩增、测序、数据分析参照文献［4－5］分别用 PCR 扩增aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA和thrA7个管家基因DNA片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后测序。
各管家基因序列经DNA star SeqMan软件处理后与数据库http：／／ssuis．mlst．net／进行比对，获得各位点的等位基因数值，并形成相应的菌株等位基因谱，提交MLST 网站，确定序列分型（Sequence Type，ST）。
2 结果2．1 菌株鉴定对22株菌株进行菌落形态、血清学实验及API 20Strep生化鉴定，全部菌株均为猪链球菌2型。
2．2 毒力基因检测 22株菌分为5种毒力基因型，其中病人及病猪菌株均有cps2J＋／mrp＋／sly＋／gdh＋／ef＋型别（病人7株、病猪3株），cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh－／ef＋（6 株）、cps2J＋／mrp＋／sly－／gdh＋／ef ＋（4株）为病人分离株所特有，cps2J＋／mrp－／sly＋／gdh＋／ef＋（1株）、cps2J＋／mrp－／sly－／gdh＋／ef－（1株）为病猪分离株所特有，图1为部分菌株的cps2J基因片段结果。
结果见图1、表2。
2．3 MLST分型对所有菌株的7个管家基因片段进行扩增，经测序、比对分析显示，均能够在数据库找到对应的基因型，共有3个基因型，分别为ST1型（病人9株、病猪2株）、ST7型（病人8株、病猪2株）和ST28（病猪1株）型，其中ST1、ST7型菌株亲缘关系极近，均同属于ST1克隆复合物。
结果见图2。
表2 广东地区猪链球菌2型的毒力基因类型Tab．2 Detection of virulence genes in Ss2in GuangdongNote：＋is positive for PCR；－is negative for PCRTypes Virulence genes Strains cps2J mrp sly gdh ef Patients Sick pigs Total 1＋＋＋＋＋7 3 10 2＋＋－－＋6 0 6 3＋＋－＋＋4 0 4 4＋－－＋－0 1 1 5＋－＋＋－0 1 1 Total／／／／／17 5 22图1 部分菌株夹膜多糖基因片段（cps2J）结果－450bpFig．1 Strains capsular polysaccharide gene fragment（cps2J）－450bpThe 1－7are part of strains from patients；8－10 are part of isolates from sick pigs图2 广东地区猪链球菌2型菌株MLST分型聚类图Fig．2 MLST type cluster map of Streptococcus suis type 2in Guangdong Province3 讨论猪链球菌2型菌株曾引起我国1998年江苏省和2005年四川省的部分地区的人感染猪链球菌病疫情的暴发流行。
广东省猪链球菌在猪间的流行早有报告，但从病原学上证实人感染猪链球菌2型尚属首次［6］，且与江苏、四川人感染猪链球菌病疫情暴发不同，广东地区的猪链球菌2型菌株均来源于散发的病例和病猪。
研究发现并不是所有的猪链球菌2型菌株都具有致病性，其致病力取决于它的毒力因子，根据菌株毒力因子的差异，将其分为强毒力株、弱毒力株和无毒力株，其致病机理目前还不很清楚，但普遍认为其致病力的差异与该菌株的毒力因子分布有着密切的关系［7］。
Cps2J是猪链球菌2型菌株抵抗巨噬细胞吞噬的重要物质，在猪链球菌致病过程中有重要作用，也是猪链球菌进行分型的标志。
Smith等［8］研究发现通过插入突变得到的无荚膜的等位基因突变株在体外很容易被猪肺泡巨噬细胞摄入，更重要的是，通过鼻腔接种无菌仔猪的突变株对其完全无致病性，由此可见，荚膜多糖与菌株的致病力有关。
mrp与ef也是猪链球菌2型菌株重要的毒力因子，曾巧英等［9］研究证明mrp可单独作为猪链球菌2型菌株的毒力因子。
猪链球菌血清型众多，ef与血清型有相关性，ef是一种粘附素，能黏附上皮细胞并诱导上皮细胞融合和凋亡［10］。
Henk J等［11］研究欧洲的猪链球菌菌株结果显示：猪链球菌血清1型、2型、1／2型和14型菌株表达ef蛋白的百分率很高，菌株的毒力可能与ef相关。
本研究中除了1株来自病猪的菌株为ef阴性外，其余菌株均为ef阳性。
由于mrp和ef在强毒力菌株中检出率很高，在无毒力菌株中检出率很低，因而携带mrp和ef 常被认为是猪链球菌2型高致病性的标志［12］。
