生物技术专业核心课程
基因工程
华东理工大学张惠展
基因工程
523416789重组DNA 技术与基因工程的基本概念
重组DNA 技术与基因工程的基本原理
重组DNA 技术所需的基本条件
重组DNA 技术的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在酵母菌中的表达
外源基因在哺乳动物细胞中的表达
外源基因表达产物的分离纯化
7外源基因在酵母菌中的表达
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
B 酵母菌的宿主系统
C 酵母菌的载体系统
D 酵母菌的转化系统
E 酵母菌的表达系统
F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌的分类学特征
酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细
）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由
果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最
成熟的真核生物表达系统。
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物
7外源基因在酵母菌中的表达
B 酵母菌的宿主系统
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：
酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
如酿酒酵母（
克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）
如乳酸克鲁维酵母（
毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）
如巴斯德毕赤酵母（
裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）
如非洲酒裂殖酵母（
汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
如多态汉逊酵母（
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶
ssc2提高重组蛋白表达转录后加工
rgr1提高重组蛋白表达转录水平
ose1提高重组蛋白表达转录水平
ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Y
-
rho-提高重组蛋白表达转录水平
突变类型生物效应作用位点
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
能抑制超糖基化的突变类型mnn 甘露糖生物合成缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och 外侧糖链添加缺陷型
突变类型生物效应许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
链两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白
质的糖基化系统，但野生
型酿酒酵母对异源蛋白的
糖基化反应很难控制，呈
超糖基化倾向，因此超糖
基化缺陷株非常重要。
泛素介导的蛋白质降解作用
蛋白酶体
Lys HOOC Ubiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3
Lys
ubiquitin ligase E3
Lys 靶蛋白靶蛋白靶蛋白
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：
UBI 1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭编码泛素
UBI 2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭编码泛素
UBI 3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭编码泛素
UBI 4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达编码泛素五聚体对数生长期关闭酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，
因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBA 1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位编码泛素激活酶
基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解Ubc4 -ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
7外源基因在酵母菌中的表达
C 酵母菌的载体系统
酵母菌中的野生型质粒
酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双链
同源重组REP1REP1RAF RAF STB STB ori REP2
REP2FLP FLP IR IR IR IR A B 环状质粒，拷贝数达50至100个。
IRs 反向重复序列，600 bp ，重组
FLP 编码产物驱动IRs 的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性
STB REP 的结合位点
接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质
粒类似。
酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同
pGKL1 8.9 kb
DNA聚合酶毒素蛋白αβ 免疫蛋白γ 亚基的双链线状质粒pGKL1和pGKL1
拷贝数为50-100个，分别携带K1
K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列
素蛋白编码基因（α β γ），同时含有毒素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb
元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标
记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒
记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。
以ARS为复制子的质粒称为YRp
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp
后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列
将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp
YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1 -5个含有TEL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域
7外源基因在酵母菌中的表达
D 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序
转化质粒在酵母细胞中的命运
用于转化子筛选的标记基因
酵母菌的转化程序
酵母菌原生质体转化法
早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。
2+
但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%
全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的 技术路线 该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下： 1、样品准备： a) 提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品； 2、样品制备（见图1-1）： a) 类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp 的特异性片段，用来标记该基因，称为TAG； b) 在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物； 3、上机测序： a) 通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列； 4、基本信息分析： a) 对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列； b) 通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量； c) 对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系； d) 基因在正义链和反义链上表达量间的关系； e) 其它统计分析； 5、高级信息分析： a) 基因在样品间差异表达分析； b) 库容量饱和度分析；
c) 其它分析； 测序优势 利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下： 1．数字化信号：直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。 2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。 3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。 4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。 5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300 万~600万个表达标签。
基因表达谱测序 背景介绍 基因表达谱分析利用HiSeq 2000高通量测序平台对mRNA进行测序，获得10M读长为49nt的原始reads，每一个reads可以对应到相应的转录本，从而研究基因的表达差异情况。与转录组测序相比，基因表达谱分析要求的读长更短，测序通量更小，仅可用于基因表达差异的研究。该方法具有定量准、可重复性高、检测阈值宽、成本低等特点，能很好的替代以往的数字化表达谱分析。 技术路线
生物信息学分析 送样要求 样品要求 1. 所需Total RNA 的量均不少于 20μg/文库，Total RNA 可以保存在DEPC 处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。 2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g ； 3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g ； 4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞； 5. 如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml 的样品。 我们强烈建议在送样的同时客户做好备份，以备后续实验之用。 样品纯度要求 1. OD 260/OD 280在1.8- 2.0之间，RNA 无降解、28S 和18S 核糖体RNA 条带非常亮且清晰（其
大小决定于用于抽提RNA的物种类型），28S的密度大约是18S的2倍；Agilent 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8。 2. 无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理。 请提供至少一种样品的凝胶电泳或者Agilent 2100检测仪检测图片，并注明其浓度、体积、OD260/OD280、溶剂名称、制备时间、物种来源以及特别备注。最终以我方定量、质检为准。 样品采集 为了保证提取RNA的完整性，确保后续实验的顺利进行，请务必确保样品的新鲜，对于如何确保样品的新鲜针对不同的样品获取材料的方法如下： 1. 动物组织：从活体上迅速的取下组织（切成黄豆粒大小的块状），每切成一个黄豆粒大小的块状立即放入液氮中，重复上述操作，直至足够提取总RNA的量；准备一个50ml的离心管，做相应的标记（样品名称、编号、客户姓名、时间），最好既在管盖上做好标记，也在管壁上做好相应的标记，先放入液氮中预冷2-3min，拿出离心管（离心管的下部分还是保持在液氮中），打开离心管的盖子，将液氮中黄豆粒大小的块状收集进离心管中。 2. 植物组织： （1）如所采集的是果实、麦穗等体积偏大的样品，收集样品请参照1.动物组织取样方法；（2）如采集的是叶片等体积偏小的样品，请尽量采集嫩叶、幼芽等，每采集一片叶片立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量，后续操作请参照动物组织的采集。 （3）如是植物的花，在采集花骨朵的时候请尽量不要采集到花萼、叶片等，每采集一个花骨朵请立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量；后续操作请参照动物组织的采集。3. 如提供实验材料为菌丝体，请取500μl的菌液于1.5ml离心管中，离心去上清，剩余菌丝体放入液氮或干冰中，请提供不少于5管的菌丝体。 样品运输 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。请填写完整订单，放入自封袋中与样品一起邮寄。为防止RNA的降解，请确保干冰的量足够运送到目的地。我们强烈建议在寄送RNA样品时将RNA保存在75%的乙醇或异丙醇中。 如是特殊样品，关于送样量和保存问题请与我们联系沟通，以便双方共同协商解决。 提供结果 根据客户需求，提供不同深度的信息分析结果。
第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001 文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略 聂东宋,梁宋平,李 敏 (湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081) 摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达. 关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达 中图分类号:Q75 文献标识码:A 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略. 1 外源基因本身的特性对表达的影响 1 1外源基因的A+T组成 外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50% 收稿日期:2001-08-05 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392) 作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.
摘要要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量，必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。本文就这些因素进行分析，并提出一定的对策和建议。 酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。 1、外源基因特性 外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。但遗憾的是，限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产甚至仅仅能否表达。至仅仅能否表达。 2、表达框的染色体整合位点和方式 虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。AOXl和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase , HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。 3、宿主菌的甲醇利用表型(Mut＋和MutＳ) 用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。当诱导AOX1时，转化子不能同时高水平产生酒精氧化酶和外源蛋白，与野生型Mut＋比较，Mut
基因表达谱芯片的数据分析(2012-03-13 15:25:58)转载▼ 标签：杂谈分类：生物信息 摘要 基因芯片数据分析的目的就是从看似杂乱无序的数据中找出它固有的规律, 本文根据数据分析的目的, 从差异基因表达分析、聚类分析、判别分析以及其它分析等角度对芯片数据分析进行综述, 并对每一种方法的优缺点进行评述, 为正确选用基因芯片数据分析方法提供参考. 关键词: 基因芯片; 数据分析; 差异基因表达; 聚类分析; 判别分析 吴斌, 沈自尹. 基因表达谱芯片的数据分析. 世界华人消化杂志2006;14(1):68-74 https://www.doczj.com/doc/639647412.html,/1009-3079/14/68.asp 0 引言 基因芯片数据分析就是对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取的杂交点荧光强度信号进行的定量分析, 通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类, 最终整合杂交点的生物学信息, 发现基因的表达谱与功能可能存在的联系. 然而每次实验都产生海量数据, 如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息, 将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来, 阐释生命特征和规律以及基因的功能, 是生物信息学研究的重要课题[1]. 基因芯片的数据分析方法从机器学习的角度可分为监督分析和非监督分析, 假如分类还没有形成, 非监督分析和聚类方法是恰当的分析方法; 假如分类已经存在, 则监督分析和判别方法就比非监督分析和聚类方法更有效率。根据研究目的的不同[2,3], 我们对基因芯片数据分析方法分类如下: (1)差异基因表达分析: 基因芯片可用于监测基因在不同组织样品中的表达差异, 例如在正常细胞和肿瘤细胞中; (2)聚类分析: 分析基因或样本之间的相互关系, 使用的统计方法主要是聚类分析; (3)判别分析: 以某些在不同样品中表达差异显著的基因作为模版, 通过判别分析就可建立有效的疾病诊断方法. 1 差异基因表达分析(difference expression, DE) 对于使用参照实验设计进行的重复实验, 可以对2样本的基因表达数据进行差异基因表达分
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现 1.表达谱芯片及其应用 表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。 cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计?算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。 基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。 ③不同个体的相同基因表达上的差异。利用基因芯片可以分析多个样本，同时筛选不同样本（如肿瘤组织、癌前病变和正常组织）之间差异表达的基因，这样可以避免了芯片间的变异造成的误差⑷。张辛燕⑸ 等将512个人癌基因和抑癌基因的cDNA用点样仪点在特制玻片上制成表达谱芯片，对正常人卵巢组织及卵巢癌组织基因表达的差异性进行比较研究，结果发现在卵巢癌组织中下调的基因有23个，上调的基因有15个，初步筛选出了卵巢癌相关基因。Lowe⑹等利用胰腺癌、问充质细胞癌等组织的cDNA制备基因芯片，筛选到胰腺癌细胞中高表达的基因，为医疗诊断、病理研究及新药设计 奠定基础。 2.表达谱芯片的数据处理技术
基因表达谱聚类分析 [ 文章来源：| 文章作者：| 发布时间：2006-12-21| 字体：[大中小] 学习过程可以采用从全局到局部的策略。采取这种策略时，学习初期可设定较大的交互作用半径R ，随着学习过程的不断推进，逐步减小R ，直至不考虑对邻近单元的影响。邻域的形状可以是正方形或者圆形。 KFM 的聚类结果与K 均值相似，它的优点是自动提取样本数据中的信息，同时也是一种全局的决策方法，能避免陷入局部最小，缺点在于必须实现人为设定类的数目与学习参数，而且学习时间较长。KFM 方法克服了K- 均值聚类的一些缺点：它应用类间的全局关系，能提供大数据集内相似性关系的综合看法，便于研究数据变量值的分布及发现类结构。而且，它具有更稳健更准确的特点，对噪声稳定，一般不依赖于数据分布的形状。 8.4.2.5 其它聚类方法 聚类方法是数据挖掘中的基本方法，数据挖掘的方法很多，在基因表达谱的分析中，除了以上常用方法外，还有一些其它的方法。由于对聚类结果尚没有一种有效的方法进行评价，尤其是对聚类结果的进一步生物学知识发现尚没有新的分析思路和成功应用，因此，科学家们在不断地研究一些新方法。这些方法有不同的原理，能够提取不同数据特征，有可能对具体的数据得到更有意义的结果，发现更多的生物学知识。这里，简单介绍这些方法的原理，更详细的介绍请参看相关文献。 (1)模糊聚类分析方法:这是一种模拟人类的思维方法，通过隶属度函数来反映某一对象属于某一类的程度。基本思路是计算两两基因表达谱之间的相似性程度，构建模糊相似矩阵，利用模糊数学中的传递闭包计算方法得到模糊等价矩阵，选择不同的置信水平从模糊等价矩阵中构建动态聚类图。对于特定的置信水平，可以实现对基因表达谱的分类。该方法的优点是利用了模糊数学中的隶属度概念，能够更好的反映基因表达谱之间的相互关系，而且它是一种全局的优化方法，与向量的顺序无关。 (2)模糊C均值算法:该方法同样将模糊数学中的隶属度概念引入到常用的K 均值聚类方法中。对于K 均值算法，一个基因表达谱所属的类只有一个，因此，它与各类别的关系要么是 1 ，要么是0 ，即属于或不属于某一类。而对于模糊 C 均值法，一个基因表达谱是否属于某一类，是以隶属度来确定第i 个样本属于第j 类的可能性。最终的聚类结果取决于分析的目的，可以根据最大隶属度来确定基因表达谱的分类，即一个基因表达谱只属于一类；但往往是确定隶属度的阈值，只要大于该阈值，就可以将基因表达谱划分为该类，这样的划分结果是一个基因表达谱可以属于多个类，这也是可以被生物学家接受的。模糊 C 均值法与K 均值法的实现过程基本相同，所不同的是对于
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 第一节基因的表达系统与表达策略 一、最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
《基因工程》思考题 第一章绪论 1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。 2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？ 3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。 4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程. 5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？ 6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础. 第二章基因工程的基本原理与支撑技术 1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点 2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点 3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？ 4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素. 5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？ 6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？ 7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。 8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？ 9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？ 10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？ 11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？ 12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？ 13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？ 14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？ 15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？ 16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？ 17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation. 第三章基因工程操作的基本条件 1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素. 2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？ 3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法. 4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？
对于基因表达谱数据的分析是生物信息学的研究热点和难点。转化为数学问题，分析任务是从数据矩阵 M 中找出显著性结构，结构类型包括全局模型 (model) 和局部模式 (pattern) 。对基因表达谱数据的分析是数据挖掘问题，所采用的方法包括通过可视化进行探索性数据分析（ Exploratory Data Analysis ）、描述建模 (descriptive modeling) 、分类、聚类、回归和机器学习等。 基因表达谱分析所采用的常用方法是聚类，其目的就是将基因分组。从数学的角度，聚类得到的基因分组，一般是组内各成员在数学特征上彼此相似，但与其它组中的成员不同。从生物学的角度，聚类分析方法所隐含的生物学意义或基本假设是，组内基因的表达谱相似，它们可能有相似的功能。然而，产物有相同功能的编码基因（例如对其它蛋白质有磷酸化作用），不一定共享相似的转录模式。相反，有不同功能的基因可能因为巧合或随机扰动而有相似的表达谱。尽管有许多意外的情况存在，大量功能相关的基因的确在相关的一组条件下有非常相似的表达谱，特别是被共同的转录因子共调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体，或者参与相同的调控路径。因此，在具体的应用中，可以根据对相似表达谱的基因进行聚类，从而指派未知基因的功能。 聚类分析是模式识别和数据挖掘中普遍使用的一种方法，是基于数据的知识发现的有效方法，特别适用于模式分类数不知道的情况。聚类分析是一种无监督学习方法，不需要任何先验领域知识，它根据数学特征提取分类标准，对数据进行分类，这种数学特征的例子有统计平均值、相关系数、协方差矩阵的本征值及本征向量等。聚类分析在基因表达数据分析中应用得很多，主要有层次聚类、 K 均值、自组织特征映射网络等。本节将介绍基因表达数据分析中常用的聚类方法及与此相关的内容。 8.4.1 相似性度量函数 对基因表达谱进行聚类分析之前，必须首先确定反映不同基因表达谱相似程度的度量函数，根据该函数可以将相似程度高的基因分为一类。在实际计算中，还可以用距离代替相似的概念，相似性度量被转化为两个基因表达谱之间的距离。距离越小，表达模式越相近；反之，则表达模式差异大。 常见的相似性度量有距离、点积、相关系数（ correlation coefficient ）、互信息（ mutual information ）等。假设两个基因表达谱分别为X = （x 1 ,x 2 ,…,x m ）和Y = （y 1 ,y 2 ,…, y m ） , 距离函数 d( X ，Y ) 必须满足如下条件： d( X ，Y ) ≧ 0 d( X ，Y ) = d( Y ，X ) d( X ，Y ) = 0 if X = Y
酵母及大肠杆菌基因型及遗传符号 说明 前言：实验室的一般大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp，基因间的平均间隔为118bp（基因Ⅷ）。E.coli 基因组中还包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其他特殊组份的片段，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了基因组具有它的可塑造性。 利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型（Genotype）。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。 分子克隆中常用的大肠杆菌及其遗传标记按Demerec等1966年提出的命名原则，采用的菌株所有的基因都假定处于野生型状态，除非在基因型上另外注明。 大肠杆菌基因型的表示方法（Demerec, et, al. 1966）： 一、一般规则： 1、根据基因产物或其作用产物的英文名称的第一个字母缩写成3 个小写斜体字母来表示。例如：DNA Adenine Methylase→dam。 2、不同的基因座，其中任何一个突变所产生的表型变化可能相同，其表示方法是在3 个小写斜体字母后加上一个斜体大写字母来表示区别。 例如：Recombination→recA、recB、recC。3、突变位点应通过在突变基因符号后加不同数字表示。如supE44（sup基因座E的44位突变）。如果不知道几个等位基因中哪一/几个发生了功能性突变，则用连字符“-”代替大写字母，如trp-31。4、细菌的基因型中应该包含关于其携带的质粒或附加体的的信息。这些符号包括菌株携带的质粒或附加体、质粒 或附加体上的突变基因座和突变位点。其基因符号应与基因座的表示符号明显区别，符号 的第一个字母大写、不斜体并位于括号内；质粒或附加体上的突变基因座和突变位点的基因符号的表示方法与染色体上突变基因座、突变位点的符号相同。5、对于携带附加体的 菌株的完整基因型描述应包括附加体的状态（游离或整合）。以 F 因子为例，F-：F 因子缺失；F+：自主性 F 因子，不携带任何遗传可识别染色体片段；F’：携带有遗传可识别 细菌染色体片段的自主性F因子；Hfr：整合到染色体上的F因子（high frequency of recombination）。当这些质粒或噬菌体片段变异或缺失时，用（）”或“/” 等以区别。例如：/F' [traD36、proAB、lacI q、lacZ M15] 6、某个基因或某个领域缺失时，在其基因型前面加上“”表示。例如：lac-proAB基因缺失时它的基因型表示为(lac-proAB)。7、由于某种基因的变异导致大肠杆菌可以明显观察到特征变化，有时也用其表现型代替基因型进行表示。例如：某些抗药性的获得或丧失，用如下方式表示：Streptomycin 抗性→Str
基因表达谱分析技术 1微阵列技术（microarray） 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸），并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。包括cDNA芯片（cDNA microarray）和DNA芯片（DNA chips）。 cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cm×18cm的膜上。尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA片段。要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。使用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基因表达的差异，只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片灵敏度更高，而且可以使用2种探针同时与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作带来的差异；缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。 Guo等（2004）将包含104个重组子的cDNA文库点在芯片上，用于检测拟南芥叶片衰老时的基因表达模式，得到大约6200差异表达的ESTs，对应2491个非重复基因。其中有134个基因编码转录因子，182个基因预测参与信号传导，如MAPK级联传导路径。Li等（2006）设计高密度的寡核苷酸tiling microarray方法，检测籼稻全基因组转录表达情况。芯片上包含13,078,888个36-mer寡核苷酸探针，基于籼稻全基因组shot-gun测序的序列合成，大约81.9%（35,970）的基因发生转录事件。Hu等（2006）用含有60,000寡核苷酸探针（代表水稻全部预测表达基因）的芯片检测抗旱转基因植株（过量表达SNAC1水稻）中基因的表达情况，揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。 2基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression,SAGE） 基因表达系列分析（SAGE）是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、有效的技术，也是一种高通量的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进行量化研究（Velculescu et al.,1995）。SAGE的基本原理是：每一条mRNA序列都可以用它包含的9bp的小片段（TAG）代替，因此考查这些TAGs出现的频率就能知道每一种mRNA 的丰度。首先利用生物素标记的oligo（dT）引物将mRNA反转录成双链cDNA，然后利用NlaIII 酶切双链cDNA。NlaIII酶的识别位点只有4bp，因此cDNA都被切成几十bp的小片段。带有生物素标记的小片段cDNA被分离出来，平均分成2份。这2份cDNA分别跟2个接头连接，2个接头中均有一个FokI酶切位点。FokI是一种II S型核酸内切酶，其识别位点不对称，切割位点位于识别位点下游9bp且不依赖于特异的DNA序列。FokI酶切分成2份的cDNA之
第18卷第6期微阵列技术[1-3]的到来对生物学和医学来说是一场 革命，通过它可以同时观测成千上万个基因的表达水平，从而能够在基因组水平上以系统的、 全局的观念去研究生命现象及其本质。还可以根据基因在不同条件下表达的差异性来进行复杂疾病诊断、药物筛选、个性化治疗、基因功能发现、农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督及司法鉴定等，因此对基因表达谱的研究具有重要的理论价值和应用意义。微阵列基因表达数据具有维数高、样本小、非线性的特点，这对一些传统的机器学习方法提出了新的挑战，对其数据的分析已成为生物信息学研究的焦点。 1基因表达数据采集 基因表达数据采集可分为三个步骤：微阵列设计、 图像分析和数据获取、过滤、标准化。基因芯片（gene chip ），简称为微阵列,就是指固着在载体上的高密度 DNA 微点阵，具体地说就是将靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度排列在玻璃、硅等载体上。mRNA （信使核糖核酸）的表达水平的获得是通过选取来自不同状态的样本（如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织，或用药之前与用药之后组织等，一种称为实验样本，另外一种称为参考样本），在逆转录过程中,实验样本和参考样本RNA （核糖核酸）分别用不同的红、绿荧光染料去标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经适当的洗脱步骤与激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）表示该基因在实验样本中的表达水平。在通常情况下，考虑Cy5和Cy3的数值时，还应考虑相应的背景数值，如果微阵列上某个基因的Cy5或Cy3数值比相应的背景数值低，则该基因的表达水平无法确定。为了方便数据处理，常 孟令梅等：一种基于DCT 变换的图像认证算法文章编号：1005－1228（2010）06－0017－03 基因表达谱数据分析技术 刘 玲 （江苏财经职业技术学院，江苏淮安 223001） 摘 要：人类基因组计划的研究已进入后基因组时代，后基因组时代研究的焦点已经从测序转向功能研究，主要采用无监 督和有监督技术来分析基因表达谱和识别基因功能，通过基因转录调控网络分析细胞内基因之间的相互作用关系的整体表示，说明生命功能在基因表达层面的展现，对目前基因表达谱数据分析技术及它们的发展，进行了综述性的研究，分析了它们的优缺点,提出了解决问题的思路和方法，为基因表达谱的进一步研究提供了新的途径。关键词：基因表达谱；分类；无监督；有监督；基因调控网络中图分类号：Q81；TP181 文献标识码：A Gene Expression Data Analysis LIU Ling （Jiangsu Vocational College of Finance &Econimics ，huai ’an 223001,China ） Abstract ：As the work of sequencing the genome of the human has been fully finished,the post-genomic era has begun.Scientists are turning their focus toward identifying gene function from sequencing.Clustering technology,as one of the important tools of analyzing gene expression data and identifying gene function,has been used widely.Transcriptive regulatory networks are the global representation of multiple interactions between genes and their products ,which can help us understand the cell ’s function at the level of gene expression In this paper we discuss main clustering technology about gene expression data at present,analyze their advantages and disadvantages ,present the methods to solve the problems and given approaches to study gene expression data. Key words:gene expression profile ； classification ；gene regulatory network Vol．18No．6Dec 2010 第18卷第6期2010年12月 电脑与信息技术Computer and Information Technology 收稿日期： 2010-06-09项目资助： 江苏省淮安市科技发展计划项目(HAG08015）作者简介： 刘玲（1964-），山东胶州人，副教授，硕士，主要研究方向:生物信息。
生物技术专业核心课程 基因工程 华东理工大学张惠展
基因工程 523416789重组DNA 技术与基因工程的基本概念 重组DNA 技术与基因工程的基本原理 重组DNA 技术所需的基本条件 重组DNA 技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化
7外源基因在酵母菌中的表达 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物
基因表达谱公共数据库(2010-04-17 11:17:21)转载▼ 标签：教育分类：系统生物学 gene expression profiles: NCBI: GEO EBI ArrayExpress和SMD 功能基因组相关信息分析 功能基因组学是后基因组研究的核心内容，它强调发展和应用整体的（基因组水平或系统水平）实验方法分析基因组序列信息阐明基因功能，特点是采用高通量的实验方法结合的大规模数据统计计算方法进行研究，基本策略是从研究单一基因或蛋白上升到从系统角度一次研究所有基因或蛋白。随着功能基因组实验研究的深入，大量的数据不断涌现，生物信息学将在功能基因组学研究中的扮演关键角色。 7.1 大规模基因表达谱分析 随着人类基因组测序逐渐接近完成，科学家发现即使获得了完整基因图谱，对了解生命活动还有很大距离。我们从基因图谱不知道基因表达的产物是否出现与何时出现；基因表达产物的浓度是多少；是否存在翻译后的修饰过程，若存在是如何修饰的，等一系列问题。这些问题的实质是不了解按照特定的时间、空间进行的基因表达谱。获得基因表达的信息是比DNA 序列测定艰巨得多的任务，因为基因表达是依赖于许多因素的动态过程。 国际上在核酸和蛋白质两个层次上发展了分析基因表达谱的新技术，即核酸层次上的cDNA 芯片（cDNA微阵列）技术和蛋白质层次上的二维凝胶电泳和测序质谱技术，即蛋白质组(proteome)技术。DNA芯片技术能够在基因组水平分析基因表达，检测许多基因的转录水平。对大规模基因表达谱的分析存在新的方法学问题，它们从数学角度看不是简单的NP问题、动力系统问题或不确定性问题，而是基因表达网络，因此需要发展新的方法和工具。同时，在芯片等的设计上，也需要从理论到软件的支持 下面主要围绕cDNA芯片相关的数据管理和分析问题进行讨论。 1．实验室信息管理系统 cDNA芯片实验的目的是要在一次实验中同时得到成千上万个基因的表达行为，这样的实验需要有管理实验前后大量数据的能力。设计构建检测基因表达的微阵列需要获得生物体基因的所有序列、注释和克隆。在杂交反应和扫描后，收集到的数据必须以某种方式保存，以便很容易进行图象处理和统计及生物学分析。因此需要建立与大规模高通量实验方法相匹配的实验材料和信息管理系统。 该系统除用来定位和跟踪材料来源（例如，克隆，微阵列，探针）外，还必须管理实验前后大量的数据。此外，还包括实验室设备软件系统，如斯坦福大学Brown实验室免费的控制自制机器点样设备软件（https://www.doczj.com/doc/639647412.html,/pbrown） 芯片图象处理已有各种软件工具，基本的功能是将不同信号强度点的图像转换为每个点的强度数值。这方面没有一致的方法，许多研究小组仍在开发这类软件。图象分析软件的质量对精确解释玻片和膜上的信号非常关键。NHGRI的Yidong Chen开发了一种复杂的图象分析程序，deArray,可免费获取。 美国国立卫生研究院人类基因组研究所（NHGRI）开发的免费的cDNA芯片数据管理分析系统ArrayDB，涉及微阵列的设计、实验室信息管理、实验结果的处理和解释。下面加以简单介绍。 ArrayDB ArrayDB是用来储存、查询和分析cDNA芯片实验信息的实验室管理系统。ArrayDB整合了cDNA芯片实验中的多个方面，包括数据管理、用户介面、机器自动点样、扫描和图象处理。