第八章酵母基因工程详解

第八章微生物的遗传概述：遗传(heredity or inheritanc® 和变异(variation)是生物体的最本质的属性之一。

遗传即生物的亲代将一整套遗传因子传递给子代的行为或功能。

变异指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。

基因型(ge no type某一生物个体所含有的全部基因的总和。

表型(phe no type)某一生物所具有的一切外表特征及内在特性的总和。

饰变( modification)不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、翻译水平上的表型变化。

8.1遗传变异的物质基础8.1.1三个经典实验1. 经典转化实验：1928年F.Griffith以Streptococcus pneumoniae为研究对象进行转化(transformation)实验。

1944年O.T.Avery等人进一步研究得出DNA是遗传因子。

S strun A2. 噬菌体感染实验：1952年Alfred D.Hershey和Martha Chase用32P标记病毒的DNA，用35S标记病毒的蛋白质外壳，证实了T2噬菌体的DNA是遗传物质。

3.植物病毒的重建实1956年H.Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）与TMV 近源的霍氏车前花叶病毒（Holmes ribgrass mosaic virus,HRV）所进行的拆分与重建实验证明，RNA也是遗传的物质基础。

8.2微生物的基因组结构：基因组（genome是指存在于细胞或病毒中的所有基因。

细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体（haploid）;真核微生物通常是有两套基因又称二倍体（diploid ）。

基因组通常是指全部一套基因。

由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。

酵母基因工程一酵母基因工程的发展现状1.酿酒酵母自身的改造（1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母（4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达（5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母2酵母表达异源蛋白（1）表达水平（2）表达质量2酵母基因工程的发展趋势（1）解决酵母基因工程中还存在的缺陷（2）在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向（3）利用酵母基因工程筛选更多新药（4）改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本（5）酵母的生理承受极限研究引起人们的关注3发展历程1.1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。

2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。

3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。

4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。

5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。

二．酵母基因工程的优点1.安全无毒，不致病；2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；3.容易进行载体DNA的导入。

DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；4.培养条件简单，容易进行高密度发酵；5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能三．酵母表达系统（1）酵母表达载体①载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。

原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。

酵母部分：1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；整合型载体的整合介导区。

2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列3基因启动子和终止子序列4信号肽序列②载体的复制形式附加型载体：在酵母染色体外自主复制1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的整合型载体：随同酵母染色体一起复制1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。

基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。

如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。

7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。

酵母基因工程菌的构建过程及其在食品领域中的应用随着科技的发展，食品生物技术在食品工业发展中的地位和作用越来越大，已经渗透到食品工业的方方面面，特别是基因工程技术等技术在21世纪的食品工业中充当重要的角色。

而工程菌就是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。

主要应用于治理海洋石油泄漏，生产基因工程药物，酵母基因工程中等方面。

而酵母基因工程中，酵母基因工程菌就是菌类细胞株系用的是酵母菌，能够发挥着一定的功能，可以提高发酵的效率。

酵母基因工程的优点：1.是真核生物，大多具有价高的安全性。

2.繁殖速度快，能大规模生产，具有降低基因工程产品成本的潜力。

3.将原核生物中已知的分子和基因操作技术与真核生物中复杂的转运后修饰能力相结合，能方便外缘基因的操作。

4.采用高表达启动子，可高效表达目的基因，而且可诱导调控。

5.提供了翻译后加工和分泌的环境，使得产物和天然蛋白质一样或类似。

6.酵母菌可表达外源蛋白与末端前导肽融合，指导新生肽分泌，同时在分泌过程中可对表达的蛋白进行糖基化修饰。

7.不会形成不溶性的包涵体，易于分离提纯8.移去起始甲硫氨酸，避免了在作为药物中使用中引起免疫反应的问题。

9.酵母菌（主要是酿酒酵母）已完成全基因组测序，他具有比大肠杆菌更完备的基因表达控制机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力。

10.酵母可进行蛋白的N-乙酰化，C-甲基化，对定向到膜的胞内表达蛋白具有重要意义。

构建基因工程菌是一个复杂、繁琐的过程，因此构建酵母基因要注意：1、结构简单，易于研究2、繁殖能力强，数目多3、成本低，易于培养、4易于观察。

一．酵母基因工程菌的构建过程：1.目的基因的获取：获取目的基因是实施基因工程的第一步，有三种方法提取目的基因。

（1）从自然界中已有的物种中分离出来：.从基因文库中获取目的基因（俗称：鸟枪法）：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。

酵母同源重组原理酵母同源重组原理是指利用酵母细胞进行基因工程操作以获得想要的特定基因或蛋白质。

该技术的基本原理是利用酵母细胞自然的DNA重组能力，通过合成或克隆DNA片段，将目标基因或载体DNA序列纳入到酵母细胞染色体中，并让其在细胞内表达，从而实现基因工程改造的目的。

酵母是一类单细胞真菌，常见的有酿酒酵母、面包酵母等，不仅广泛应用于食品工业，还被广泛用于生物学实验中。

酵母细胞具有许多与真核生物相似的生物学特点，包括真正的核糖体、线粒体、内质网和高度保守的基因调控机制。

因此，酵母也成为了生物学研究的理想模式生物。

其中，同源重组是指将同一染色体上的两个相似的DNA序列之间的交换事件。

这种重组机制是酵母细胞通过自然方式进行基因重组的重要方式，同时也是酵母同源重组技术的原理基础之一。

通过利用酵母同源重组技术，可以将外源DNA片段集成到酵母基因组中，实现外源基因的表达。

利用酵母基因工程技术进行基因表达，主要受到以下因素的影响：1、酵母细胞和外源DNA的适应性：外源DNA序列与酵母细胞基因组的适应程度越高，在其整合过程中的成功率就越高。

2、DNA浓度和转化技术：转化DNA的浓度和质量对重组的成功率和效率具有很大的影响，因此DNA的提取方法和转化技术必须严格控制。

3、选择标记：选择标记是用于筛选欲表达基因转化体的标记物质。

在基因工程中，一般会选择具有抗性基因、荧光素酶等作为筛选标记物质。

总之，酵母同源重组技术是一种很重要的基因工程技术，它结合了酵母生物的优越性，可以实现外源基因的高效表达，并且具有特异性与背景低噪声等特点，因此在微生物学研究、基因治疗和生物制药等领域中得到了广泛应用。

酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上，20世纪90年年代中期又发展起来的--用于核酸和文库蛋白之间的研究。

在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。

将已知的特定顺式作用原件构建到最基本启动子（Pmin）上游，把报告基因连接到Pmin下游。

编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够和顺式作用原件结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。

转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子Pmin，使报告基因表达，若连接如3个以上顺式作用元件，可增强转录因子的识别和结合效率。

优点：简单易行，无需分离纯化蛋白，酵母菌属于真真核生物，杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象克服了体外研究时蛋白通常处于非自然构象的缺点，因而灵敏性很高。

缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报道基因的转录，因而存在假阳性结果。

如果酵母表达的AD杂合蛋白对细胞有毒性或者融合蛋白在宿主细胞内不能稳定的表达，或者融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于细胞核内，以及融合的GAL4-AD封闭了蛋白上与DNA作用的位点则都可能干扰AD杂合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性的结果。

酵母单杂交系统应用：1. 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因，目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面。

Chew et al（1999）应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质GRIK5基因的内含子结合蛋白。

2. 对DNA结合结构域进行分析如果能得到DNA结合结构域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析.Mak et al（1996）运用此技术测试哺乳动物具有基本的螺旋- 环- 螺旋(bHLH)结构的转录因子,通过对肌调节因子4(MRF4)的研究，证实其具有转录活性。