质粒DNA的提取鉴定

质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

质粒DNA的提取一、原理采用碱变性法抽提取质粒DNA。

该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。

在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。

而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。

2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。

反复数次，收集全部菌体。

3.倾去上清，滤纸吸干。

4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。

5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。

6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。

7.上清液转移至另一微离心管中，加等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。

8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。

9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。

10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。

lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。

12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。

质粒DNA纯度检测方法及注意事项确定提取的质粒DNA纯度可以通过以下几种方法：
1.紫外吸收检测：由于核酸和蛋白质的吸收光谱特性不同，可以利用紫外分
光光度计测量DNA样品在260nm和280nm波长下的吸光度值。

纯净的DNA其A260/A280的比值应该接近1.8。

若比值高于1.8，则可能意味着DNA样品中的RNA未完全去除。

比值低于1.8可能说明样品中含有酚类或蛋白质。

同时，如果在270nm存在高吸收，这可能表明有酚的干扰。

2.琼脂糖凝胶电泳：可以使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入EB（溴化
乙锭）染料。

电泳结束后，在紫外灯下观察DNA条带的亮度和清晰度。

纯净的质粒DNA应该显示出清晰、单一的条带。

如果观察到多条带或模糊的条带，这可能意味着样品中存在RNA、蛋白质或其他杂质。

3.荧光分光光度法：对于浓度较低的DNA样品，可以使用荧光分光光度法来
测量DNA的浓度和纯度。

这种方法通常比紫外吸收法更灵敏，可以检测更低浓度的DNA。

需要注意的是，以上方法只能提供关于DNA纯度的间接信息。

为了确保DNA的纯度，最佳的做法是结合多种方法进行分析，并在可能的情况下，通过进一步的实验（如克隆、测序等）验证DNA的质量。

质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。

质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。

提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。

本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。

实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。

2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。

步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。

2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。

步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。

不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。

2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。

3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。

不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。

4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。

步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。

2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。

步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。

2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。

质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。

2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。

二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。

在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。

从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。

碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。

在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。

在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。

在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。

因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。

增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。