质粒DNA的提取和鉴定

质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

质粒DNA的提取与鉴定实验报告引言质粒DNA的提取与鉴定是分子生物学实验中常用的技术之一。

质粒DNA是一种圆形的DNA分子，广泛存在于细菌和真核生物中。

提取和鉴定质粒DNA能够帮助研究人员进行基因克隆、基因表达调控等实验。

本实验旨在介绍质粒DNA的提取与鉴定步骤，以供初学者了解和学习。

实验材料•细菌培养物•质粒DNA提取试剂盒•去离子水• 1.5 mL离心管•微量离心管•离心机实验步骤步骤一：培养细菌并收获培养物1.取一支含有目标质粒的细菌培养物，将其接种至含有适当抗生素的培养基中。

2.在37℃恒温摇床上培养过夜，确保细菌得到充分生长。

步骤二：收获细菌培养物1.将培养基离心机中以12000转/分钟离心2分钟，以沉淀细菌细胞。

2.弃去上清液，将细菌细胞沉淀保留在离心管中。

步骤三：质粒DNA的提取1.选择一款质粒DNA提取试剂盒，按照说明书中的步骤操作。

不同试剂盒所用方法有所差异，详细操作请参照试剂盒说明书。

2.在质粒DNA提取试剂盒提供的试剂中加入细菌细胞，充分混合。

3.通过离心将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。

不同试剂盒所用离心条件有所不同，一般为高速离心1-3分钟。

4.弃去上清液，留下含有裂解细胞的混悬液。

步骤四：质粒DNA的纯化1.将质粒DNA混悬液转移到新的离心管中。

2.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

3.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

4.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

5.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

6.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

7.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

8.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

9.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

10.加入适量的洗涤缓冲液，充分混合。

11.通过离心将质粒DNA沉淀，弃去上清液。

12.使用去离子水溶解沉淀的质粒DNA，使其浓度适宜。

步骤五：质粒DNA的鉴定1.使用紫外可见光分光光度计测定溶解后的质粒DNA的浓度。

2.准备一份对照组，即只含有去离子水的样品。

质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。

2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。

二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。

在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。

从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。

碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。

在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。

在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。

在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。

因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。

增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。

质粒DNA的提取与鉴定实验日期 2020.5.14 室温 25℃成绩实验报告摘要实验目的：①掌握质粒提取原理和各种试剂的使用②掌握琼脂糖凝胶电泳原理和方法实验方法：琼脂糖凝胶电泳法实验结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图获得三条带，从近到远分别为开环状DNA；线状DNA；超螺旋状DNA实验结论：碱性裂解法可以从大肠埃希菌中提取到质粒DNA实验原理1、质粒是独立存在于染色体，能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。

2、细菌质粒是应用最多的质粒群体，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA。

3、对数期菌体：具有质粒的大肠埃希菌。

4、溶液 I 充分重悬：50 mmol／L 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

25 mmol／L Tris-HC1(pH 8.0) ：维持PH。

10 mmol／L EDTA(pH 8.0)：二价金属离子的螯合剂、消除游离Mg2+等二价金属离子,抑制DNA酶的活性。

5、溶液II裂解：0.2 mol／L NaOH:主要作用溶解细胞，释放DNA；l％ SDS:阴离子去垢剂。

作用：既能裂解细菌细胞膜，又能使细菌蛋白质变性。

质粒DNA具有特定的形态结构，在特殊环境下，如加热、极端PH等，能变性。

SDS处理细菌细胞能导致细菌细胞壁破裂，释放质粒DNA和细菌基因组DNA。

6、溶液III中和：5 mol／L 醋酸钾：使钾离子置换SDS中的钠离子，形成PDS（十二烷基硫酸钾）。

因为SDS遇到钾离子后变成PDS，而PDS是不溶于水，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。

冰乙酸：中和NaOH。

去除变性条件后，质粒DNA能复性，在加入强碱NaOH后，通过酸性的醋酸钾中和碱性溶液，质粒DNA便能迅速复性。

需要注意，染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性，所以，离心后，能将质粒DNA留在上清中，染色体DNA则和细胞碎片一起沉淀在离心管底部。

质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。

2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。

常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。

本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。

步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。

2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。

3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。

4. 加入溶解剂，使细胞溶解。

5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。

6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。

7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。

3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。

2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。

3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。

3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。

2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。

3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。

3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。

2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。

3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。

2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。

3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。

2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。

3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。

3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。

2.将上清液倒出，保留下沉淀。

3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。

2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。

4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。

质粒DNA的提取和鉴定背景资料如下：质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。

所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。

释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。

然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。

离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。

通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。

（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。

一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。

（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。

实验的准备：一、器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二、试剂LB液体培养基（100ml），2个三角瓶√50ml离心管10ml离心管1.溶液Ⅰ√（右冰箱上层）50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0（50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2 ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）（右冰箱下层）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。

四川大学实验报告题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。

2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。

目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。

噬菌体、M133.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。

4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0) 作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性1 / 9四川大学实验报告（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。

大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。

5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。

质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。

二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。

提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。

鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。

三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。

四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。

五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。

根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。

六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。

同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。

通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。