实验五阳性克隆鉴定和质粒DNA的提取

实验二阳性克隆的筛选与鉴定、质粒DNA的提取（5学时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的筛选与鉴定方法。

二、实验原理：1、蓝白斑筛选原理2、碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。

三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、羧苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶四、实验步骤1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。

2、取过夜培养的菌液2mL加入离心管中，4000r/min离心1min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在离心管中。

（每组至少做6管）3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的离心管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。

4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。

5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。

冰上放置15min让质粒DNA复性(千万不可用旋涡震荡器)。

6、12000r/min离心10min，将上清转至另一个离心管中。

简述基因的克隆和表达的步骤1）获得目的基因和质粒载体；2）形成重组质粒；3）制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4）培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5）筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定；6）表达目的蛋白。

实验一：质粒DNA的提取及鉴定1.分子生物学实验常用载体有哪些?它们的特点是什么?常用载体：大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒、酵母人工染色体载体、动植物病毒载体。

特点：具有复制子（一段具特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制）、可检测的遗传表型、限制性内切酶单一识别位点（便于外源基因插入）、适合的拷贝数（有利于载体制备；使细胞中克隆基因的剂量增加）2.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些异同点？相同：提取的步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解。

不同：质粒提取过程中，有一个DNA变性、复性的过程，这个与基因组提取完全不同，这是利用质粒是以超螺旋结构存在于大肠杆菌中的特殊状态，分离纯化质粒时总是会利用这个特点来分离基因组DNA与质粒DNA。

3.核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？1）酚、氯仿作用是变性蛋白质。

酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。

所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。

实验8 质粒DNA的提取（碱裂解法）一、实验目的了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。

二、实验原理碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。

碱性（pH 12.0~12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。

当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。

三、仪器设备微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。

振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。

四、实验试剂（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。

4 ℃贮存。

（2）溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。

（3）溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。

（4）RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。

五、实验方法（1）分装3 mL LB液体培养基和3 μL氨苄青霉素（50 mg/mL）于15 mL玻璃试管中。

（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置37 ℃恒温摇床中以200转/min培养，至OD600=2.0。

一、实验目的1. 了解创新基因的概念和重要性；2. 掌握基因克隆和测序技术；3. 探索创新基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面的应用。

二、实验原理创新基因是指在生物进化过程中，由于基因突变、基因重组等原因产生的具有新功能或新性状的基因。

通过基因克隆和测序技术，可以筛选出具有创新性的基因，为生物科学研究提供新的思路和材料。

三、实验材料1. 基因组DNA；2. 克隆载体；3. 限制性内切酶；4. DNA连接酶；5. T4 DNA聚合酶；6. Taq DNA聚合酶；7. DNA测序试剂盒；8. 实验试剂和仪器。

四、实验步骤1. 基因克隆（1）提取基因组DNA，并用限制性内切酶进行酶切；（2）将酶切后的基因组DNA与克隆载体连接；（3）将连接产物转化大肠杆菌；（4）挑取阳性克隆，进行菌落PCR鉴定。

2. 基因测序（1）提取阳性克隆的质粒DNA；（2）进行PCR扩增目的基因；（3）将扩增产物进行测序。

3. 数据分析（1）将测序结果进行比对分析，确定目的基因序列；（2）分析目的基因的生物学功能，如表达模式、蛋白质结构等；（3）探讨目的基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面的应用。

五、实验结果与分析1. 成功克隆目的基因，获得阳性克隆；2. 通过测序，获得目的基因序列；3. 分析目的基因序列，发现其具有创新性；4. 研究发现，目的基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面具有潜在的应用价值。

六、实验结论通过本实验，成功寻找并克隆了具有创新性的基因，为生物科学研究提供了新的思路和材料。

实验结果表明，创新基因在生物体生长发育、疾病治疗等方面具有潜在的应用价值。

七、实验讨论1. 基因克隆和测序技术在寻找创新基因过程中具有重要作用；2. 创新基因的研究有助于揭示生物体的生长发育、疾病治疗等生物学现象；3. 创新基因的研究为生物制药、农业等领域提供了新的材料。

八、实验展望1. 深入研究创新基因的生物学功能，为生物科学研究提供新的理论依据；2. 开发基于创新基因的生物药物，为疾病治疗提供新的手段；3. 推动创新基因在农业、环保等领域的应用，促进我国生物科技产业的发展。

分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。

二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。

三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。

超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

一、实验目的1. 学习和掌握基因克隆的基本原理和操作步骤。

2. 掌握质粒DNA的提取、目的基因的扩增、重组质粒的构建和转化等分子生物学实验技术。

3. 熟悉阳性克隆的筛选和鉴定方法。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA分子中，构建成重组DNA分子，并通过转化宿主细胞使目的基因在宿主细胞内表达。

本实验采用PCR技术扩增目的基因，通过限制性内切酶将目的基因和载体DNA切割成相应的黏性末端，然后将目的基因片段插入到载体DNA分子中，构建成重组质粒。

最后，将重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞，筛选出含有目的基因的阳性克隆。

三、实验材料与仪器1. 材料：- 大肠杆菌菌株（如DH5α）- 质粒载体（如pUC19）- 目的基因DNA模板- 限制性内切酶（如EcoRI、HindIII）- DNA连接酶（如T4DNA连接酶）- 转化试剂- 抗生素（如氨苄青霉素）- 培养基（如LB培养基）2. 仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 电泳仪- 真空离心机- 显微镜四、实验步骤1. 目的基因的扩增：- 设计引物，根据目的基因序列设计特异性引物。

- 进行PCR扩增，将目的基因DNA模板与引物混合，在PCR仪中进行扩增。

2. 质粒DNA的提取：- 使用质粒提取试剂盒或碱裂解法提取质粒DNA。

3. 限制性内切酶酶切：- 将目的基因DNA和质粒载体分别用相应的限制性内切酶进行酶切。

4. DNA连接：- 将酶切后的目的基因DNA片段和质粒载体混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。

5. 重组质粒的转化：- 将连接产物转化大肠杆菌宿主细胞，常用热击法或电穿孔法。

6. 阳性克隆的筛选：- 将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜。

- 从平板上挑取单菌落进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。

7. 阳性克隆的鉴定：- 对阳性克隆进行酶切鉴定，确认重组质粒是否构建成功。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：- 通过PCR扩增，成功扩增出目的基因片段。

第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。

二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。

本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。

三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。

2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。

四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。

（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。

2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。

（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。

3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。

（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。

4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。

（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。

5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。

（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。

（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。

分子生物学实验教案第一部分茶树CBF基因的克隆实验一目标基因的5’-末端的PCR扩增、3’-末端的PCR扩增一、实验目的通过本实验学习和掌握用RACE方法扩增cDNA的5’-末端和3’-末端的方法和技术。

二、实验原理1. 聚合酶链反应的原理聚合酶链反应（the polymerase chain reaction, PCR）是一种在模拟DNA复制反应的基础上对一个DNA分子某一特定区域进行选择性扩增的方法。

DNA分子上任何一个区域，只要它两端的序列是已知的，都可以利用PCR进行特异性扩增，获得大量的扩增产物。

PCR反应体系包括：①模板：其上待扩增的序列称为靶序列；②一对特异性引物：它们是人工合成的10 ~ 30个核苷酸长的单链DNA片段，与靶序列的两端互补；③耐热DNA聚合酶：用于延伸引物合成DNA，PCR反应中常用的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶；④四种脱氧核糖核苷三磷酸：dATP、dGTP、dCTP和dTTP是DNA合成的前体分子。

PCR实验的基本步骤如下：①高温变性：反应混合物被加热到94℃，在该温度下，DNA 双螺旋两条链之间的氢键被打断，DNA分子发生变性；②低温退火：当温度降低时，引物与单链模板杂交；③适温延伸：退火后，温度又被升高到了72℃，这是Taq DNA聚合酶的最适工作温度，Taq DNA聚合酶延伸引物合成与模板互补的新链。

这三步构成一个循环，接下来温度又被升到94℃，双链DNA分子又变性成为单链，于是便开始了第二轮变性－退火－延伸的循环（图1-1）。

由于每一次循环的产物都可以作为下一次循环反应的模板，通常经过25 ~ 30次后，被扩增的DNA片段可以达到几百万个拷贝。

2. RACE技术的原理以4℃处理24 h的茶树幼叶为材料，利用SMART cDNA synthesis Kit构建了SMART cDNA文库。

首先以3' SMART™ CDS Primer II A为引物，以RNA为模板合成第一链cDNA。

第1篇一、实验目的本实验旨在学习并掌握克隆基因提取的基本原理和操作步骤，通过实验操作，提取目的基因，为后续的基因克隆、表达和功能研究奠定基础。

二、实验原理克隆基因提取主要利用DNA提取技术，通过破碎细胞、释放DNA、去除杂质等步骤，得到高纯度的DNA。

本实验采用碱裂解法提取目的基因，该方法具有操作简单、提取效率高、DNA纯度好等优点。

三、实验材料1. 实验试剂：NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、无水乙醇、异丙醇、二苯胺染液、DNA提取试剂盒等。

2. 实验仪器：高速离心机、电子天平、移液器、PCR仪、凝胶成像系统等。

3. 实验样品：目的基因载体（含目的基因）、细菌菌液等。

四、实验步骤1. 细菌培养：将目的基因载体转化至大肠杆菌，挑取单克隆菌落，接种于含有适量抗生素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养过夜。

2. 酵母提取物制备：将过夜培养的菌液按1:100比例稀释，加入酵母提取物、葡萄糖等，37℃、200 r/min培养至对数生长期。

3. 细菌裂解：将培养好的菌液按照1:10比例加入裂解液，55℃水浴30 min，期间每隔5 min振荡1次，使菌体充分裂解。

4. DNA沉淀：将裂解液按照1:2比例加入等体积的异丙醇，混匀，4℃、12 000r/min离心10 min，弃上清液。

5. DNA洗涤：将沉淀用70%乙醇洗涤1次，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清液。

6. DNA溶解：将沉淀用适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。

7. DNA纯化：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到高纯度的目的基因。

8. 验证：将提取的目的基因进行PCR扩增，观察扩增结果，确认目的基因提取成功。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得目的基因，扩增产物大小与预期相符。

2. DNA纯度：利用NanoDrop2000检测提取的目的基因，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。

一、实验目的1. 掌握基因重组的基本原理和方法；2. 熟悉基因重组实验的操作步骤；3. 通过实验，了解基因重组在遗传学研究和育种中的应用。

二、实验原理基因重组是指在生物体进行有性生殖过程中，控制不同性状的基因的重新组合。

基因重组是生物变异的重要来源之一，对生物的进化具有重要意义。

基因重组主要有两种类型：同源重组和非同源重组。

同源重组是指两个同源染色体上的相应位点发生交换，导致基因的重新组合。

非同源重组是指非同源染色体上的相应位点发生交换，导致基因的重新组合。

本实验采用同源重组的方法，以大肠杆菌为实验材料，通过构建重组质粒，观察重组质粒的筛选和鉴定。

三、实验材料1. 大肠杆菌菌株：E. coli DH5α；2. 质粒载体：pUC19；3. 酶切酶：限制性内切酶EcoRI、HindIII；4. DNA连接酶；5. 载体DNA和目的基因DNA；6. 感受态细胞；7. 抗生素；8. 培养基；9. 其他试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、氢氧化铵等。

四、实验步骤1. 构建重组质粒（1）将目的基因DNA和载体DNA分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切；（2）将酶切后的目的基因DNA和载体DNA连接；（3）将连接产物转化感受态细胞；（4）在含有抗生素的培养基上筛选阳性克隆。

2. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA；（2）用限制性内切酶EcoRI和HindIII对质粒DNA进行酶切；（3）观察酶切后的质粒DNA是否与预期结果一致。

3. 重组质粒的测序（1）将阳性克隆的质粒DNA进行测序；（2）分析测序结果，验证重组质粒的正确性。

五、实验结果与分析1. 阳性克隆的筛选在含有抗生素的培养基上，成功筛选到阳性克隆。

2. 阳性克隆的鉴定通过酶切实验，验证阳性克隆的质粒DNA与预期结果一致。

3. 重组质粒的测序测序结果显示，重组质粒与预期基因序列一致，验证了实验的成功。

六、实验结论本实验通过基因重组技术，成功构建了重组质粒。

一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因插入到载体质粒中，并通过转化大肠杆菌，筛选出含有目的基因的阳性克隆。

具体步骤包括：质粒提取、DNA片段的扩增、质粒与DNA片段的连接、转化大肠杆菌、阳性克隆的筛选与鉴定。

二、实验材料1. 仪器设备：- 离心机- PCR仪- 紫外分光光度计- 电泳仪- 热浴箱- 离心管- 研钵- 移液器- 平板培养箱2. 试剂：- 质粒提取试剂盒- DNA提取试剂盒- PCR试剂- DNA连接酶- 转化试剂- 抗生素（氨苄青霉素、四环素等）- 培养基（LB、固体LB培养基等）- 其他常用试剂（如：DNA酶、RNA酶、缓冲液等）3. 实验材料：- 目的基因片段- 载体质粒- 大肠杆菌菌株（如DH5α）三、实验方法1. 质粒提取：使用质粒提取试剂盒，按照说明书提取含有目的基因的质粒。

2. DNA片段的扩增：采用PCR技术，以目的基因片段为模板，扩增目的基因。

3. 质粒与DNA片段的连接：将PCR产物与载体质粒进行连接反应，构建重组质粒。

4. 转化大肠杆菌：将连接好的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中。

5. 阳性克隆的筛选：- 培养液筛选：将转化后的菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，培养过夜。

- 蓝白斑筛选：观察菌落颜色，白色菌落可能为含有目的基因的阳性克隆。

- 抗生素平板筛选：将白色菌落接种到含有氨苄青霉素和四环素的LB固体培养基上，培养过夜，验证菌落是否具有抗生素抗性。

6. 阳性克隆的鉴定：- 酶切鉴定：将白色菌落提取质粒，进行酶切反应，电泳检测酶切产物。

- PCR鉴定：将白色菌落提取质粒，进行PCR反应，检测目的基因是否存在。

四、实验结果1. 质粒提取：成功提取出含有目的基因的质粒。

2. DNA片段的扩增：PCR产物在预期位置出现特异性条带。

3. 质粒与DNA片段的连接：连接反应成功，转化大肠杆菌。

4. 阳性克隆的筛选：- 培养液筛选：成功筛选出白色菌落。

基因克隆实验报告一、实验目的基因克隆是分子生物学研究中的重要技术手段，本次实验旨在通过克隆特定基因，深入理解基因克隆的原理和方法，掌握相关实验操作技能，并获得目的基因的克隆产物。

二、实验原理基因克隆的基本原理是利用限制性内切酶将目的基因从基因组DNA 中切割出来，然后将其连接到合适的载体上，形成重组 DNA 分子。

再将重组 DNA 分子转化到宿主细胞中，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的克隆细胞。

三、实验材料与设备（一）材料1、含目的基因的基因组 DNA 样本。

2、限制性内切酶、DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶缓冲液。

3、载体（如质粒）。

4、感受态细胞（如大肠杆菌）。

5、琼脂糖、琼脂糖凝胶电泳缓冲液。

6、 DNA 分子量标准。

（二）设备1、恒温培养箱。

2、离心机。

3、移液器。

4、电泳仪。

5、紫外透射仪。

四、实验步骤（一）目的基因的获取使用限制性内切酶对含目的基因的基因组 DNA 进行酶切，使其产生与目的基因大小相符的片段。

（二）载体的制备选择合适的载体（如质粒），同样用限制性内切酶进行切割，使其具有与目的基因相匹配的粘性末端。

（三）连接反应将酶切后的目的基因片段与切割后的载体在 T4 DNA 连接酶及缓冲液的作用下进行连接，形成重组 DNA 分子。

（四）转化将重组 DNA 分子加入到感受态细胞中，通过热激等方法促进其进入细胞。

（五）筛选与鉴定1、抗性筛选：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的培养基上，只有含有重组质粒的细胞才能生长。

2、菌落 PCR 鉴定：挑取单菌落进行 PCR 扩增，检测是否含有目的基因。

（六）DNA 提取与电泳检测从鉴定为阳性的菌落中提取质粒 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因的大小和纯度。

五、实验结果（一）抗性筛选结果在含有抗生素的培养基上观察到了部分菌落生长，初步判断这些菌落可能含有重组质粒。

（二）菌落 PCR 鉴定结果对挑取的菌落进行 PCR 扩增后，经琼脂糖凝胶电泳分析，部分菌落出现了与目的基因预期大小相符的条带，表明这些菌落中含有目的基因。

第1篇一、实验背景本次实验是在我国某高校生物实验室进行的，旨在探究生物技术在基因工程领域的应用。

通过实验，了解基因工程的基本原理、操作方法以及在实际应用中的优势。

实验过程中，我们学习了DNA提取、PCR扩增、DNA连接、转化等关键技术，并成功构建了基因表达载体。

二、实验目的1. 掌握基因工程的基本原理和操作方法。

2. 熟悉DNA提取、PCR扩增、DNA连接、转化等关键技术。

3. 通过实验，了解基因工程在生物技术领域的应用前景。

三、实验内容1. DNA提取实验采用酚-氯仿法提取大肠杆菌DNA，通过离心、洗涤、溶解等步骤，获得纯净的DNA。

2. PCR扩增以提取的DNA为模板，设计特异性引物，进行PCR扩增。

通过优化反应条件，获得高质量的扩增产物。

3. DNA连接将PCR扩增产物与载体连接，构建基因表达载体。

实验中采用T4 DNA连接酶进行连接反应。

4. 转化将构建好的基因表达载体转化到受体细胞中，通过抗生素筛选，获得阳性克隆。

5. 阳性克隆的鉴定通过PCR、酶切等手段，对阳性克隆进行鉴定，确保基因表达载体构建成功。

四、实验结果与分析1. DNA提取通过酚-氯仿法提取大肠杆菌DNA，电泳结果显示DNA条带清晰，表明DNA提取成功。

2. PCR扩增PCR扩增产物经电泳检测，可见特异性条带，表明扩增成功。

3. DNA连接DNA连接反应产物经电泳检测，可见与载体大小相近的条带，表明连接成功。

4. 转化通过抗生素筛选，获得阳性克隆。

PCR鉴定结果显示，阳性克隆中含有目的基因。

5. 阳性克隆的鉴定通过PCR、酶切等手段，对阳性克隆进行鉴定，结果与预期相符，表明基因表达载体构建成功。

五、实验讨论1. 实验过程中，DNA提取、PCR扩增、DNA连接等步骤对实验结果至关重要。

在操作过程中，应严格按照实验步骤进行，确保实验结果的准确性。

2. 实验过程中，可能存在DNA降解、PCR扩增效率低等问题。

为提高实验成功率，可优化实验条件，如调整反应体系、反应时间等。

第1篇一、实验目的1. 学习分子生物学中最基本的技术——分子克隆的操作过程。

2. 掌握基因克隆的概念，了解基因克隆的基本原理和方法。

3. 熟练掌握DNA提取、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定等分子克隆实验操作。

4. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。

二、实验原理分子克隆是指将目的基因（或DNA片段）与载体DNA连接，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。

本实验采用分子克隆组装技术，将目的基因插入载体中，实现基因克隆。

三、实验材料1. 基因组DNA提取试剂盒2. 限制性内切酶3. DNA连接酶4. 载体DNA5. 目的基因片段6. 转化宿主细胞7. LB培养基、琼脂糖、氨苄青霉素等四、实验步骤1. 提取目的基因片段和载体DNA（1）取适量基因组DNA，按照试剂盒说明书进行提取。

（2）取适量载体DNA，按照试剂盒说明书进行提取。

2. 限制性内切酶切割（1）将目的基因片段和载体DNA分别用限制性内切酶进行切割。

（2）酶切反应体系：10×酶切缓冲液5μl，限制性内切酶1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至50μl。

（3）酶切条件：37℃反应2小时。

3. DNA连接（1）将酶切后的目的基因片段和载体DNA进行连接。

（2）连接反应体系：10×连接缓冲液5μl，DNA连接酶1μl，酶切后的目的基因片段5μl，酶切后的载体DNA5μl，加双蒸水至50μl。

（3）连接条件：16℃反应4小时。

4. 转化宿主细胞（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

（2）转化条件：42℃热激45秒。

5. 筛选和鉴定（1）将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。

（2）挑取单克隆菌落，提取质粒DNA。

（3）对提取的质粒DNA进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体。

（4）对阳性克隆进行测序，验证插入序列的正确性。

五、实验结果1. 成功提取目的基因片段和载体DNA。

2. 目的基因片段和载体DNA经限制性内切酶切割后，酶切图谱与预期相符。

一、实验目的1. 学习基因重组的基本原理和实验操作方法。

2. 掌握质粒DNA的提取、纯化、酶切、连接、转化等实验技术。

3. 验证基因重组是否成功。

二、实验原理基因重组是指将一个或多个外源基因导入宿主细胞内，使其在宿主细胞中表达的过程。

本实验采用重组DNA技术，将目的基因（如荧光素酶基因）与载体质粒（如pUC19）连接，通过转化将重组质粒导入大肠杆菌，筛选出含有目的基因的转化子，并通过荧光素酶活性检测验证基因重组是否成功。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 大肠杆菌菌株（如DH5α）- 质粒载体（如pUC19）- 目的基因片段（如荧光素酶基因）- 限制性核酸内切酶（如EcoRI、XhoI）- DNA连接酶（如T4 DNA连接酶）- 转化试剂（如CaCl2）- 荧光素酶检测试剂盒- LB培养基、琼脂糖、凝胶电泳试剂等2. 实验试剂：- 10×TE缓冲液- 10×限制性核酸内切酶缓冲液- 10×DNA连接酶缓冲液- 10×DNA聚合酶缓冲液- dNTPs- DNA聚合酶- 琼脂糖- 10×Loading buffer- DNA marker四、实验步骤1. 质粒DNA的提取与纯化：- 采用碱裂解法提取质粒DNA。

- 通过乙醇沉淀和离心纯化质粒DNA。

2. 目的基因的扩增：- 以质粒DNA为模板，利用PCR技术扩增目的基因片段。

3. 限制性核酸内切酶酶切：- 将质粒DNA和目的基因片段分别用EcoRI和XhoI进行酶切。

- 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

4. DNA连接：- 将酶切后的质粒DNA和目的基因片段进行连接。

- 通过T4 DNA连接酶将连接产物在16℃下连接过夜。

5. 转化：- 将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。

- 在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养转化子。

6. 阳性克隆筛选：- 将转化子涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜。

一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。

2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。

3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。

4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。

5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。

2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。

四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。

2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。

3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。

4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。

5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。

第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。

2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。

3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。

二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。

通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。

三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。

（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。

2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。

（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。

3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。

（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。

（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。

5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。

（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。

（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。

五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。

2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。

3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。