提取淋巴细胞流程

/bbs/topic/791076?keywords=淋巴细胞分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。

现在大多数用的密度梯度离心法。

一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。

现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。

我的经验1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。

4. 离心 .转速：1500/分温度20c －28c时间：20分钟no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞层又弄混了，加速度也最好不要太大)5。

取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。

还有办法的。

8 离心。

转速：2000－2300/分（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！)时间：10分钟温度：4c9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）10.细胞计数＋洗涤细胞。

刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。

这样是不是很节省时间？？11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。

封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程一、引言淋巴细胞作为机体免疫系统的重要组成部分，具有重要的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功能。

因此，对淋巴细胞的提取和分离工作具有重要的研究意义。

在淋巴细胞的提取中，由于血浆与血红细胞的存在会对淋巴细胞的获取造成一定的干扰。

因此，要达到对淋巴细胞的高效提取，需要采取一系列的实验步骤和具体操作。

本文将对抗体阴性淋巴细胞提取流程进行详细介绍。

二、实验前准备1.1实验材料准备- Ficoll-PaqueTM Plus（细胞分离介质）- PBS（磷酸盐缓冲盐水）-血样- 10% PBS-蒸馏水1.2实验仪器准备-离心机-定速摇床或转速可调摇床-干燥箱-显微镜三、实验步骤2.1血样处理将血样加入培养皿中，使用相等量的PBS进行稀释。

然后缓慢地将血样混合，加入Ficoll-PaqueTM Plus细胞分离介质，并进行离心分离。

2.2离心分离淋巴细胞在培养皿中离心分离血样，分离过程中将产生三个层次：上层为血浆、中层为Paque介质混合液，下层为红细胞。

使用无菌吸头吸取中层细胞分离介质中的淋巴细胞，放入新的离心管中，加入PBS缓冲液，并进行第二次离心。

2.3清洗淋巴细胞将混合液倒入新的离心管中，加入PBS进行清洗，然后进行第三次离心。

将洗涤后的混合液分装至新的含有PBS的离心管中，加入PBS 至适量。

2.4定速摇床培养将含有PBS的离心管置于定速摇床中，培养2-3小时，温度为37°C。

培养结束后，用显微镜观察淋巴细胞是否完整。

2.5抗体阴性淋巴细胞识别与提取将培养后的淋巴细胞离心，去除PBS，加入10% PBS进行混合，然后进行第四次离心。

将产生的沉淀液中的淋巴细胞加入10% PBS中，进行细胞计数，计算淋巴细胞的浓度。

2.6细胞提取根据实验需要，进行对抗体阴性淋巴细胞的提取。

根据实验目的和具体情况，可以采用不同的提取方法，比如磁珠法、流式细胞术等。

通过相应的实验方法，可以实现对抗体阴性淋巴细胞的提取。

淋巴细胞分离的原理
淋巴细胞分离的原理主要是利用淋巴细胞在密度梯度离心中的沉降速率差异进行分离。

淋巴细胞是一种低密度细胞，其密度约为1.06 g/ml，而其他血液细胞如红细胞、粒细胞等的密度
均大于1.06 g/ml，因此可以通过离心来分离淋巴细胞。

具体操作步骤如下：
1. 采集血液样品，一般可采用外周血样品，例如静脉采血。

2. 转移血液样品至离心管中，离心管中需要加入离心介质，常用的有Ficoll或Percoll等。

3. 轻轻混合血液与离心介质，以确保均匀混合。

4. 放入离心机，进行离心。

离心过程中，血液样品会在离心介质形成的密度梯度中逐渐分层。

5. 离心结束后，离心管中会分为不同层次的组分。

上层为清澈的血浆层，中间为若干个白色或黄色的细胞层，其中最上面一个细胞层即为淋巴细胞层。

6. 使用移液器将淋巴细胞层吸取出来，转移至另一个离心管中。

7. 加入适当的洗涤缓冲液，如PBS，进行洗涤。

洗涤缓冲液
的作用是去除离心介质残留和其他杂质。

8. 离心再次沉淀淋巴细胞，并倒掉上清液。

9. 加入适量的培养液，使淋巴细胞得到适当的营养和环境，以维持其存活和生长。

通过以上步骤，可以将淋巴细胞从血液中分离出来，并得到较为纯净的淋巴细胞样本，便于后续实验和研究的进行。

一、实验目的本实验旨在学习淋巴细胞提取的方法，掌握淋巴细胞的分离、纯化和计数技术，为后续的淋巴细胞功能研究奠定基础。

二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的一种重要细胞，主要存在于血液和淋巴组织中。

本实验采用Ficoll分离液法，根据不同细胞密度的差异，将淋巴细胞从其他细胞中分离出来。

三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠2. 仪器：离心机、移液器、加样器、离心管、无菌操作台、眼科剪、眼科镊、显微镜、计数板3. 试剂：Ficoll分离液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、淋巴细胞分离液、75%酒精、无菌生理盐水、10%甲醛固定液四、实验方法1. 小鼠免疫器官分离（1）将小鼠麻醉后，固定在手术台上；（2）用眼科剪剪开小鼠的腹部皮肤，暴露出腹腔；（3）用眼科镊取出小鼠的脾脏，放入装有PBS的无菌皿中；（4）用眼科剪将脾脏剪成小块，放入装有PBS的无菌皿中；（5）用无菌生理盐水冲洗脾脏，去除杂质；（6）将脾脏组织转移至新的无菌皿中，加入淋巴细胞分离液；（7）用移液器将淋巴细胞分离液和脾脏组织充分混合；（8）将混合液转移到离心管中，以1000rpm离心10分钟；（9）弃去上清液，保留沉淀物。

2. 淋巴细胞分离（1）将沉淀物加入适量的淋巴细胞分离液，轻轻混合；（2）将混合液转移到新的离心管中，以1000rpm离心10分钟；（3）弃去上清液，保留沉淀物。

3. 淋巴细胞计数（1）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（2）将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察；（3）按照计数板上的网格进行细胞计数。

4. 淋巴细胞纯度鉴定（1）将计数后的淋巴细胞加入适量的10%甲醛固定液，固定10分钟；（2）用PBS洗涤固定后的淋巴细胞，去除甲醛；（3）将淋巴细胞加入适量的细胞染色剂，染色30分钟；（4）用PBS洗涤染色后的淋巴细胞，去除染色剂；（5）将淋巴细胞转移到离心管中，以1000rpm离心5分钟；（6）弃去上清液，保留沉淀物；（7）将沉淀物加入适量的PBS，轻轻混合；（8）用移液器将混合液转移到计数板上，在显微镜下观察淋巴细胞形态，判断淋巴细胞纯度。

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

一、采集血样，室温保存。

使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。

一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为2-5ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。

二、提取淋巴细胞。

在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，在装有2ml血样的真空管中加入2mlPBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀。

然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。

（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。

1500rpm,15min,20摄氏度。

说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。

实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。

2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。

（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。

适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。

最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。

3、PBS溶液是一种平衡盐溶液，还可以用Hank’s液或生理盐水代替PBS溶液，但最常用的还是PBS溶液。

肿瘤浸润淋巴细胞提取方法
提取肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的方法主要包括以下步骤：
1. 肿瘤组织获取前准备工作：平衡培养基和Ficoll-Paque分离液至室温（18-20℃），这是因为在实验中温度会影响密度梯度分离获得的单核细胞的产率，温度过低容易出现红细胞污染，过度过高会降低淋巴细胞产量和活力。

此外，根据种属和细胞类型来选择适合的Ficoll-Paque分离液，例如Ficoll Plaque PLUS广泛用于分离人类单核细胞，小鼠的淋巴细胞密度高于人类，因此建议使用Ficoll Paque PREMIUM从小鼠肿瘤组织中分离TIL。

2. 酶工作液的配制：提前以RPMI-1640或PBS缓冲液配制10×细胞消化液并置于-20℃储存。

包括胶原酶、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶等，每种酶都有一定的工作浓度。

3. 肿瘤组织的处理：把肿瘤组织制成单细胞悬液，可用机械和酶消化法获得瘤组织的单细胞悬液。

4. 密度梯度离心法分离TIL：利用密度梯度离心法等分离纯化TIL，该方法具有简便、快速、有效等特点，且获取得细胞活力高，功能完整。

以上方法仅供参考，具体操作需要依据实验环境和条件进行调整，建议咨询专业人士获取准确信息。

封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程1.在实验室的无菌条件下，取出外周血样本。

In a sterile laboratory environment, take a peripheral blood sample.2.将外周血样本放入离心管中，轻轻旋转离心管混合均匀。

Place the peripheral blood sample in a centrifuge tube and gently mix by rotating the tube.3.将混合后的外周血样本放入离心机中，以3000 rpm离心10分钟。

Centrifuge the mixed peripheral blood sample at 3000 rpm for 10 minutes.4.取出上清液，放入新的离心管中。

Remove the supernatant and place it in a new centrifuge tube.5.向上清液中滴加等体积的PBS缓冲液，轻轻旋转混合。

Add an equal volume of PBS buffer to the supernatant and gently mix by rotating.6.将混合后的上清液＋PBS溶液放入离心机中，以3000 rpm离心10分钟。

Centrifuge the mixed supernatant + PBS solution at 3000 rpm for 10 minutes.7.取出上清液，弃渣，得到淋巴细胞。

Remove the supernatant, discard the sediment, and obtain lymphocytes.8.将淋巴细胞放入新的离心管中，加入PBS缓冲液洗涤。

Place the lymphocytes in a new centrifuge tube, and wash with PBS buffer.9.重复以上洗涤步骤2-3次，以去除残留的血液成分。

人外周血t淋巴细胞提取
人外周血T淋巴细胞提取是指从人体外周血样本中分离并纯
化T淋巴细胞的过程。

T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，具有调节免疫应答和击杀感染性病原体等功能。

通过对外周血中
T细胞的提取，可以进一步研究其功能和特性，并在免疫治疗、细胞治疗等领域应用。

人外周血T淋巴细胞提取的具体步骤包括：
1. 采集外周血样本：使用采血针或血管穿刺等方法从患者或捐赠者的外周血中取得样本。

2. 血液分离：采用离心等方法将血液分离为红细胞、白细胞和血浆等不同组分。

3. 白细胞富集：采用离心梯度离心或负选择等技术将白细胞富集到一定程度。

4. CD3阳性细胞筛选：使用单克隆抗体等与CD3表面分子结合，利用磁珠或荧光标记等方法对T细胞进行筛选，获得
CD3阳性的T细胞群体。

5. 细胞纯化：通过进一步的磁珠或荧光标记等技术，对T细
胞进行纯化，去除其他污染细胞，得到较纯的T细胞群体。

在人外周血T淋巴细胞提取的过程中，需要严格的操作和消
毒措施以确保样本的无菌和安全性。

此外，细胞提取后的T
细胞可以进一步用于细胞培养、分化、鉴定等实验操作，用于研究和治疗目的。

封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程一、引言淋巴细胞是一种重要的免疫细胞，它在免疫系统中扮演着重要的角色。

提取到高纯度的淋巴细胞可以为免疫学研究和临床治疗提供重要的实验材料。

而抗体阴性淋巴细胞提取流程就是一种常用的方法，它可以通过分离抗体阴性的淋巴细胞，得到高纯度的淋巴细胞。

本文将介绍抗体阴性淋巴细胞提取的流程和注意事项，以期为相关研究和实验提供参考。

二、实验前准备1.实验仪器和试剂准备：离心机、细胞计数板、PBS、离心管、灭菌操作台等。

2.实验安全：本实验需要在无菌条件下进行，操作者需要佩戴手套和口罩，以免污染细胞。

3.细胞来源准备：从外周血、脾脏或淋巴结中获得淋巴细胞。

三、操作流程1.细胞分离将外周血、脾脏或淋巴结组织样本放入含有PBS的离心管中，并轻轻摇动，使细胞均匀分散在PBS中。

然后使用离心机将离心管进行离心，沉淀下的细胞上清液去除。

2.红细胞裂解将红细胞裂解液加入离心管中，轻轻摇动混匀，放置室温静置5-10分钟。

3.淋巴细胞分离使用离心机将混合物进行离心，上清液去除，洗涤一次，然后将细胞沉淀上清液去除。

然后向细胞沉淀中加入PBS，并通过过滤网筛选出淋巴细胞。

4.抗体阴性淋巴细胞筛选使用细胞计数板对细胞进行计数，然后使用抗体标记的磁珠或流式细胞术进行抗体阴性淋巴细胞的筛选和提取。

四、注意事项1.操作无菌：实验中需要保持操作台面及工具无菌，以免细胞受到污染。

2.用量准确：在制备实验液和添加试剂的过程中，需要严格按照配方和用量进行操作，避免影响细胞的提取和分离。

3.避免细胞损伤：在实验过程中需要轻柔处理细胞，避免细胞受到机械或化学损伤。

五、总结抗体阴性淋巴细胞提取流程是一种常用的方法，可以用于得到高纯度的淋巴细胞。

在操作过程中需要严格遵守无菌操作和用量准确的原则，以确保实验顺利进行。

通过本文的介绍，相信读者对抗体阴性淋巴细胞提取流程有了更清晰的认识，并在相关研究和实验中能够更好地应用这一方法。