qPCR 样本处理(1)--------人外周血淋巴细胞RNA的提取方法

血液RNA提取完全可以,我曾经全血标本6个小时后分离白细胞提RNA,结果很好.因为你提的是白细胞内的RNA,因而在细胞没破损前,一般情况下不会出现RNA的降解,当你开始加TIIZOL时,你的所有器材的处理尤其重要,因而放心的做吧,本人长期从事白血病融合基因的检测，曾经使用4度保存3天的血液进行RNA提取，效果同样非常满意，目前使用的一次性耗材基本上不用DEPC水处理，只要注意规范操作，按TIIZOL说明书操作，提取的RNA 质量同样非常的高。

附上本试验室的简易操作程序：1．外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（1）外周血送检需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定，一般需要5x106单个核细胞以上)。

（2）加入等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；（3）加入5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。

（4）吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面（注意勿与淋巴细胞分离液混合）。

离心1500rpm 20min。

（5）用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC入另一离心管中。

无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清直接或加入TRIzol混匀后-70℃冻存，或直接提取RNA（可以先进行细胞计数以保证细胞数）。

2．利用Trizol的方法提取细胞总RNA（参照Invitrogen公司Trizol说明书）以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1% DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。

尽量快地进行操作，减少RNA降解。

（1）先加1ml Trizol于1×107细胞中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-10min。

（可-70℃，1月）（2）加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），剧烈震荡（vigorously）15s，室温静置2-3min。

RNA提取步骤RNA（Ribonucleic Acid，核糖核酸）是细胞中一类重要的生物大分子，承担着重要的遗传信息传递和蛋白质合成的功能。

RNA提取是研究RNA生物学功能的基础，下面是RNA提取的基本步骤。

1.样本选择和收集：样本的选择和收集是RNA提取的第一步。

样本可以是任何含有RNA的细胞、组织或体液，如细菌、真菌、动物和植物组织。

在选择样本时，应注意保持样本的完整性和纯度，以最大限度地保留RNA的完整性。

2.细胞或组织破碎：细胞或组织破碎是RNA提取的关键步骤。

破碎细胞可以释放细胞质中的RNA，并使其易于提取。

通常有以下方式实现细胞或组织的破碎：-机械破碎：使用搅拌器或超声波浸没仪等设备将细胞或组织破碎。

-化学破碎：使用化学溶解剂如含有离子的缓冲液等破碎细胞。

-酶解：使用蛋白酶等酶类分解细胞或组织。

3.细胞或组织的裂解：细胞或组织裂解是破裂细胞膜和核膜，使RNA释放出来的步骤。

细胞或组织的裂解可以采取以下方法：-物理方法：如超声波、高温或高压等。

-化学方法：如使用制备裂解液溶解膜。

-酶解法：如使用蛋白酶等酶类裂解细胞膜。

4.RNA的纯化：在RNA提取过程中，纯化RNA以消除DNA、蛋白质和其他杂质是非常重要的。

以下是常见的纯化步骤：- DNase处理：用于降解DNA并消除其对RNA的干扰。

-蛋白酶处理：用于降解蛋白质并消除其对RNA的干扰。

-异丙醇沉淀：用来沉淀RNA，将其分离出其他溶液中的杂质。

-高盐沉淀：用来消除RNA的杂质。

5. 经过上述步骤后，可以使用RNA作为后续实验的模板，如逆转录PCR（Reverse Transcription PCR）进行mRNA的合成和扩增、Northern blotting进行RNA的检测等。

在RNA提取过程中，需要注意以下几点：-提取操作应注意消除污染源，严格遵守无菌技术，避免RNA的降解和污染。

- 所有操作和提取溶液都应严格遵守操作规范，使用无RNase的耗材和试剂。

组织、细胞提取RNA步骤、方法、所需材料及RT-PCR步骤RT-PCR步骤Rt-PCR实验步骤可参考附件一、实验器具与材料1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1 ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、200μl、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）、1个125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各两个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡箔纸：2卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、75%乙醇：用无水乙醇加DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？PH：8.0蒸馏水 1000ml5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水-→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂糖冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。

QPCR步骤（1）展开全文QPCR（枪头和离心管均无RNA酶)提取细胞RNA1. 细胞长满80%，弃培养基，冰PBS洗涤细胞2次空干（用枪吸尽PBS)2. 加1ml冰TRizoL（大皿1.5ml 中皿1ml 六孔板500ul）,吹打使细胞完全脱落，吸入1.5ml EP管(无酶)3. 加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡15秒，室温静置5分钟4. 4℃ 12000rpm 5分钟5. 吸取上层水相（勿吸入中间层）0.5-0.7ml移至另一1.5ml离心管中，加异丙醇0.5-0.7ml（1:1加入）6. 充分混匀，冰盒上静置10分钟， 4℃ 12000rpm 30分钟7. 弃上清,加75%冰乙醇（DEPC水）1ml, 颠倒混匀数次8. 4℃ 12000rpm 5分钟9. 弃上清, 吸干, 加DEPC处理去离子水10-20ul （视沉淀大小而定)10. 测浓度（取5ul作RNA电泳，5ul作RNA定量，余-80℃冰箱保存）RNA鉴定：在紫外分光光度仪上测定RNA OD260/OD280均在1.8～2.0之间，表明抽提RNA纯度良好。

反转录反应：1.去除基因组DNA：(0047A)按下列组成配制反应混合液（冰上进行）：试剂加入量→离心→PCR 仪（42℃ 2min 4℃ hold）2.反转录反应：(037) 按下列组成配制反转录反应液（冰上进行）：→离心→PCR 仪（42℃ 15min85℃ 5s 4℃ hold 得到的cDNA 于-20℃保存PCR 反应：采用Real-time PCR 技术分别检测各基因表达丰度。

所有操作均在冰上完成，以β-actin 为内参基因，引物均由上海生工设计并合成。

每组设置3个复孔，不同标本的相对表达定量（RQ ，Relative Quantity ）值RQ=2-△CT 。

△Ct=目的基因Ct 值-内参基因Ct 值。

详细步骤如下：gDNAEraser 1μl 5×gDNAEraserBuffer 2μl总RNA ≤1μg RNase Free 水 补足至10μl试剂 加入量PrimeScript RTEnzymeMixI 1μl 5×PrimeScript Buffer 2（for RealTime ） 4μlRT PrimerMix 1μl RNase Free水 4μl按下列组成配制PCR反应液：试剂加入量TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）5μlR O X R e f e r e n c e D y e I I（50×）0.2μlPCR Forward Primer（10 μM）0.4μlPCR Reverse Primer（10 μM）0.4μlD N A模板1μlR N a s e F r e e水3μl使用ABI 7500 Real-Time PCR仪按以下条件进行PCR反应：95℃ 30sec预变性 1cycle 95℃ 5sec 60℃ 34sec PCR反应 40cycles。

QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。

标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。

基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。

而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。

RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。

此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。

毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。

2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。

3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。

具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。

4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。

Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。

②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。

RNA提取操作流程1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。

4℃下12000rpm离心15分钟。

离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。

RNA全部被分配于水相中。

水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。

加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。

此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。

然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。

样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。

具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

从外周血淋巴细胞中提取RNA
实验概要
本实验从外周血淋巴细胞(PBls)中分离得到RNA样品。

实验步骤
1．收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。

2．用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。

3．在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞，并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞)，然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。

4．加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂，4℃孵育15～20小时(过夜)。

5．将悬液转移到30mlCorex管内，在吊桶式转头内4℃离心2小时，6500r/min。

6．弃去上清，并用Kimwipe擦拭试管口。

用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬，收集沉淀.将沉淀重悬液离心，6500r/min1小时。

7．弃去上清，用2m1RNA溶解液溶解沉淀。

在-20℃下，彻底冷冻悬液。

8．复溶悬液，每10分钟涡旋20秒，共45分钟。

9．用等体积酚抽提1次，并用等体积氯仿抽提1次。

10．加入1/10体积的3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积一20℃乙醇。

彻底混合溶液，并在-20℃下孵育过夜。

11．在吊桶式转头内离心RNA，12000r/min30分钟。

用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。

将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内，并加入1/10体积3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积-20℃乙醇，重新沉淀。

并以乙醇沉淀物形式保存RNA，直至准备使用时。

RNA抽提知多少我们在工作中时常遇到这种情况，千辛万苦取到了几个样本，兴高采烈地送去做测序，本以为很快就能拿到结果，结果辛辛苦苦抽提的RNA降解了。

今天小编带来满满的干货，RNA提取小课堂开课啦，我们就来聊一聊关于RNA抽提的那些事儿吧~希望对于正在进行实验的小伙伴们提供一些帮助，前排搬好小板凳，敲黑板划重点啦~RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录形成的一条单链，主要功能是使遗传信息能够翻译成蛋白行使生物学功能，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。

当我们研究基因的表达和调控时，第一步需要做的就是从组织或细胞中分离和纯化RNA。

1首先了解一下RNA提取的几个小原则1.保证RNA的完整性；2.获得高纯度的RNA；3.操作简便，稳定性强。

2明确抽提RNA的使用目的RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。

cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。

因此，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。

3Trizol法抽提Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。

目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

1.Trizol作用原理在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。

加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。

RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。

移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

2.标准Trizol提取步骤液氮研磨--加入Trizol裂解混匀--加入氯仿抽提--离心--加入异丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心--无酶水重溶。

3.具体实验步骤（1）实验准备RNase free的枪头、EP管、PBS、Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase free水；（2）样本处理对取下的新鲜组织(50mg)用PBS快速清洗表面附着物，放入离心管，加入1ml Trizol匀浆。

外周血（静脉血）白细胞RNA提取1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液↓颠倒混匀，室温放置5min↓3000rpm离心5min↓弃上清。

留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次）↓加入1ml Trizol裂解白细胞↓用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散↓用5ml注射器反复吹打（不少于10次）↓再用1ml注射器反复吹打↓加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min↓4℃离心：12000rpm 15min↓转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇（一师兄建议加异丙醇后-80过夜沉淀RNA，-20也可。

RNA产出浓度为200-300ng/μl,100μl稀释），混匀，静置15min↓4℃离心：12000rpm 10min↓弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml）↓4℃离心：7500rpm 5min↓弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干↓将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中↓－70℃冰箱保存，备用1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置）2、取1～2ul总RNA进行浓度以及纯度测定RT-PCR实验A、RNA逆转录成cDNA（PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）：1、在灭菌0.1%DEPC浸泡过夜的1.5ml离心管中配制下列混合液Oligo dT Primer （50uM） 1uldNTP mixture (10mM each) 1ulRNA模板 0.5ug～5ug（根据说明书要求以及RNA浓度计算得到）O 适量至总体积为10ulRNase Free dH22、65℃保温5min后，冰上迅速冷却1min以上3、在上述离心管中继续配制下列反应液，总量为20ul上述变性后反应液 10ul5X PrimeScriptII Buffer 4ulRNase Inhibitor (40U/ul) 0.5ulPrimeScriptII RTase (200U/ul) 1ulO 至20ulRNase Free dH24、缓慢混匀，轻轻用枪吹打或手指轻弹，稍离心5、42℃， 30～60min6、70℃，灭活15min后，冰上迅速冷却B、PCR实验（25ul反应体系）：Taqmix 12.5ul引物1（上游）（10～20nM） 0.5ul引物2（下游）（10～20nM） 0.5ulcDNA 2ul（可调整）超纯水加至总体积25ulPCR步骤：1、Hold on 94℃ 5min2、Cycle 94℃ 40s3、退火温度： X℃ 40s4、72℃ 40s repeat “2～4步骤”5、72℃ 10min6、4℃ 60min琼脂糖凝胶电泳1、1.5g（根据PCR产物片段大小）琼脂糖溶于100ml 1X TBE中，微波炉3min 后冷却至60～70℃左右加入5ul EB溶液。

提取RNA的那些小技巧，你知道吗？
今天给大家带来《qRT-PCR》之---如何提取细胞RNA？
一、基本原则
避免RNA酶污染，全程戴口罩和无菌乳胶手套（汗液和唾液中含有大量RNA酶)
二、主要试剂及仪器
Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇、DEPC水（或ddH2O)
三、操作步骤（全程戴口罩和手套）
1、Trizol处理。

将细胞培养基吸出后，用预冷PBS洗涤3次，加入1ml Trizol（100mm培养皿），室温裂解1-2min，用移液枪均匀吹下细胞并置于无菌1.5ml EP管，上下轻柔颠倒数次，室温静置5min。

2、加入1/5体积氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4度，12000rmp，离心20min。

（离心机提前预冷至4度）
3、将水相转移至新EP 管（缓吸、宁缺毋滥），加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，室温静置10min，4度，12000rmp，离心15min。

4、用真空泵或移液枪小心吸取上清液，加入预冷75%乙醇（无水乙醇配置），4度，12000rmp，离心10min。

5、弃上清液，EP管倒扣，空气干燥5~10min。

6、10~100ul DEPC水（或ddH2O)溶解。

7、NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，读取OD260/OD280比值。

若比值在1.8~2.0之间，可进行下一步逆转录反应，若低于1.8，可能存在蛋白污染。

8、若暂时不逆转录，RNA置于-80度冰箱保存。

感谢您的关注，祝您科研顺利！。

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。

加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。

e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。

弃上清，收集白细胞沉淀。

每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。

2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

rna提取做qpcr原理及流程-回复RNA提取做qPCR原理及流程引言：qPCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种高灵敏度的核酸定量技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传学研究等领域。

而RNA提取则是qPCR的关键步骤之一，它能从细胞或组织中高效地提取RNA，为后续的转录和表达分析提供可靠的材料。

本文将详细介绍RNA 提取做qPCR的原理及流程。

一、RNA提取的原理：RNA提取的主要原理基于细胞或组织中RNA与其他污染物（如DNA、蛋白质）之间的区别。

常用的RNA提取方法包括酚/氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。

这些方法都利用了RNA与DNA、蛋白质等有机物在酸性、碱性、高盐浓度或有机溶剂等环境下的相互作用差异。

具体而言，RNA提取的原理分为以下几个关键步骤：1. 细胞破碎：通过细胞壁破碎酶、超声波或搅拌等方法将细胞溶解，释放出细胞中的RNA。

2. 细胞核酸溶解：将溶解的细胞加入含有酚-柠檬酸酯（phenol-chloroform isoamyl alcohol）的试剂中，酚层能够溶解DNA，而RNA则存在于水相中。

3. RNA沉淀：通过离心将RNA从上清液中沉淀出来。

4. RNA洗涤：将沉淀的RNA用酒精洗涤以去除残留的污染物。

5. RNA溶解：将洗涤后的RNA以适当的缓冲液溶解，以供后续实验使用。

二、RNA提取做qPCR的流程：RNA提取做qPCR的全过程包含以下步骤：1. 实验前的准备工作：- 准备所需试剂：细胞破碎酶、酚-柠檬酸酯、异丙醇、洗涤缓冲液等。

- 清洗工作区，并准备所需的离心管、显微管等试验器材。

- 获得待提取细胞或组织样本。

2. 细胞破碎：- 将待提取细胞或组织样本加入细胞破碎缓冲液中，迅速破碎细胞壁，并使RNA释放。

- 可根据不同样本类型选择合适的细胞破碎方法，如超声波破碎、搅拌破碎或细胞壁酶消化等。

3. 细胞核酸溶解：- 向细胞破碎样品中加入等体积的酚-柠檬酸酯，充分混合。

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。

加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。

e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。

弃上清，收集白细胞沉淀。

每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。

2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

人外周血淋巴细胞RNA的提取方法一、采集血样，室温保存。

使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。

一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。

二、提取淋巴细胞。

取1.5ml 无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。

然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。

（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。

1500rpm,15min,20摄氏度。

说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。

实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。

2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。

（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。

适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。

血液RNA提取方法
血液RNA提取
血液RNA提取方法
1. 取新鲜的血液（紫管），加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000 rpm离心1分钟。

2. 彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。

3. 每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。

室温放置5min，使样品充分裂解。

4. 4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，取上清（）。

5. 每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min，自然分相。

6. 4℃ 12,000rpm离心10-15min。

样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中（小心吸取水相）
7. 在上清中加入等体积冰冷的异丙醇（），室温放置10-20min。

8. 4℃ 12,000 rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

9. RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制，），温和振荡离心管，悬浮沉淀。

10. 4℃ 5,000-8,000 rpm离心1-2min，弃上清。

11. 室温放置1-2分钟晾干沉淀。

12. 沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

13. 检测纯度和浓度（OD260/OD280在2.0左右）。

RNA抽提步骤第一篇：RNA抽提步骤RNA抽提步骤 DAY one：1、提前一天灭好工具：置180度过夜，根据材料的多少准备工具。

研磨棒、研钵、小勺子，必要时一把小镊子，用锡箔纸包住置180度烘箱中。

2、可以取材料于-70度液氮中冻着。

取时就浸在液氮中（也可以当天取材料当天抽RNA）。

DAY two:1、擦拭超净台，放上各量程的枪；关闭玻璃门，打开紫外灯，照射20分钟；关上紫外灯，打开玻璃门释放里面的臭氧；30分钟后开始做。

2、预冷研钵、研磨棒，倒入材料开始研磨（材料一直在液氮中，注意戴手套口罩）。

3、等液氮即将挥发完时，快速用力研磨。

研磨必须充分，然后装在预冷的1.5mldorf管中。

4、加入tri-zol提取液1ml(先500ul再500ul也可以)，震荡混匀。

5、静置5分钟，加200ul三氯仿手摇晃15秒，室温下静置2-3分钟。

6、2-8° 12000rpm离心15分钟，RNA处于上层约为60%（450ul）。

7、吸上清450ul到另一drof管中，加500ul异丙醇，室温下放10分钟。

8、2-8°12000rpm离心10分钟，弃上清后加1ml 75%乙醇，涡旋，2-8° 7500rpm 5分钟。

9、室温干燥RNA 5-10分钟，将RNA溶于20-40ul DEPC水中，-70°保存。

DAY three:抽的RNA反转录：RT-PCR步骤一、总RNA提取1.取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。

2.震荡30s。

3.加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4.12000×g，4℃ 离心，15min。

5.吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6.加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7.12000×g，4℃ 离心，10min。

在管底部可见微量RNA沉淀 8.弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。

总RNA提取及反转录标准操作流程一、仪器试剂Trizol试剂三氯甲烷（4℃预冷）异丙醇（4℃预冷）75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷）DEPC处理水/RNase free water（反转录试剂盒）1.5mL无酶EP管200μL无酶PCR管冷冻离心机Nano Drop 2000反转录试剂盒（Takara RR036A）二、实验须知1. 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。

2. 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。

3. 尽可能在冰盘上操作。

3. 取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。

取完EP管后，袋子及时封好。

4. Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。

三、样品处理1. 组织样品将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。

注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。

胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。

2. 贴壁细胞样品弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml 无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。

注：加入Trizol溶液后，可将培养皿放入-80℃冰箱，20min后取出化开，通过冻融增加细胞裂解效果。

3. 悬浮细胞500g×5min离心收集细胞，弃去培养基，约5-10×106细胞加入1mLTrizol 溶液，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。

注：某些酵母或细菌细胞须超声裂解。

4.注意事项1）样品裂解液可室温存放数小时，-80℃可至少存放一月。

2）若样品含大量脂肪、蛋白、多糖及包外物质，如脂肪、肌肉或块茎植物等样品，可增加一步离心操作，具体步骤如下：12000g、4℃离心10min，胞外基质、多糖、高分子量DNA将会形成颗粒沉淀于底部，RNA包含于上清中，而高脂样品会在上清液上方形成一层脂肪层。