土壤酶活性的测定方法_周礼恺

土壤酶活性测定的实验步骤土壤酶的测定1.将三角瓶在稀释的硝酸（3-5%）或洗衣粉中浸泡24小时，然后刷洗，然后用蒸馏水湿润并在空气中干燥。

2.土样应细磨并袋装。

土壤量：2G+2.5G+5G+5G=14.5G，重复一次，14.5×2=29g一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫p323）1.试剂制备：(1)0.3%过氧化氢溶液：① （1:10030%过氧化氢和水）② （0.5mol H2O2+49.5ml蒸馏水）③ （1ml30%H2O2+99ml蒸馏水）（2）3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）（3）0.1N高锰酸钾溶液：（1.58gkmno4+100ml蒸馏水）2．操作步骤：将2G风干土壤放入100个三角形烧瓶中→ 40毫升蒸馏水和5毫升0.5毫升蒸馏水注入3%过氧化氢（现配备）→ 在往复式振动筛上振荡20分钟→ 添加5ml 3N硫酸（以稳定未溶解的H2O2）→ 用慢滤纸过滤→ 吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉色3．结果计算过氧化氢酶活性（m），20分钟后在1g土壤中以毫升0.1nkmno4表示：m=（a-b）×T，其中：a：空白消耗的0.1nkmno4毫升数b：滤液消耗的0.1nkmno4 ml T：高锰酸钾滴定的校正值备注：H2O2的酶活性是用容量法测定的：kappen（1913）首先介绍了在硫酸存在下用高锰酸钾滴定残余过氧化氢的方法。

根据H2O2与土壤相互作用过程中未分割H2O2的含量，采用容量法（常用高锰酸钾滴定未分割H2O2）2kmno4+5h2o2+3h2so4测定H2O2的酶活性→2mnso4+K2SO4+8H2O+5o2土壤h2o2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（p278）滴定法1.试剂配制：（1） 20%蔗糖：（20克蔗糖+80毫升水或12.5克蔗糖+50毫升水）（2）甲苯（分析纯）(3)ph5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠12H2O（1/15m）+9.5ml磷酸二氢钾（1/15m）磷酸氢二钠12h2o(1/15m)：23.88gna2hpo4,，加h2o溶解，定容至100ml。

土壤酶活性测定方法土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。

用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。

（二）试剂1）1%精胶2）甲苯3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。

4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1 L （1mL含50μg NH3-N）。

（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。

（2）土壤蛋白酶活性测定称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。

培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（μg）表示蛋白酶活性。

土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。

（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 1979134A [43]公开日2007年6月13日[21]申请号200510047888.5[22]申请日2005.11.30[21]申请号200510047888.5[71]申请人中国科学院沈阳应用生态研究所地址110016辽宁省沈阳市沈河区文化路72号[72]发明人武志杰 孙志梅 张丽莉 [74]专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司代理人许宗富 周秀梅[51]Int.CI.G01N 21/78 (2006.01)G01N 21/31 (2006.01)G01N 21/27 (2006.01)C12Q 1/00 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 5 页[54]发明名称一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法[57]摘要本发明涉及一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法，1)称取土壤风干样品3份于3只试管中，其中2只试管中加入2－2.5ml 0.20％－0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水，调pH 为7－8.5；然后向3只试管中分别加入1－2ml 0.5％－1.0％的葡萄糖溶液，再用蒸馏水补充到5－10ml，封口，摇匀，30℃恒温嫌气培养24小时；2)加入铝钾矾饱和溶液；摇荡，过滤；3)取滤液加显色剂，在520nm下比色测定，测定吸光值A；4)计算样品中NO 2－N的含量。

与过去的分析方法相比，本发明简化了操作步骤，从而减少了嫌气培养过程的复杂性和不确定性，使分析结果更加稳定可靠，重现性好。

200510047888.5权 利 要 求 书第1/1页 1.一种土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法，其特征在于： 1)分别称取1g过筛的土壤风干样品3份于3只试管中，往其中2只试管中加入2-2.5ml 0.20％-0.25％的亚硝酸钠溶液，另1只试管中加入等量的蒸馏水作为样品对照，调PH为7-8.5；然后向3只试管中分别加入1-2ml 0.5％-1.0％的葡萄糖溶液作为氢供体，再用蒸馏水补充到5-10ml，封口，摇匀，30℃恒温嫌气培养24小时；同时作试剂空白对照；2) 培养结束后，用蒸馏水将试管内的土液混合物完全转移至三角瓶中，再加入1ml铝钾矾饱和溶液；摇荡，过滤；3)取滤液1ml于50ml容量瓶中加显色剂，然后用水定容至刻度，在520nm下比色测定，测定吸光值A；4)在520nm下比色测定一系列已知浓度的NaNO2溶液的吸光值A1，以N a N O2溶液的浓度和测定的吸光值A′制备标准曲线，得到斜率b；5)根据吸光值A和斜率b，计算所测定液中NO2-N的含量S，S＝A*b；6)计算样品中NO2-N的含量；计算公式：[S1-(S2-S3)*50*V1/1000*V2]/W＝mgNO2--N/g土·24h 式中：S1为试剂空白中的NO2-N的含量mg/L，S2为样品中的NO2-N的含量m g/L，S3为样品对照中的N O2-N的含量m g/L，50为定容的溶液体积ml，V1为浸提液总体积ml，V2为吸取滤液的体积(ml)，W为称土样重g，1000为单位转换系数。

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或者塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

土样在自然条件下烘干装入袋中备用。

所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。

往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。

醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。

硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）与0.2mol/l的硼酸混合。

纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱与水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。

加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱与溶液1ml，加水至200ml。

静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳固，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳固后，570nm比色绘制标准曲线。

测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。

土壤酶活性测定方法土壤脲酶的测定方法(苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。

它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。

土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。

根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。

人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。

本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂1）甲苯2）10％尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6。

7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH)溶于蒸馏水.将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6。

7，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（1。

35mol/L)：62。

5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18。

5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中;27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A 液、B液各20ml混合,用蒸馏水稀释至100ml.5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0。

9%,溶液稳定。

6)氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml)制成氮的工作液（0。

01mg/ml）.三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。

培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中,再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,随加随摇匀。

20min后显色，定容.1h内在分光光度计与578nm波长处比色。

2. 土壤蛋白酶活性的测定2.1甘氨酸标准曲线的绘制1.分别吸取0，0.1，0.2，0.05，1.2和5mL甘氨酸标准溶液置试管中，加蒸馏水至5mL。

各加入1mL2%茚三酮溶液摇匀，在煮沸的水浴上加热10min。

将显色溶液转入50mL容量瓶中，稀释至刻度。

2.在光电比色计上用1cm比色杯于560nm波长处以不含甘氨酸的溶液为对照比色测定各含甘氨酸溶液的光密度。

以含甘氨酸溶液的浓度为横坐标，光密度为纵坐标绘制甘氨酸的标准曲线。

2.2蛋白酶活性测定方法称取2g风干土两份，分别置试管中，加入0.5mL甲苯，摇匀后放置15min。

另取一个试管不加土样和甲苯作为无土对照。

在一个加土样试管和无土对照试管加入10mL1%白明胶溶液，另一个加土样试管加10mL蒸馏水代替白明胶溶液作为无基质对照。

将试管塞紧，小心摇匀。

置30℃恒温箱中培养24h。

培养结束后，将试管中悬液用滤纸过滤至另一试管中。

吸取5mL滤液于试管中，加0.5mL0.05mol/L硫酸和3mL20%硫酸钠沉淀蛋白质，再次过滤。

在上述滤液中加入1mL茚三酮溶液，仔细摇匀，在煮沸的水浴上加热10min。

将显色溶液转入50mL容量瓶中，稀释至刻度。

按照测定甘氨酸标准曲线的方法比色测定各样品的光密度。

根据所测光密度值在甘氨酸标准曲线上查出对应的甘氨酸浓度。

土样在测定过程中稀释了10倍（加入10mL白明胶溶液或蒸馏水），比色测定的样品体积时5mL，由各样品的甘氨酸浓度可以得出各土样中产生甘氨酸的毫克数。

3. 过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法，具体方法如下：称取5克过1毫米筛的风干土样，置于150毫升三角瓶中，注入40毫升蒸馏水和5毫升0.3%过氧化氢。

随即置于振荡器上振荡30分钟。

然后注入5毫升1.5mol/L H2SO4过滤。

取25毫升滤液，用0.01mol/ L 高锰酸钾滴定（保证在酸性环境下）。

同时设置对照，即三角瓶中注入40毫升蒸馏水和5毫升0.3%过氧化氢，而不加土样。

4.2.5 土壤酶活性的测定脲酶活性的测定采用奈氏比色法．以1 g干土24 h生成的NH3- N量为脲酶的1个活性单位[41]．过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法．酶活性以1 g干土1 h内消耗的0．1 mol·L-1KMn04体积数(以ml计)表示[42]多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法，以1 g干土3 h内生成的没食子素的量为多酚氧化酶的1个活性单位[43]，脱氢酶活性的测定采用三苯基四氮唑氯化物作为氢受体。

被还原后生成红色的甲臜，用比色法测定，以1 g干土6h生成的甲臜质量为脱氢酶的1个活性单位[44]。

1. 脲酶活性的测定——苯酚钠比色法（1）标准曲线的绘制吸取稀释的氮的标准溶液1，4，7，10，13，16，19mL，移入50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。

再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。

根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。

绘制的标准曲线如图4-1所示：图4-1脲酶标准曲线（2）操作步骤取5g风干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。

15min后加10mL10%尿素液和20mL PH6.7柠檬酸盐缓冲液。

摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示。

2. 过氧化氢酶活性的测定——高锰酸钾滴定法（1）操作步骤取5g土壤样品于100mL三角瓶中（用不加入土样的作空白对照），加0.5mL甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。

取出，立刻加入25mL冰箱储存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于4℃冰箱中放置1h。

取出，迅速加入冰箱储存的2mol/L H2SO425mL，摇匀，过滤。

取1mL滤液，用0.05mol/L的KMnO4滴定。

（2）计算根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KMnO4。

4.2.5 土壤酶活性的测定脲酶活性的测定采用奈氏比色法．以1 g干土24 h生成的NH3- N量为脲酶的1个活性单位[41]．过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法．酶活性以1 g干土1 h内消耗的0．1 mol·L-1KMn04体积数(以ml计)表示[42]多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法，以1 g干土3 h内生成的没食子素的量为多酚氧化酶的1个活性单位[43]，脱氢酶活性的测定采用三苯基四氮唑氯化物作为氢受体。

被还原后生成红色的甲臜，用比色法测定，以1 g干土6h生成的甲臜质量为脱氢酶的1个活性单位[44]。

1. 脲酶活性的测定——苯酚钠比色法（1）标准曲线的绘制吸取稀释的氮的标准溶液1，4，7，10，13，16，19mL，移入50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。

再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。

20min后显色，定容。

1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。

根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。

绘制的标准曲线如图4-1所示：图4-1脲酶标准曲线（2）操作步骤取5g风干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。

15min后加10mL10%尿素液和20mL PH6.7柠檬酸盐缓冲液。

摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示。

2. 过氧化氢酶活性的测定——高锰酸钾滴定法（1）操作步骤取5g土壤样品于100mL三角瓶中（用不加入土样的作空白对照），加0.5mL 甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。

取出，立刻加入25mL冰箱储存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于4℃冰箱中放置1h。

取出，迅速加入冰箱储存的2mol/L H2SO425mL，摇匀，过滤。

取1mL滤液，用0.05mol/L的KMnO4滴定。

（2）计算根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KMnO4。

土壤酶活性测定方法综合引言：土壤酶活性是指土壤中特定酶在一定时间内分解特定底物的能力，是评估土壤生态系统功能和土壤肥力状况的重要指标。

土壤酶活性测定方法是研究土壤酶活性的关键手段之一、本文将综合介绍常用的土壤酶活性测定方法，包括蔗糖酶活性测定方法、过氧化氢酶活性测定方法和脲酶活性测定方法。

一、蔗糖酶活性测定方法：蔗糖酶是一种重要的有机磷酸酶，广泛存在于土壤中，能够水解蔗糖为葡萄糖和果糖。

测定土壤蔗糖酶活性可以反映土壤中酶的数量和活性。

1.提取土壤酶液：将土壤与玻璃棒研磨均匀，用0.5mol/L甘油缓冲液（pH6.8）溶解土壤，离心沉淀，得到土壤酶液。

2.酶活性测定：取一定量的土壤酶液加入蔗糖底物和缓冲液，在37℃恒温振荡下反应30分钟，用酒精停止反应，加入硫酸，取样测定比色液的吸光度。

3.统计分析：根据比色液吸光度与标准曲线对照，计算出土壤蔗糖酶活性。

二、过氧化氢酶活性测定方法：过氧化氢酶是一种氧化还原酶，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。

测定土壤过氧化氢酶活性可以反映土壤中氧化还原反应的发生情况。

1.提取土壤酶液：将土壤与甘油缓冲液混合，加入液氮使其冷冻破碎，离心沉淀得到土壤酶液。

2.酶活性测定：取一定量的土壤酶液加入过氧化氢底物和缓冲液，在25℃恒温振荡下反应一定时间，停止反应后加入酒精，用紫外分光光度计测定吸光度。

3.统计分析：根据吸光度与过氧化氢递减曲线对照，计算出土壤过氧化氢酶活性。

三、脲酶活性测定方法：脲酶是一种解脲酸酯的酶，能够水解尿素为氨和二氧化碳。

测定土壤脲酶活性可以反映土壤中氮循环的情况。

1.提取土壤酶液：将土壤与脲酸酯缓冲液混合，用玻璃棒研磨均匀，离心沉淀得到土壤酶液。

2.酶活性测定：将一定量的土壤酶液加入脲酶底物和缓冲液，在37℃恒温振荡下反应一定时间，反应停止后加入酒精，用比色法测定吸光度。

3.统计分析：根据吸光度与标准曲线对照，计算出土壤脲酶活性。

结论：以上就是蔗糖酶活性测定方法、过氧化氢酶活性测定方法和脲酶活性测定方法的综合介绍。