纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
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纤维素酶酶活测定
纤维素酶活测定方法一、原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应。
反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。
酶活定义纤维素酶活力单位是指55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。
二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制五、酶活测定由于苏柯汉给定的pH范围为4.8-5.2，故选用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液测定纤维素酶酶活。
1、样品的制备CMC-Na溶液的制备：用pH 5.0的50mmol NaAC-HAC缓冲液配置0.5%的CMC-Na （羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量CMC-Na 0.05g，精确至0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至100ml。
纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到0.001g。
用50mmol NaAC-HAC pH5.0的缓冲液配置成适当的浓度10000倍，保证吸光度在0.2-0.6之间。
2、DNS法测酶活：取1.8ml 0.5% CMC-Na的溶液于25ml 具塞刻度试管中，55℃预热10min左右，加入0.2ml 适当稀释的酶液，于55℃水浴锅中保温30min后，然后加2ml DNS，混匀，沸水浴5min，冷却至室温，定容到25ml。
混匀测OD540nm。
空白对照用酶活的酶液作对照。
实验八 纤维素酶活力测定实验
实验八纤维素酶酶活力的测定实验【实验目的】1、了解测定纤维酶活力及还原糖的原理。
2、掌握测定纤维酶活力及还原糖的方法。
3、获得部分纤维素酶。
【实验原理】纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称。
它包括C1、C X酶及纤维二糖酶（β—葡萄糖苷酶）。
作用方式：C1酶C X酶纤维二糖酶天然纤维素-----→直链纤维素----→纤维二糖---------→葡萄糖其中C1酶是使天然纤维素晶体都分链，起一个分离作用和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素。
C X酶不能水解天然纤维素，而能水解直链纤维素的β-1，4-葡萄糖酶键，生成纤维二糖，纤维二糖再经过纤维二糖酶水解成为葡萄糖。
本法以滤纸和羧甲基纤维素钠盐作为底物加入一定量的酶液，在一定的条件下起作用，然后观察滤纸的溃崩情况来判断C1酶活力的大小，同时，测定CMC 水解液中还原糖的含量用来表示C X酶活力的大小。
用羧甲基纤维素钠盐(CMC)作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，然后用DNS法测定还原糖的含量，从还原糖的数量来求得酶活力的大小。
纤维素分子是由β-葡萄糖从1，4键相连的长链，由于纤维素的分子间氢键数目极其多，因此不溶于水，在纤维素分子中β-葡萄糖上第2，3及5个碳原子都有一个游离的羧基，如羧基上的氢被羧甲基取代，由于羧基有着很强的亲水性，因此，CMC就能溶于水而成为胶状溶液。
羧甲基纤维素无论在结构上或是在性质上都很大程度地不同于纤维素。
因为它溶于水。
所以，非常容易被纤维素酶水解，在相同的条件下，同一纤维素酶水解CMC所产生的还原糖远大于水解纤维素所产生的还原糖，因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的数值总是比较高的，所以CMC的酶活力只能供参考。
测定还原糖的方法很多，只是采用DNS（3，5-二硝基水杨酸）法，比较简便，3，5-二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色，在一定还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比。
纤维素酶活力的测定
实验二十纤维素酶活力的测定一、目的学习和掌握3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。
二、原理纤维素酶是一种多组分酶，包括C 酶、C 酶和 |?-葡萄糖苷酶三种主要组分。
其中C1 X 1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C 酶的作用是将无定形纤维素继续水解成X纤维寡糖，|?-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料（1）纤维素酶制剂 500mg（2）新华定量滤纸 50mg / 份 4（3）脱脂棉花 50mg / 份 4（4）羧甲基纤维素钠（CMC） 510mg（5）水杨酸苷 500mg2．主要仪器（1）722 型或其他型号的可见分光光度计（2）恒温水浴 2 台（3）沸水浴锅（4）电炉子（5）剪刀（6）万分之一分析天平（7）恒温干燥箱（8）冰箱（9）试管架（10）胶头滴管（11）具塞刻度试管 20mL24（12）移液管或加液器 0.5 mL3；2mL7（13）容量瓶 100 mL6；1000 mL3（14）量筒 50 mL2；100 mL1；500 mL1（15）烧杯 100 mL6；500mL3；1 000 mL13．试剂（均为分析纯）（1）浓度为 1mg/mL的葡萄糖标准液将葡萄糖在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至 100mL，充分混匀。
4℃冰箱中保存（可用 12～15 天）。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液 262mL，再加到 500mL含有 185g酒石酸钾钠（C H O KNa ! 4H O，MW=282.22）的热4 4 6 2水溶液中，再加5g结晶酚（C H OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na SO ，MW=126.04），6 5 2 3搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶是一种重要的酶类，具有分解纤维素的作用。
为了评估纤维素酶的活力，人们研究出了多种测定方法，其中较为常用的有以下三种：
1. 滴定法：将一定量的纤维素酶加入含有纤维素的溶液中，反应一定时间后，使用酸碱滴定法测定反应液的酸碱度变化，从而得出纤维素酶的活力。
2. 电泳法：将一定量的纤维素酶加入蛋白质凝胶中，进行电泳分离，然后在凝胶中添加含纤维素的溶液，观察纤维素的降解情况，从而得出纤维素酶的活力。
3. 显色法：将一定量的纤维素酶加入含有纤维素的溶液中，反应一定时间后，使用显色剂对反应液中的产物进行染色，然后利用分光光度计测定反应液的吸光度变化，从而得出纤维素酶的活力。
这三种测定方法各有优劣，研究者应根据实际需要选择合适的方法进行测定。
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(完整版)纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
纤维素酶活力的测定
β-糖苷酶活力的测定（CMC）一目的：掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。
原理：纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。
二试剂：1．3，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）：称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。
贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。
2．0.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。
3．1mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。
4．代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40℃水浴锅中浸提1h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。
5．底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。
三仪器：分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
四方法步骤：1．标准曲线的绘制分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。
纤维素酶活力测定
纤维素酶活力测定
原理：纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,在多种纤维素酶的协同作用下，植物细胞壁纤维素多糖被逐步降解为葡萄糖等还原糖。
在碱性环境下，3，5—二硝基水杨酸试剂与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，棕红色氨基化合物在540nm波长下具有最大吸收。
利用此原理测定540 nm处吸光度来测定酶活力。
试剂：
1mg/mL葡萄糖标准溶液:无水葡萄糖于80 °C烘至恒重，准确称取0.100g于烧杯中,加适量蒸馏水溶解,转入容量瓶中并蒸馏水定容至100 mL。
DNS溶液：酒石酸钾钠182 g，溶于500mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3 g，NaOH 21g，苯酚5 g，搅拌至全溶，冷却后用蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，室温保存。
方法：
标准曲线的绘制：取6支20mL的试管按下表顺序依次加入各试剂
沸水中煮沸5min,流水冷却2min,各管中加12.5mL蒸馏水，定容到16mL，摇匀，放置20min 后，测定540nm处吸光度。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定(2)
收稿日期:2002-03-18作者简介:张瑞萍(1964-),女,江苏南通人,副教授,硕士,从事酶在纺织品染整加工中的应用工艺及配套助剂的研究.纤维素酶的滤纸酶活和CMC 酶活的测定张瑞萍(南通工学院,江苏南通226007)摘要:采用3,5-二硝基水杨酸(D NS)为显色剂、滤纸或CMC 为底物,测定纤维素酶的滤纸酶活(FPA)和CMC 酶活(CMCA).分析确定了酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物,比较了两种底物的酶活测定方法,结果表明:纤维素酶的CMC 酶活比滤纸酶活高,酶对水溶性底物有较高的活力,吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.关键词:纤维素酶;酶活;测定中图分类号:TS190.92+3文献标识码:C文章编号:1004-0439(2002)05-0051-03DETERMINATION OF FILTER PAPER ENZYME ACTIVITY ANDCMC ENZYME ACTIVITY OF CELLULASEZHA NG Rui_p in g(Nantong Institute of Technology,Nantong 226007,China)Abstract:With 3,5-dinitrosalic y lic acid (DNS)as develo p er and filter p a p er or CMC as the substrate,filter p ap er enz y me activit y (FPA)and CMC enz y me activit y (CMCA)of cellulase were determined.Throu g h anal y sis,w ave length for determining enzyme activity w as set as 530nm.The reference solution should be the reactant of inactivated enzyme.substrate and DNS.The determination methods for two kinds of s ubstrates were compared.The result indi cated that CMCA of cellulase is hi g her than FPA and enz y me is more active to water solable substrate.adsor p tion has g reat influence on the bondin g of active p art of cellulase with molecular chain of cellulose and the catal y sis.Key words:cellulase;enzyme activity;determination减量率=100%处理前织物干质量-处理后织物干质量处理前织物干质量近年来,酶特别是纤维素酶在纺织工业上的应用已受到纺织染整和生物工程界人士的高度关注.纤维素酶是多组分的复合物,各个组分的底物专一性不同;另外,纤维素酶作用的底物比较复杂,加上反应产物不同,致使纤维素酶活的测定方法很多,各国采用的方法亦不统一.本试验选择滤纸、CMC 为底物,其原理为利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖与显色剂反应,求出还原糖的浓度,再求出酶的活力.由不同底物测得的酶活分别称作FPA(滤纸酶活)和CMCA(CMC 酶活).本实验分析酶活测定的主要条件,比较两种底物酶活测定方法的结果,为生产中酶的利用提供了依据.1实验方法1.1化学药品、材料纤维素酶(工业品),DNS 试剂为自配,冰醋酸、醋酸钠、葡萄糖均为分析纯,滤纸(定性)、羧甲基纤维素钠(试剂级).1.2FPA 滤纸酶活和CMC 酶活的测定取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%CMC 溶液为底物,于50 恒温水解反应1h,然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min,再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值.酶活定义:1ml 酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位(u).1.3织物酶减量率的测定将酶处理前后的试样在105 烘箱中烘至恒重.印染助剂TEXTILE AUXILIARIES 第19卷第5期2002年10月Vol.19No.5Oct.20025219卷印染助剂2结果与讨论2.1显色剂的选择本试验选用3,5-二硝基水杨酸(DNS),在碱性条件下,与还原糖反应,生成有色化合物,通过分光光度计进行比色测定,确定低分子糖的量.DNS 黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应生成的棕红色氨基化合物3-氨基-5-硝基水杨酸为比色法的测定基础物.2.2最大吸收波长的确定根据物质的颜色和吸收光颜色的关系,以及DNS 试剂的颜色及反应生成的棕红色氨基化合物的颜色,选取490~580nm 波长对显色液进行比色.由图1可知,不同浓度葡萄糖溶液在490~500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收.为了排除DNS 的干扰,选择在波长530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,但仍符合 吸收最大、干扰最小!的原则.2.3底物及酶本身的含糖量在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色.而且,试验所用的纤维素酶是工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同.为了排除还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物.2.4葡萄糖标准曲线用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值,结果如图2所示.从图2可知,标准曲线y = 2.0666x+0.1362,线性相关系数R 2为0.9991,线性相当好,可以用于酶活力的测定.2.5底物的选择对酶活的影响大多数由微生物产生的纤维素酶是多组分的酶系,主要含有3种组分:(1)endo- -1,4-葡聚糖酶;(2)exo- -1,4-葡聚糖酶;(3) -1,4-葡萄糖苷酶.其中,endo-酶能进攻纤维素大分子链的中间部位,任意地切断大分子成较短的链;而exo-酶则仅能从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖; -葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成葡萄糖.纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终效果,是由各种酶综合作用所决定的.作为底物的滤纸结构较为松散,可及区较多,非还原性末端也较多,容易同时被endo-酶和exo-酶降解,再由 -葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖.用比色法定量测定还原糖的生成量,可反映纤维素酶的总酶活FPA.由于exo-酶对纤维素链的专一性高,而endo-酶的专一性较低.在降解羧甲基纤维素(CMC)时,主要是反映endo-酶的活力.本试验选择了3种酸性纤维素酶,分别以滤纸和CMC 为底物,其酶活(FPA 和CMC A)的测试数据结果如表1所示.从表1可知:CMCA 和FPA 两种酶活的大小顺序是:杰能科>NOVO L>PLUS L.这几种酶的endo-酶活(CMCA)较高,且比总酶活(FPA)大,几乎相差一个数量级.这说明酶对水溶性底物有较高的活力,而滤纸与酶是多相催化,酶分子也是高分子物,所以反应COO HNH 22OHCOOH +还原糖N 2NO 2OH表1不同酶种的滤纸酶活(FPA)和CMC 酶活(CMC A)酶种酶活/uCMCAFPA 杰能科528.1671.63NOVO L417.4030.92PLUS L327.8327.27553期张瑞萍:纤维素酶的滤纸酶活和CMC 酶活的测定的空间阻碍较大,这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.另外,从酶整理过程中机械处理条件对织物减量率的影响(如图3所示),也说明了这一点.所以,为了使酶在基质上充分发挥作用,至少要满足两个条件:首先,酶分子要非常接近、附着于基质,并和基质分子配位,形成中间络合物(对基质的亲和性);其次,以某种程度促进酶和基质分子的反应(对基质的活性).纤维素织物不溶于水,纤维素酶在对其攻击时会有空间障碍,而吸附于纤维素上的纤维素酶的活性又受时间的限制,在尚存活性时,如果不与基质作用,就会失活.所以,纤维素酶对基质的接近、附着不仅是单纯的物理结合,而且对纤维素水解反应的影响也很大.3结论3.1葡萄糖浓度与吸光度OD 值的相关系数在0.9991以上,从而确定该标准曲线可用于酶的活力测定.3.2分析确定了DNS 法测定活力的波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DNS 等共热的反应物.3.3底物不同,活力的测定值也不同,以羧甲基纤维素为底物测得的酶活值CMCA 比以滤纸为底物测得的酶活值FPA 高;这说明酶对水溶性底物有较高的活力;也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响.参考文献:[1] C.H.温著[英].罗兰译.酶的结构和功能[M].北京:科学技术出版社,1983.[2]相尺孝亮著[日].黄文淘译.酶应用手册[M].上海:上海科技出版社,1986.[3]Ghose T.Meas urement of Cellulase Activities[J].Pure A pp l.Ch em,1987,58(2):257-268.加盟联胜化工,踏上成功之路!联胜化工是专业生产和销售纺织助剂的精细化工公司,公司有完善的管理,发展前途广阔,在香港特区和大陆有完善的销售及售后服务网络,为适应公司的快速发展,诚聘英才加盟我公司(长期有效)。
纤维素酶活力的测定
实验5纤维素酶活力的测定一、原理：纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
二、试剂：1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。
加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。
存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。
3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。
使用前摇匀。
4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。
三、测定方法：1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。
2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于40度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。
取糖化液１毫升，按制标准曲线时一样加显色液比色。
同时以１毫升煮沸的酶液代替酶做一空白对照。
四、计算：在上述条件下，1毫克酶每分钟催化纤维素水解生成１微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。
N *OD值对应的葡萄糖量纤维素酶活力单位＝——————————————３０*１N---酶液的稀释倍数３０――糖化所用时间１――反应酶液毫升数。
纤维素酶活力测定方法
近的。
５
塞 妒 蕾
０
５
图２葡萄糖标准曲线
２．５底物的选择对酶活力的影响 目前理论认为，大多数由微生物产生的纤维素酶 是一个多组分酶系，主要含有三种组分：内切ｐｌ，４一葡 聚糖酶、外切８ １，４一葡聚糖酶和ｐ—ｌ，４葡萄糖苷酶。其 中，内切（ｅｎｄｏ一）酶能进攻纤维素大分子链的中间部 位，任意地切断大分子，而生成较短的链；而外切 （”ｍ）酶仅从纤维索大分子链的非还原性末端切下 一个个纤维二糖；６－葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催
Ｉ。＝（０．８３：
１），杰能科：ＰＬＵＳ Ｉ。一（０．６７；１）。这与不同酶的
Ｉ。，ＰＬＵＳ Ｌ一１：
我们选择三种酸性纤维素酶，分别以滤纸和ＣＭＣ 为底物，其酶括力（ＦＰＡ和ＣＭＣ…）的测试数据结果如
表ｌ所示。
表１不同酶种的滤纸酶活（ＦＰＡ）和ＣＭＣ酶活（ＣＭＣ。。）
结论
从表ｌ可知，ＣＭＣａｓｅ和ＦｐＡ两种酶活的大小顺 序是：杰能科＞ＮＯＶＯ Ｌ＞ＰＬＵＳ Ｌ。这几种酶的内切 酶活（ＣＭＣ。）较高，且比总酶活（ＦＰＡ）大，几乎相差一 个数量级，这说明酶对水溶性底物有很高的活力．而滤 纸与酶属多相催化，酶也是高分子物，所以反应的空间 阻碍较大，这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素 分子链段的结合及催化均有很大影响。 ２．６纤维素酶活与织物酶减量率的关系 用这几种酶对织物进行整理，织物的减量率与酶 种及酶量的关系如图３所示。从图３可看出，当三种酶 的用量分别为２％、４％、６％、８％、ｌＯ％（ｏｗｆ）时，对 应的减量率的比值平均（杰能科：ＮＯＶＯ
２墨：：！！：竺！：
＝＝兰２兰垒竺竺竺
《藏蠹ｊ
摘
纤维素酶活力测定方法
张瑞萍 南通工学院（２２６００７）
要用ＤＮＳ为显色剂，分别以滤纸和ＣＭＣ为底物，“滤纸糖酶括性（ＦＰＡ）和羧甲基纤维索酶活性（ＣＭＣｍ）表征
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图２葡萄糖标准曲线
２．５底物的选择对酶活力的影响 目前理论认为，大多数由微生物产生的纤维素酶 是一个多组分酶系，主要含有三种组分：内切ｐｌ，４一葡 聚糖酶、外切８ １，４一葡聚糖酶和ｐ—ｌ，４葡萄糖苷酶。其 中，内切（ｅｎｄｏ一）酶能进攻纤维素大分子链的中间部 位，任意地切断大分子，而生成较短的链；而外切 （”ｍ）酶仅从纤维索大分子链的非还原性末端切下 一个个纤维二糖；６－葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催
Ｉ。＝（０．８３：
１），杰能科：ＰＬＵＳ Ｉ。一（０．６７；１）。这与不同酶的
Ｉ。，ＰＬＵＳ Ｌ一１：
我们选择三种酸性纤维素酶，分别以滤纸和ＣＭＣ 为底物，其酶括力（ＦＰＡ和ＣＭＣ…）的测试数据结果如
表ｌ所示。
表１不同酶种的滤纸酶活（ＦＰＡ）和ＣＭＣ酶活（ＣＭＣ。。）
结论
从表ｌ可知，ＣＭＣａｓｅ和ＦｐＡ两种酶活的大小顺 序是：杰能科＞ＮＯＶＯ Ｌ＞ＰＬＵＳ Ｌ。这几种酶的内切 酶活（ＣＭＣ。）较高，且比总酶活（ＦＰＡ）大，几乎相差一 个数量级，这说明酶对水溶性底物有很高的活力．而滤 纸与酶属多相催化，酶也是高分子物，所以反应的空间 阻碍较大，这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素 分子链段的结合及催化均有很大影响。 ２．６纤维素酶活与织物酶减量率的关系 用这几种酶对织物进行整理，织物的减量率与酶 种及酶量的关系如图３所示。从图３可看出，当三种酶 的用量分别为２％、４％、６％、８％、ｌＯ％（ｏｗｆ）时，对 应的减量率的比值平均（杰能科：ＮＯＶＯ
２墨：：！！：竺！：
＝＝兰２兰垒竺竺竺
《藏蠹ｊ
摘
纤维素酶活力测定方法
张瑞萍 南通工学院（２２６００７）
要用ＤＮＳ为显色剂，分别以滤纸和ＣＭＣ为底物，“滤纸糖酶括性（ＦＰＡ）和羧甲基纤维索酶活性（ＣＭＣｍ）表征
两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶活力测定方法
微生物研究 。E2mail: kangjiting11zhong@yahoo. com. cn。 通讯作者 : 张小平 。
素酶是起协同作用的多组分酶系 , 可以促进纤维素的分 解 。纤维素酶主要来自于真菌和细菌 。按照其作用机 理 , 可分为内切葡聚糖苷酶 、外切葡聚糖苷酶和 β2葡萄 糖苷酶 3类 [5 ] 。 11211 内切葡聚糖苷酶 又称 Cx酶 、CMC 酶 、 endo2 1042β2D 2glucanase (来自真菌的简称 EG, 来自细菌的简 称 Cne) 。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域 , 随机 水解 1042β2葡萄糖苷键 , 将长链纤维素分子切短 , 产生 大量非还原性末端的小分子纤维素 。 11212 外切葡聚糖苷酶 又称 C1 酶 、 exo21042β2D2glu2 canase (来自真菌的简称 CBH, 来自细菌的简称 Cex) 。 C1酶作用于纤维素线状分子的末端 , 水解 1042β2D 2葡 萄糖苷键 , 每次切下 1个纤维二糖分子 , 又称纤维二糖 水解酶 ( cellobiohydrolase) 。 11213 β2葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶 、β21042gluco2 sidase (简称 BG) 。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊 精水解成葡萄糖分子 。
22纤维素酶活力测定的主要方法近年来国内通用的和新提出的一些纤维素酶活力测定方法大多利用dns法原理即纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将35二硝基水杨酸dns中的硝基还原为氨基生成棕红色的氨基化合物
河北农业科学 , 2010, 14 (4) : 151 - 153 Journal of Hebei Agricultural Sciences
纤维素酶 除 了 将 纤 维 素 水 解 成 葡 萄 糖 等 有 效 成 分 外 , 还能通过提高植物细胞壁的通透性 , 来提高植物细 胞内含物的提取率 , 所以 , 纤维素酶广泛应用于以植物 为原料的工农业生产中 。
素酶是起协同作用的多组分酶系 , 可以促进纤维素的分 解 。纤维素酶主要来自于真菌和细菌 。按照其作用机 理 , 可分为内切葡聚糖苷酶 、外切葡聚糖苷酶和 β2葡萄 糖苷酶 3类 [5 ] 。 11211 内切葡聚糖苷酶 又称 Cx酶 、CMC 酶 、 endo2 1042β2D 2glucanase (来自真菌的简称 EG, 来自细菌的简 称 Cne) 。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域 , 随机 水解 1042β2葡萄糖苷键 , 将长链纤维素分子切短 , 产生 大量非还原性末端的小分子纤维素 。 11212 外切葡聚糖苷酶 又称 C1 酶 、 exo21042β2D2glu2 canase (来自真菌的简称 CBH, 来自细菌的简称 Cex) 。 C1酶作用于纤维素线状分子的末端 , 水解 1042β2D 2葡 萄糖苷键 , 每次切下 1个纤维二糖分子 , 又称纤维二糖 水解酶 ( cellobiohydrolase) 。 11213 β2葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶 、β21042gluco2 sidase (简称 BG) 。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊 精水解成葡萄糖分子 。
22纤维素酶活力测定的主要方法近年来国内通用的和新提出的一些纤维素酶活力测定方法大多利用dns法原理即纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将35二硝基水杨酸dns中的硝基还原为氨基生成棕红色的氨基化合物
河北农业科学 , 2010, 14 (4) : 151 - 153 Journal of Hebei Agricultural Sciences
纤维素酶 除 了 将 纤 维 素 水 解 成 葡 萄 糖 等 有 效 成 分 外 , 还能通过提高植物细胞壁的通透性 , 来提高植物细 胞内含物的提取率 , 所以 , 纤维素酶广泛应用于以植物 为原料的工农业生产中 。
(完整版)纤维素酶活力的测定
纤维素酶活力的测定1.纤维素酶活力单位定义在37℃,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u.2.测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力.3.试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水.3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml:称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml.3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L:吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml.3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L:称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml.3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L:称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml.3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5:称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至5.5.3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)称取羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)0.80g,加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热,继续搅拌30min,用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)定容至100ml.羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀.4℃避光保存,有效期为3天.3.7 DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸 3.15g(化学纯),加水500ml,搅拌5s,水浴至45℃.然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g.继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解.停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml.用烧结玻璃过滤器过滤.取滤液,储存在棕色瓶中,避光保存.室温下存放7天后可以使用,有效期为6个月.4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵.4.2 分样筛:孔径为0.25mm(60目).4.3 分析天平:感量0.001g.4.4 pH计:精确至0.01.4.5 磁力搅拌器:附加热功能.4.6 电磁振荡器.4.7 烧结玻璃过滤器:孔径为0.45m.4.8 离心机:2000g以上.4.9 恒温水浴锅:温度控制范围在30—60℃之间,精度为0.1℃.4.10 秒表:每小时误差不超过5s.4.11 分光光度计:能检测350—800nm的吸光度范围.4.12 移掖器;精度为1l.5 标准曲线的绘制吸取缓冲液(3.5)4.0ml,加入DNS试剂(3.7)5.0ml,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml,制成标准空白样.分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和7.00ml,分别用缓冲液(3.5)定容至100ml,配制成浓度为0.10—0.70mg/ml葡萄糖标准溶液.分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各 2.00ml(做二个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml水和5mlDNS试剂(3.7).电磁振荡3s,沸水浴加热5min.然后用自来水冷却到室温,再用水定容至25ml.以标准空白样为对照调零,在540nm处测定吸光度OD值.以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线.每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线.6 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎,然后过60目筛(孔径为0.25mm).称取试样两份,精确至0.001g.加入50ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(3.5)定容至100ml,在4℃条件下避光保存24h.摇匀,取出30-50ml,2000g离心3min.吸取5.00ml上清液,再用缓冲溶液(3.5)做二次稀释(稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).液体试样可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释,定容(稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04—0.08 u/ml之间).如果稀释后酶液的pH值偏离5.5,需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节,校正至5.5,然后再用缓冲溶液(3.5)做适当定容.7 测定步骤吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃平衡10min.吸取10.0ml经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min.吸取2.00ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s.然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37℃保温30min,沸水浴加热5min.用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AB.吸取2.0ml经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入2.0ml羧甲基纤维素钠(3.6)(已经过37℃平衡),电磁振荡3s,37℃精确保温30min.加入5.0mlDNS试剂(3.7),电磁振荡3s,酶解反应.沸水浴加热5min,用自来水冷却至室温,加水定容至25ml,电磁振荡3s.以标准空白样为空白对照,在540nm处测定吸光度AE.8.试样酶活力的计算[(AE - AB)×K + CO]XD = × 1000 (1)M×t式(1)中:XD —试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml;AE —酶反应液的吸光度;AB —酶空白样的吸光度;K —标准曲线的斜率;CO —标准曲线的截距;M —葡萄糖的分子量(180.2);t —酶解反应时间,min;1000 —转化因子,1mmol = 1000 umol.XD值应在0.04—0.08 u/ml之间.如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进行分析测定.X = XD•Df (2)式(2)中:X —试样纤维素酶的活力,u/g;Df —试样的总稀释倍数.酶活力的计算值保留三位有效数字.9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%,二者的平均值为最终的酶活力测定值(保留三位有效数字)1.药品、试剂及仪器脂肪酶(Novezymes公司)，0.0667mol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH值为7.38；)，脂肪酸显色剂(5%醋酸铜溶液，用吡啶调节pH=6.2)，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，pH计，水/油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
纤维素酶活力!!!
氢氧化钠溶液，c（NaOH）=2mol/L m=8g，V=100ml以上试剂配制均缩小10倍表一标准曲线的测定管号0 1 2 3 4 5 葡萄糖/mL 0.0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1蒸馏水/mL 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0.0显色液/mL 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3沸水浴中煮沸显色10min,冷却蒸馏水/ml 2.1以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
表二样品的测定编号空白样品酶液/mL 0.1（煮沸5-10min) 0.1CMC/mL 0.3 0.350℃恒温30min显色液/mL 0.3 0.3沸水浴中煮沸显色10min,冷却蒸馏水/ml 1.8图一：标准葡萄糖光吸收曲线结果分析：拟合所得的标准曲线为：Y=7.439×10-4X-0.00243。
拟合度为0.99917。
由样品的A值，可得三份溶液的葡萄糖含量分别为：652.5ug，648.5ug，653.9ug。
所以平均含量：651.6ug。
纤维素酶活力单位=651.6/0.01×30=2172 ug/mg×min【思考与讨论】1、在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致。
2、在测溶液的OD值之前，应将溶液摇匀，摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口，然后来回震荡试管。
1．DNS 溶液配制时，将含DNS的 NaOH溶液加到含酒石酸钾钠的热水溶液中时，一定要慢倒，边倒边搅拌，以防被烫。
2．纤维素酶液的浓度可根据不同酶制剂的活力而相应调整。
如果酶活力高，酶浓度可小些；反之，酶活力低时，酶浓度则大些。
3．在测定时，调零用 1 号管液一定在相应的各管液测定完成后，方可从比色杯中弃掉。
5．用移液管或加液器加各试剂时，不能将移液管或取液枪头混用。
纤维素酶的主要酶学性质的研究
纤维素酶的主要酶学性质的研究
张瑞萍;方云
【期刊名称】《纺织学报》
【年(卷),期】2003(024)001
【摘要】用DNS为显色剂,以滤纸和CMC为底物,测定纤维素酶A的滤纸酶活和CMC酶活(FPA和CMCA),探讨纤维素酶A的主要酶学性质.结果表明:FPA和CMCA的最适温度范围为50℃～60℃和50℃～70℃;最适pH为5.0和4.6～5.0.【总页数】2页(P59-60)
【作者】张瑞萍;方云
【作者单位】南通工学院化工系,南通,226007;无锡轻工大学化工系
【正文语种】中文
【中图分类】TS101.921
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测试与标准纤维素酶活力测定方法张瑞萍 南通工学院(226007)摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。
确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。
结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。
叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。
纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。
我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。
由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。
本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。
1 实验方法1.1 化学药品、材料纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。
1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。
酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。
1.3 针织物酶减量率的测定将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。
减量率=处理前织物干重-处理后织物干重处理前织物干重×100%2 结果与讨论2.1 显色剂的选择选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。
碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下:O 2NOHO 2NCO OH +还原糖 H 2N OH CO OHO 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。
2.2 最大吸收波长的确定选取490～580nm 波长对显色液进行比色。
由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。
为了排除DNS 的干扰,选择在波长530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。
图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线2.3 底物及酶本身含糖量的影响在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。
而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。
为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。
2.4 葡萄糖标准曲线用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。
标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。
38印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn 图2 葡萄糖标准曲线2.5 底物的选择对酶活力的影响目前理论认为,大多数由微生物产生的纤维素酶是一个多组分酶系,主要含有三种组分:内切- -1,4-葡聚糖酶、外切 -1,4-葡聚糖酶和 -1,4-葡萄糖苷酶。
其中,内切(endo-)酶能进攻纤维素大分子链的中间部位,任意地切断大分子,而生成较短的链;而外切(ex o-)酶仅从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维二糖; -葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成葡萄糖。
纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终效果,是由其中各种酶综合作用所决定的。
作为底物的滤纸其结构较为松散,可及区较多,非还原性末端也较多,容易同时被内切酶和外切酶降解,再由 -葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖。
用比色法定量测定还原糖的生成量,可反映纤维素酶的总酶活力。
由于外切酶对纤维素链专一性高,而内切酶专一性较低,在降解羧甲基纤维素(CMC)时,主要是反映内切酶的活力。
我们选择三种酸性纤维素酶,分别以滤纸和CM C 为底物,其酶活力(FPA和CM C ase)的测试数据结果如表1所示。
表1 不同酶种的滤纸酶活(FPA)和C MC酶活(CMC ase)酶活, 杰能科NOVO L PLU S LFPA71.6330.9227.27CM C ase528.16417.40327.83 从表1可知,CMCase和FPA两种酶活的大小顺序是:杰能科>NOVO L>PLUS L。
这几种酶的内切酶活(CM C ase)较高,且比总酶活(FPA)大,几乎相差一个数量级,这说明酶对水溶性底物有很高的活力.而滤纸与酶属多相催化,酶也是高分子物,所以反应的空间阻碍较大,这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。
2.6 纤维素酶活与织物酶减量率的关系用这几种酶对织物进行整理,织物的减量率与酶种及酶量的关系如图3所示。
从图3可看出,当三种酶的用量分别为2%、4%、6%、8%、10%(ow f)时,对应的减量率的比值平均(杰能科∶NOVO L∶PLUS L =1∶0.87∶0.76),这与不同酶的CM C ase酶活比值(杰能科∶NOVO L∶PLU S L=1∶0.79∶0.62)是相近的。
图3 酶用量对减量率的影响2.7 纤维素酶活与酶用量的关系从图3看出,不同酶种在织物上获得相同减量率时的酶用量如表2所示。
表2 不同酶种相同减量率的酶用量单位:%(o wf)酶种减量率,%1234杰能科0.6528 1.7970 3.1578 4.9424NOVO L0.8115 2.1057 3.7156 6.1567PLUS L 1.0272 2.5678 4.6404- 从表2知,织物减量率为1%、2%、3%、4%时的酶用量比值平均为:杰能科∶NOVO L=(0.83∶1),杰能科∶PLUS L=(0.67∶1)。
这与不同酶的CM C ase酶活比值(杰能科∶NOVO L∶PLUS L=1∶0.79∶0.62)也是一致的。
从纤维素酶活CMCase与织物的酶减量率和酶用量的关系发现,织物的酶减量率与内切酶活(CM C ase)关系密切。
所以,在实际生产中,使用不同牌号的纤维素酶时,制订处方要根据酶活力,特别是内切酶活力的大小,通过测定织物的整理效果来决定。
3 结论3.1 试验表明,葡萄糖浓度与吸光度OD值的相关系数在0.9991,确定该标准曲线可用于酶活力测定。
3.2 确定DNS为显色剂,酶活力测定用波长为530 nm,参比溶液为失活酶、底物和DNS等共热反应物。
3.3 底物不同,活力的测定值也不同。
以羧甲基纤维素为底物测得的酶活值CMC ase,比以滤纸为底物测得的酶活值FPA高。
这说明酶对水溶性底物有较高的活力,同时也表明,吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。
3.4 对于不同牌号的纤维素酶,织物酶减量率与内切酶活(CM Case)有密切的比例关系。
(收稿日期:2002-03-15)39 纤维素酶活力测定方法 印 染(2002No.8)DYEING AND FINISHING(Monthly) Vol.28,No.8,Aug.,2002 feasi ble and more stabl e shade than tw o bath process.Key Terms Dip d y eing One bath method Disp erse dye Reactive d y e ……………………………………………………………………………………………………………………………Li Congyuan(28) Enzyme Treatment of Silk-Ramie Mixture FabricEnzyme treatment of silk ramie mixture fabric w i th cell ula se was ca rri ed out.The opti mum process condition to control enzyme finish w a s studi ed.Key Terms Finish Cellulase Mixture f abric Ramie M ulberry silkworm …………………………………………………………………………………………………………………………Huang C uirong(30) Clean Production of Lyocell Dyeing and FinishingBased on the practice production,the possi bili ty of clean producti on of dyeing and finishing to Lyocell fabric was discussed.The process of envi ronmental friendly production for Lyocell fab ri c was determ i ned.Key Terms D yeing and f inishing Environmental protection Cellulose f iber Lyocell ……………………………………………………………………………………………………………………………Gao Peng et al(33) The Application of Alkali Deweighting Process to LiningsIn this a rti cl e,soft and ela stic l ini ngs substrates employed super micro polyester DTY in b oth weft and w arn yarns.The alkali deweighti ng process w a s moni tored by rea l ti m e on li ne system on high temperature pressure overflow dyeing machine. The process parameters w ere a nal yzed and the suitable process was summ a rized.Key Terms Base deweighting f inish Process p arameters Padding cloth ………………………………………………………………………………………………………………………………Du Shuf ang(36)・MEASURING TEC HNIQUES・Activity Determination of CellulaseUsing DNA a s developer,fil ter pa per a nd CM C as base,the activity of cell ula se was determ i ned and compared by FPA and CM Case,under the conditi on of w avelength530nm,and usi ng deacti vati on enzyme,ba se,D NS as reference solution.The result showed that the activity of cel lul ase of CM Case was hi gher tha n that of FPA.Thi s m eans that cell ula se ha s higher acti vity to sol ubl e base.As for different cellulase with di fferent trademark,there is close rel ationship betw een dewei ghting rate of cell ul ase and activity of CM C.Key Terms Testing Cellulase Activity …………………………………………………………………………………………………………………………Zhang Ruiping(38)・LECTURES・Anti-Mite Finish of Textiles(II)Anti mite finish of textil es w i th chemicals can reduce breedi ng of i ndoor mite a nd i mprove the indoor sanitati on.The sym bi osis of i ndoor mi croorgani sm,kinds of mite and its harm,anti mite agents,test method of anti mite effects a s well as the anti mi te effect using carboxyl ic ester are all i ntroduced.Key Terms Anti-microbial f inish Chemical f inish Textile …………………………………………………………………………………………………………………………Yang Dongliang(40)・COMPREHENSIVE REVIEW・Progress and Developments in Reactive Dyestuf f and Its Dyeing Process(Ⅶ)The progress i n reactive dyestuff w a s reviewed.This included col or b odi es,reactive groups,especia lly the relati onships betw een eco dyeing properties a nd d yestuff structure.The relati onshi ps betw een m i xture,after treatment of dyestuffs and sha de,deep dyeing,washabil ity a nd col or fastness w ere ana lyz ed.It is pointed out tha t ra tional mixture of dyestuff i s a feasi ble technique w hi ch is not only for dyestuff manufacture,but a lso for the appli cati on of the dyestuff.The devel opments of rea cti ve dyestuff process w ere review ed i n the second part of this paper,for i nsta nce the relati onshi ps betw een substanti vity and l ow salt dyei ng,l evel ling dyeing a nd control led dyeing,deep dyeing a nd deep shad e dyestuff,col or fastness a nd fast col ors.At la st,the dyeing processes of new fiber,non cellulose fiber and multi components fiber w ere introduced.The achievements a chi eved by the author in some research fi el ds w ere introduced.Key Terms D yeing Reactive d y e Technique Develo pmentSong Xinyuan et al(44)………………………………………………………………………………………………………………………・OVERSEAS NEWSBRIEFS・・DOMESTIC NEWSBRIEFS・・ABSTRACT OF DYEING AND FINISHING・………………………………………………………………………………………………………Advertising Index(53) 54。