测定糖化酶活性的方法

SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。

(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。

糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。

生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。

黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。

首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。

糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。

葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。

酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。

3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。

4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。

糖化酶活性检测试剂盒说明书微量法UPLC-MS-4240100T/48S试剂名称规格保存条件提取液液体70mL×2瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2瓶2-8℃保存试剂二液体18mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前取1瓶加入10mL提取液，充分混匀后沸水浴直至溶解（约10min），2-8℃保存4周；2、标准品：10mg无水葡萄糖，临用前加1mL提取液溶解为10mg/mL的葡萄糖标准品备用，2-8℃保存两周；糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶。

糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。

多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。

糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540nm 处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活力。

Soluble Starch Glycosylase GlucoseGlucose+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate（540nm）注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器，超声破碎仪、冰和蒸馏水。

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

糖化酶活力测定1. 定义1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。

2. 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。

3. 试剂和溶液(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。

称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。

配好后用 pH 计校正。

(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。

(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。

(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。

(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。

(6硫酸溶液(2mol/L。

(7 20g/L可溶性淀粉溶液。

(8 10g/L淀粉指示液。

4. 仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。

5. 步骤(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。

沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。

通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。

(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。

在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。

我国糖化酶的研究概况糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。

主要的内容包括：一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。

本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。

50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。

糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。

它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。

其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。

对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。

糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。

二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。

不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。

糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。

但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。

三、糖化酶的特性1、糖化酶的热稳定性在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。

工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。

一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。

实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。

2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。

本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。

碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。

I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。

原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。

试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。

倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。

2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。

3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。

取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。

以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。

4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。

5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。

可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。

2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。

三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

实验四糖化酶综合实验（一）糖化酶摇瓶实验一、实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。

二、实验原理摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过将装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。

三、实验材料1.菌种：黑曲霉（糖化酶生产常用菌种）2.培养基：玉米粉、豆饼粉、麸皮、水3.器材：500ml三角瓶、玻片四、方法步骤1. 配制培养基玉米粉 6%，豆饼粉 2%，麸皮 1%。

补足水分，原料浸入水中。

8层纱布+牛皮纸包扎，0.1MPa下灭菌30min。

500ml三角瓶 1瓶/小组，装液量分别为100ml 2个小组、200ml 2个小组2. 接种成熟斜面，在无菌条件下，注入10ml无菌水，振荡成孢子悬浮液。

待发酵培养基灭菌后冷却到30～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2ml，做好标记3. 培养将三角瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为200rpm，培养时间为96h4. 显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力五、实验结果1.比较两种不同装液量条件下的菌体形状特征、酶活力，将结果填入分析：由于摇瓶培养的时间未达到96小时。

所以，培养瓶内壁只出现少量黑色菌落。

但相对于100ml培养基中的菌体要多一些。

说明培养基量的多少会影响菌体的生长，培养基量多则营养多更有利于菌体快速旺盛生长，增殖。

因此，观察到的菌丝相对于100ml培养基中的菌丝多而粗。

培养时间一定要遵循菌体的生长曲线时间，不能过早或过晚结束培养。

应按照各种菌体与产物的模式，适时停止培养收集产物酶。

本实验摇瓶培养才72小时，未能使菌体充分生长，即菌数少，产酶量低，或培养时间还未达到菌体大量产酶的时段，这将影响后续酶的分离提取及活力测定。

培养基应适量，在不浪费原料的同时有能使菌体快速生长，并且控制培养基的量，将减轻酶分里提取的工作量。

（二）糖化酶活力测定一、实验目的掌握糖化酶活力测定的原理与方法。

大曲糖化力测定方法
大曲糖化力测定方法是用于评估大曲中糖化酶的活性和效果的方法。

主要通过测定大曲在特定条件下对淀粉的糖化程度来确定糖化力。

以下是一种常用的大曲糖化力测定方法的步骤：
1. 准备样品：从大曲中取出一定量的颗粒或粉末样品，并对其进行研磨，使其尽可能均匀。

2. 制备试样：将一定量的样品（通常是5-10g）与适量的水混合，并在一定温度下搅拌一段时间，以使大曲中的酶完全溶解。

3. 糖化反应：将制备好的试样加入含有淀粉的反应液中，反应液的温度通常为50-60°C。

然后用水浴或恒温箱等设备将反应
液保持在一定温度下，进行糖化反应。

4. 反应时间：根据需要可设置不同的反应时间，常见的糖化反应时间为24-48小时。

5. 终止反应：用热水或其他方法迅速升温至85-95°C，以终止
糖化反应。

6. 反应产物分析：采用不同的分析方法，如高效液相色谱、薄层色谱等，对反应液中产生的糖类进行分析，并计算糖化率或糖化度。

通过这些步骤，可以获得大曲样品的糖化力数据，用于评估其对淀粉的糖化效果。