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微生物快速检测法（DME）1、原理细菌和酵母菌都能在染色后通过显微镜直接计数，本程序可以对淀粉糊浆中活菌/死菌微生物污染进行准确计数2、仪器及试剂1、显微镜，40X物镜下观察2、天平3、微波炉4、三联不锈钢过滤器（包括三联支架+真空泵）5、平口镊子6、0.8um/25mm过滤膜7、载玻片8、盖玻片9、异丙醇，100％10、吖啶橙染色剂11、浸油12、75％乙醇13、洗洁精14、无菌杯3、操作程序1取一洁净的无菌杯（可重复使用，用洗洁精加自来水清洗干净后，使用离子水冲洗至少三次）2称取样品（取13克加去离子水至103克）3使用微波炉将配置好的样品微热（使样品充分溶解）4用去离子水将三联过滤杯冲洗干净。
（开过滤器，开泵—关过滤器，关泵—开排气阀，排气抽真空）（注：后可加入75％乙醇5ml，放置1min后滤掉）5使用平口镊子放置滤膜，亮面朝上，滤膜与过滤砂芯中间无缝隙6取出热好的样品，过滤，至103克样品全部滤完7关过滤器，关泵，排气8加入2.5ml吖啶橙染色剂，使其溢满整个滤膜9染色一分钟后，关排气阀，开过滤器，开泵10使用异丙醇冲洗（至少2.0ml）11在等待染色的1min时，取一载玻片加一滴浸油12在泵开启的状态下，用镊子移下滤膜（有助于滤膜干燥，便于观察）13在滤膜上再加一滴浸油，盖上盖玻片并用镊子将盖玻片压实（便于观察）14将放好滤膜的载玻片放在显微镜的40倍物镜下观察15细菌和酵母菌呈现桔色或绿色（细菌为针尖大小的亮点，酵母菌呈有规则的圆形或椭圆形，多为两个呈三个连在一起）16取中间位置观察20个视野，菌落总数/ml为20个视野的平均值*8617观察时，应注意滤膜四周的细菌，最好每个角落能观察到注意：1每个检测过程都在通风橱中进行2此检测方法检测出的菌类为死菌和活菌的总数4、技术程序可以采用集中计算方法确定每毫升的菌数，需要确定显微镜的视野范围，这个面积就是显微镜在给定放大倍数内可观察到的视野范围的总面积。
一、实训目的1. 掌握观察酵母菌和霉菌形态的基本方法；2. 观察酵母菌和霉菌的形态特征；3. 学习使用显微测微尺测量微生物大小；4. 熟悉霉菌酵母菌计数的实验流程和操作方法；5. 提高食品微生物学检验技能。
二、实训原理霉菌和酵母菌是广泛存在于自然界和食品中的微生物，它们对食品品质和人体健康具有重要影响。
霉菌和酵母菌计数是食品微生物学检验的重要指标之一，通过计数可以了解食品中霉菌和酵母菌的数量，为食品卫生质量控制提供依据。
本实训采用直接镜检计数法，利用显微镜观察霉菌和酵母菌的形态特征，并通过显微测微尺测量其大小，从而进行计数。
三、实训材料与仪器1. 实验材料：酵母菌、霉菌纯培养物，食品样品；2. 仪器设备：显微镜、显微测微尺、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌培养皿等。
四、实训步骤1. 预备工作：a. 准备好实验所需的材料与仪器；b. 检查显微镜、显微测微尺等仪器的性能；c. 熟悉实验操作流程。
2. 观察酵母菌和霉菌形态：a. 将纯培养物接种于无菌培养皿中，培养至适宜生长状态；b. 取少量培养物，涂布于载玻片上；c. 将载玻片置于显微镜下，观察酵母菌和霉菌的形态特征，如菌丝、分生孢子、菌落等。
3. 使用显微测微尺测量微生物大小：a. 将显微测微尺放置于显微镜载物台上；b. 对准显微镜视野中的微生物，调整测微尺的刻度；c. 记录微生物的长度。
4. 霉菌酵母菌计数：a. 将纯培养物接种于血球计数板中，培养至适宜生长状态；b. 将血球计数板放置于显微镜下，观察菌落；c. 记录每个视野中菌落数量；d. 计算霉菌酵母菌总数。
5. 结果分析：a. 分析实验数据，得出霉菌酵母菌计数结果；b. 对比实验结果与理论值，分析误差原因。
五、实训结果与分析1. 观察酵母菌和霉菌形态：实验中观察到酵母菌为单细胞，呈圆形或椭圆形，细胞壁厚，具有芽生繁殖方式；霉菌为多细胞真菌，菌丝体发达，无较大的子实体，具有分枝、分生孢子等特征。
![酵母菌大小测定及显微镜直接计数[指南]](https://img.taocdn.com/s1/m/455b9f37ae45b307e87101f69e3143323968f51b.png)
实验一：酵母菌大小测定一、实验器材1、菌种：酵母菌液体培养物2、仪器和其他物品目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸，载玻片，滴管等。
二、实验目的及要求1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。
2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。
三、基本原理微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。
镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。
四、操作步骤1、装目镜测微尺(换目镜)把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝上放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
※双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时目镜测微尺一般都安装在右目镜中。
2、校正目镜测微尺（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
（2）校正先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
酵母菌地形态观察及死活鉴别与显微直接计数法酵母菌地形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法I 酵母菌地形态观察及死活鉴别一、目地要求观察酵母菌地细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞地实验方法.二、基本原理酵母菌是多形地、不运动地单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显地分化，菌体比细菌大.繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；地.0.1(1)(2)泡.(3)(1)II1．明确显微镜计数地原理.2．学习使用血球计数板进行微生物计数地方法.二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用地微生物计数方法.此法地优点是直观、快速.将经过适当稀释地菌悬液(或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间地计数室中，在显微镜F进行计数.由于计数室地容积是一定地(0.1mm3)，所以可以根据在显微镜下观察到地微生物数目来换算成单位体积内地微生物总数目.由于此法计得地是活菌体和死菌体地总和，故又称为总菌计数法.血球计数板，通常是一块特制地载玻片，其上由四条槽构成三个平台.中间地平台又被一短横槽隔成两半，每一边地平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间地大方格即为计数室，微生物地计数就在计数室中进行.计数室地刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格.；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格..但无论是哪种规格地计数板，每一个大方格中地小方格数都是相同地，即16 X 25：400小方格.每一个大方格边长为1mm，则每一大方格地面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间地高度为0.1mm，所以计数室地容积为0.1mm3.25，因B (个1ml1234静止.一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜.每个计数室选5个中格(可选4个角和中央地中格)中地菌体进行计数.位于格线上地菌体一般只数上方和右边线上地.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞地一半时，即作两个菌体计数.计数一个样品要从两个计数室中计得地值来计算样品地含菌量.5．清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干.镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物.若不干净，则必须重复洗涤至干净为止.五、实验报告1．结果将结果记录于下表中.A表示五个中方格中地总菌数；B表示菌液稀释倍数.2．思考题根据你实验地体会，说明用血球计数板计数地误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差，力求准确？。
