细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证1份ok(内容充实)

霉菌、酵母菌检验（一）实验原理霉菌和酵母菌菌数的测定是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g 或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数（粮食样品是指1g粮食表面的霉菌总数）。

（二）实验器材1.培养基：马铃薯－葡萄糖－琼脂培养基马铃薯（去皮切块）300 g葡萄糖20.0 g琼脂20.0 g氯霉素0.1 g蒸馏水1000 mL制法：将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10 min－20 min。

用纱布过滤，补加蒸馏水至1000 mL。

加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121 ℃灭菌20 min。

倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。

2.器皿：已灭菌的平皿（9套/组），1mL吸管（6支/组），试管（15×150）（6/组），三角锥瓶500mL、三角锥瓶500mL（内装蒸馏水250mL），10mL吸管。

3.其他：牛皮纸或报纸，酒精灯，棉花，高压蒸汽菌锅，电烘箱，线绳，毛刷等。

（三）操作步骤1.检验程序2.操作要点1）采样选取有代表性的样品并避免采样时的污染。

2）样品处理（1）以无菌操作称取检样25mL，放入含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30 min，即为1:10稀释液。

（2）用灭菌吸量管吸取1:10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL 灭菌吸量管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

（3）取1mL 1:10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸量管吹吸5次，此液为1:100稀释液。

（4）按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸量管。

3）接种培养根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45 ℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25－28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。

4）计算方法通常选择菌落数在10－150之间的平皿进行计数，一个稀释度使用两个平板，采用两个平板的平均数；选择稀释度也选择平均菌落数在10－150之间的稀释度，菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母数。

有限公司GMP管理文件一、U的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。

二、适用范圉：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。

三、责任者：质量标准分析方法验证小组。

四、正文：1、验证申请2、验证立项申请表3、验证方案4、验证方案的批复5、验证报告6、验证报告的审批、验证证书7・文件编码第2页细菌.霉菌及酵母菌计数方法验证申请细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。

我公司细菌、霉菌及酵母菌讣数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。

请予以批准！附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单组长：成员:申报单位：质量标准分析方法验证小组申报日期：年月日文件编码第3页验证申请批复文件编码第4页细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案—、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。

2、H的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。

3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2003年版附录乂叮4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。

化验室：负责验证情况的检测和监督。

总经理：负责对验证结果进行评价。

5、验证日期：二.验证1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。

按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。

2、内容:（1）菌液所用的菌株传代次数为3代，接种大肠埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种口色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0. 9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为60cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0. 9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱。

实验 食品中细菌总数、霉菌和酵母菌的检验一、实验目的要求1、了解细菌总数检验的意义。

2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国际法测定菌落总数的方法和技能4、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能5、熟练无菌操作技术。

二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。

菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。

霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。

霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。

霉菌和酵母也可造成中腐败变质。

由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。

由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。

霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。

例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。

因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。

目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。

我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。

三、试剂和仪器细菌总数的检验部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml广口瓶 1个 稀释样品2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支 稀释样品5、1ml移液管 5 支6、直径为90mm平皿 10套 倒营养平板7、250ml量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm（二）应灭菌、消毒的器材剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只， 开瓶器（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1、0.85%NaCl生理盐水 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2、营养琼脂： 2瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶食品中霉菌和酵母菌的计数部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml广口瓶 1个 稀释样品2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支 稀释样品5、1ml移液管 ５ 支6、10ml移液管 1支6、直径为90mm平皿 10套 倒平板7、250ml量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm 适量（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1.灭菌蒸馏水： 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2.高盐察氏培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶3.孟加拉红培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶四、实验内容细菌总数的检验部分：（一）、基本操作过程：样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。

一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。

二、适用范围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。

三、责任者：质量标准分析方法验证小组。

四、正文：1、验证申请2、验证立项申请表3、验证方案4、验证方案的批复5、验证报告6、验证报告的审批7、验证证书细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。

我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。

请予以批准！附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单组长：成员：申报单位：质量标准分析方法验证小组申报日期：年月日验证申请批复细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案一、概述：1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。

2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。

3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ4、验证人员：质保部：负责对验证结果进行评价。

化验室：负责验证情况的检测和监督。

总经理：负责对验证结果进行评价。

5、验证日期：二、验证1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。

按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。

2、内容：（1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数—检验方法比较霉菌酵母菌在自然界中分布极广，种类繁多，食品中易受到不同程度的污染。

食品中霉菌酵母菌的增殖一般会导致营养价值下降、酸败变味或外观恶化等，影响货架期及口感，若霉菌、酵母菌含量较高，且日摄入量较多，会影响人体肠胃内的微生物平衡，甚至造成肠胃不适，可能引起疾病发生。

霉菌对干食品的最大风险主要是在适宜的条件下(产毒株、数量、温度、湿度、水分活度等），能产生霉菌的有毒代谢产物—霉菌毒素，引起过敏反应等各种急、慢性中毒及可能的致癌作用。

因此，人们愈来愈重视食品中霉菌及酵母菌污染对人体造成的危害。

在我国国家部分食品产品及卫生标准中，把霉菌和酵母菌作为常见指示菌进行监测和控制，如饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品。

霉菌和酵母的检测被列入国标4789 系列食品安全微生物常规检测项目之一 , 霉菌酵母菌的检验方法看似简单，但由于食品种类繁多成分复杂，食品中存在的霉菌种类较多，对环境温湿度及营养成分的要求有所不同，要在同等条件下把所有的霉菌培养出来，反映出样品的真实情况，实属不易，且霉菌前期生长速度缓慢，后期菌丝急剧增加，特别是毛霉的蔓延，给霉菌和酵母菌的同时计数带来一定的困难，如何能更准确、快速提离食品中霉菌检测数目是食品卫生部门面临的一个严峻问题。

能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验能力的外部质量活动,组织方提供试验的样本，一般会考虑增加检测难度。

为了更准确更全面得出能力验证结果，本实验室综合了多种方法进行同步检测，主要是考虑霉菌、酵母菌总数检测是通过平板中生长的菌落数目直接计数推算，培养基的质量和培养方式直接影响了检测的结果，因此，选择两种常用的霉菌酵母培养基，采用正置和倒置培养法进行试验，比较分析不同培养基、不同培养方式对霉菌酵母菌计算结果的差异，进而得出较为准确的试验结果进行上报。

2 材料与方法2.1 样品能力验证样品：中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，样品编号为15-G068。

实验三食品中细菌总数、霉菌和酵母菌的检验一、实验目的要求1、了解细菌总数检验的意义。

2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国际法测定菌落总数的方法和技能4、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能5、熟练无菌操作技术。

二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。

菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。

霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。

霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。

霉菌和酵母也可造成中腐败变质。

由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。

由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。

霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。

例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。

因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。

目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。

我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。

三、试剂和仪器细菌总数的检验部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个配制生理盐水3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂4、18×180mm试管3支稀释样品5、1ml移液管 5 支6、直径为90mm平皿 10套倒营养平板7、250ml量筒1支8、玻璃珠：直径约5mm（二）应灭菌、消毒的器材剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1、0.85%NaCl生理盐水 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2、营养琼脂： 2瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶食品中霉菌和酵母菌的计数部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个配制生理盐水3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支稀释样品5、1ml移液管５支6、10ml移液管1支6、直径为90mm平皿 10套倒平板7、250ml量筒1支8、玻璃珠：直径约5mm 适量（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只（三）应制备的培养基培养基总量所用容器1.灭菌蒸馏水： 1瓶 300ml/瓶500ml三角瓶2.高盐察氏培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶3.孟加拉红培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶四、实验内容细菌总数的检验部分：（一）、基本操作过程：样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。

细菌霉菌和酵母菌计数1 简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。

也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。

细菌、霉菌和酵母菌计数除另有外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。

以琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。

该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、pH 和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。

一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。

因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu）不应理解为细菌、霉菌和酵母菌的个数。

在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。

2 设备、仪器2.1 设备2.1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。

2.1.1.1 结构和要求见无菌检查法2.1.1.2 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。

环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

操作间的净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9pa。

操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。

2.1.1.3 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。

缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。

2.1.1.4 洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

洁净级别尘粒数/m3 浮游菌（个）/ m3沉降菌（个）/（∮90mm·0.5h）微粒直径≥0.5µm 微粒直径≥5µm100级10000级100000级≤3，500≤350，000≤3，500，000≤0≤2000≤20，000≤5≤100≤500≤1≤3≤10沉降菌数测定（Ⅱ法）无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上，在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。

食品微生物学检验霉菌及酵母菌计数方法学验证报告一、验证目的验证GB4789.15-2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》在本实验室的适用性。

二、验证方法严格按照GB4789.15-2016进行实验，样品采样方案依据GB4789.1-2016 《食品微生物学检验总则》的要求进行，选取三种物质形态不同种类的典型样品进行验证，本实验方法设计如下：样品种类样品名称样品编号实验人员实验方法糕点xxx xxx a、b 双人双平行蜂蜜xxx xxx c、a 双人双平行汽水xxx xxx c、b 双人双平行除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株黑曲霉（CICC2487），白假丝酵母（CICC1965）分别或者混合接种培养而成，与样品实验程序同时进行。

三、验证设备和试剂1.冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器2.霉菌培养箱：上海一恒科学仪器3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司5.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂6.菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司7.天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司8.超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业培养基和试剂：孟加拉红培养基北京陆桥技术股份有限公司四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、生物安全柜、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室、生物安全柜及超净台进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《XXXX》；五、验证步骤1.样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。

纯化水细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案及报告文件编号：**VP*****-*文件类别：验证***********公司验证方案批准验证小组人员名单目录1、引言 (5)2、验证参与部门及责任 (5)3、验证方法 (5)文件要求 (6)菌种 (6)菌液制备 (7)验证方法 (7)验证结果 (8)4、结果判断 (10)5、验证结论及评价 (11)6、验证报告批准书 (12)1.引言1.1概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证。

进行上述验证前，应首先对验证过程中使用的仪器、仪表及微生物限度检查的环境进行验证。

微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23-28℃；控制菌培养温度为35-37℃。

1.2验证目的确认所采用的方法适合于纯化水的细菌数、霉菌数、酵母菌数的测定。

1.3验证执行的文件超净工作台标准操作规程微生物限度检查法培养箱标准操作规程热压灭菌锅标准操作规程2. 验证参与部门及责任3.验证方法：3.1文件要求所需文件检查人：日期：3．2菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

确认人：日期：3．3菌液制备3．3．1分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基中，在36℃±℃培养18-24小时，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释至1:107,制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。

3．3．2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养24-48小时，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释至1:107,制成每1ml含菌数为50~100cfu 的菌悬液。