人重组5-脂氧合酶基因真核表达载体的构建和鉴定

P P A M基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果鉴定辛婧、沈亚非、邓飞\谢亚争、张日华2,刘云21.漯河市中心医院内分泌科，河南漯河462000;2•南京医科大学第一附属医院老年医学内分泌科摘要：目的构建过氧化物酶体增殖物激活受体y(PPARy)基因RNA干扰的真核表达载体，转染小鼠3T3-L1前体脂肪 细胞，并鉴定其干扰效果。

方法选择设计2条针对小鼠PPA R y基因的干扰耙序列，构建真核表达载体PLKO. 1-PPARy-GFP-shRNAl/2,以PCR鉴定并进行序列分析。

证实质粒构建成功后，转染小鼠3T3-U前体脂肪细胞，荧光显微镜下观察 绿色荧光蛋白（eGFP)的表达，计算转染效率;采用实时定量PC R法和W estern印迹检测载体对PPA R y基因的表达干扰效 果;采用油红染色观察PPA R y在脂肪细胞分化过程中对脂滴形成的作用。

结果成功构建PPA R y干扰质粒PLKO.1- PPARy-GFP-shRNAl/2，PC R和DNA测序证实序列与设计完全一致;荧光显微镜下观察到3T3-L1细胞绿色荧光蛋白的表 达,证实重组质粒成功转人细胞，转染效率(92. 67士1.53)%;实时荧光定量PC R和Western B lot印记试验均显示PLKO. 1-PPARy-GFP-shRNAl/2转染的3T3-L1细胞PPARy基因分别被特异性抑制；耙点1干扰效率[(78. 2士2.1)%]高于耙点2 [(55.8±4.3)%],差异有统计学意义（P C0.05),靶点1初步鉴定为有效靶点。

油红染色显示PLKO. 1-PPARy-GFP-shR-NA1/2转染均可抑制3T3-L1脂肪细胞分化和脂滴聚集。

结论成功构建了耙向干扰PPA R y基因的shRNA真核表达质粒 PLKO.l-PPARy-GFP-shRNAl/2,并筛选出有效抑制靶基因的表达质粒，初步验证PPA R y基因对脂肪细胞分化的作用，为 进一步研究提供了有效的分子生物学工具。

五年2018-2022高考生物真题按知识点分类汇编92-生物技术与工程-基因工程的操作程序综合题（含解析）一、单选题1．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（）A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。

表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。

表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNAD．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。

用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。

表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置2．（2020·北京·统考高考真题）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。

我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。

以下表述错误的是（）A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合D．可用抗原-抗体反应检测抗体基因表达产物二、综合题3．（2022·全国·统考高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。

回答下列问题。

(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。

这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。

根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。

(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。

年度“国家精品课程”申报表
（本科）
推荐单位基础医学专业教案指导委员会
所属学校山东大学（部属）
课程名称系统解剖学双语精品课程
课程类型□ 理论课（不含实践）√□理论课（含实践）□实践(验)课所属一级学科名称医学
所属二级学科名称基础医学类
课程负责人刘执玉
申报日期年6月14日
中华人民共和国教育部制
二○○七年四月
填写要求
一、以文档格式如实填写各项。

二、表格文本中外文名词第一次出现时，要写清全称和缩写，
再次出现时可以使用缩写。

三、涉密内容不填写，有可能涉密和不宜大范围公开的内容，
请在说明栏中注明。

四、除课程负责人外，根据课程实际情况，填写～名主讲教
师的详细信息。

五、本表栏目未涵盖的内容，需要说明的，请在说明栏中注明。

1．课程负责人情况
课程类别：公共课、基础课、专业基础课、专业课课程负责人：主持本门课程的主讲教师
. 主讲教师情况⑴
课程类别：公共课、基础课、专业基础课、专业课. 主讲教师情况⑵
课程类别：公共课、基础课、专业基础课、专业课
. 主讲教师情况⑶
课程类别：公共课、基础课、专业基础课、专业课. 主讲教师情况⑷
课程类别：公共课、基础课、专业基础课、专业课. 教案队伍情况
学缘结构：即学缘构成，这里指本教案队伍中，从不同学校或科研单位取得相同（或相近）学历（或学位）的人的比例。

．课程描述。

表达质粒的构建一、表达载体的构建表达载体是指具有宿主细胞基因表达所需调控元件，能使克隆的基因在宿主细胞内转录与翻译的载体。

也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增;表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。

外源基因在受体细胞内表达与否及表达水平受到许多因素(调控元件)的制约。

1、正确的阅读框架外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。

外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。

2、目的基因有效转录的启动子启动子是DNA链上一段能与DNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。

原核启动子是有两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为-35区和-10区。

-35区序列为TTGACA，-10区的序列为TATAAT。

两序列之间的最佳间距为17bp。

可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。

由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。

原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。

(1) 大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调节控制(2) 大肠杆菌的trp启动子是色氨酸操纵子启动子，受trpR编码的阻遏蛋白调节控制(3) tac启动子，由lac启动子的-10区和trp启动子的-35区融合而成，汇合了lac和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调节控制(4) lacUV5启动子是经紫外线诱变改造的lac启动子，该启动子失去了CAP和cAMP的证调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录(5) 噬菌体的λP启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻遏蛋、LR白受温度调控的很强的启动子(6) T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7RNA 聚合酶所识别。

里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。

刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。

方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。

结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。

ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。

结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。

关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅＬ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ・ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。

名词解释：1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。

2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。

其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。

3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。

.基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。

Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。

plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。

质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性.multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。

能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。

粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。

并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。

HDAC1重组腺病毒载体的构建及鉴定马珊珊;张琨;邢衢;黄团结;程康;关方霞【摘要】利用Ad-Easy腺病毒表达系统构建含有人源性组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因的重组腺病毒,并检测其在脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)中的表达及对hUC-MSCs增殖的影响.RT-PCR扩增人HDAC1ORF序列,构建pAdTrack-CMV-HDAC1重组腺病毒穿梭质粒,PmeI单切后将其转化进入E.coli BJ5183与腺病毒骨架质粒同源重组,PacI单切线性化后转染至HEK293细胞中扩增和包装pAd-HDAC1,采用空斑法鉴定病毒滴度;pAd-HDAC1感染hUC-MSCs,倒置荧光显微镜下观察荧光表达,qRT-PCR和Western Blot分别检测细胞中HDAC1在mRNA水平和蛋白水平的表达,CCK-8实验检测HDAC1高表达对hUC-MSCs增殖的影响.结果显示成功扩增人HDAC1ORF序列并构建pAd-HDAC1重组腺病毒;病毒感染后hUC-MSCs中HDAC1 mRNA和蛋白表达水平明显增高,并且促进hUC-MSCs的增殖.成功构建HDAC1高表达的腺病毒,可有效提高hUC-MSCs中HDAC1的表达并促进细胞增殖.【期刊名称】《郑州大学学报（理学版）》【年(卷),期】2016(048)002【总页数】5页(P101-104,126)【关键词】组蛋白去乙酰化酶1;腺病毒载体;脐带间充质干细胞;增殖【作者】马珊珊;张琨;邢衢;黄团结;程康;关方霞【作者单位】郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001;郑州大学生命科学学院河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】R394.2组蛋白乙酰化修饰是一种表观遗传修饰，它不改变细胞DNA 序列，通过组蛋白乙酰化酶(histone acetylases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)共同调控基因转录过程，在干细胞增殖、分化以及凋亡等多种生物过程中发挥重要作用[1].哺乳动物细胞中已经发现了18种HDACs[2]，在干细胞增殖和定向分化研究中关注较多的是HDAC1.目前研究较多的是使用基因缺失技术或者化学抑制剂抑制HDAC1的功能，分析其对干细胞分化的影响.研究表明，缺失HDAC1基因导致 ESCs 分化水平提高，并提高 ESCs中心肌细胞、肌肉细胞和神经细胞特异标记基因的表达[3].SAHA(HDAC抑制剂)通过提高心肌和平滑肌发育相关基因启动子的乙酰化水平，促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌和平滑肌细胞定向分化[4].但是HDAC1高表达对人源性脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)的增殖和分化的影响还未见明确报道.为此，本研究利用Ad-Easy腺病毒载体构建含有HDAC1基因的重组腺病毒，并制备出病毒，感染hUC-MSCs，探究改变hUC-MSCs中HDAC1表达活性后对其增殖的影响，为深入研究HDAC1的双向调控对hUC-MSCs增殖和神经分化的影响提供实验依据.1.1 材料引物合成、测序、鼠抗人HDAC1、鼠抗人GAPDH抗体在生工生物工程(上海)股份有限公司完成或购买； RNA提取、逆转录、qRT-PCR试剂盒和Western Blot 等试剂购自TaKaRa公司.CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术公司； hUC-MSCs为实验室前期分离、鉴定和传代培养的细胞.1.2 HDAC1重组腺病毒载体的构建和包装使用Ad-Easy腺病毒载体系统制备HDAC1重组腺病毒载体.RNA提取试剂盒提取hUC-MSCs的总RNA，逆转录合成cDNA，以5′-GATAAGGTACCATGGCGCAGACGCAGGGCAC-3′(正向)和5′-CGGGCAAGCTTTCAGGCCAACTTGACCTCCT-3′(反向，下划线的碱基表示引入的酶切位点)为引物RT-PCR扩增HDAC1 ORF.然后将其插入到穿梭质粒pAdTrack-CMV的KpnI和HindIII位点之间，构成pAdTrack-CMV-HDAC1；测序验证后提质粒，PmeI单切使质粒线性化并将其转化进入E.coli BJ5183菌株中，与腺病毒骨架质粒(pAdEasy1)进行同源重组后获得重组腺病毒质粒pAd-HDAC1；pAd-HDAC1经PacI单切线性化后利用Lipofectamine2000转染至HEK293细胞进行病毒包装.1.3 pAd-HDAC1重组腺病毒的扩增HDAC1基因随着重组腺病毒在感染的HEK293细胞中大量扩增.当HEK293细胞出现明显病变时，收集细胞，液氮反复冻融4次，12 000 rpm离心10 min后取上清即可收获大量重组腺病毒.1.4 重组腺病毒的滴度测定采用空斑法测定病毒滴度.pAd-HDAC1病毒原液用DMEM/高糖培养基以10倍梯度依次稀释，分别感染对数生长期的HEK293细胞，使病毒稀释液与细胞充分接触，37 ℃细胞培养箱中孵育1 h后，弃培养液，每孔加入1 mL配好的琼脂培养基使其均匀覆盖细胞，待琼脂培养基凝固后将板置于培养箱中继续孵育.每天于固定的时间观察各孔中空斑形成情况，计数一次，待空斑数目稳定不变(约7～10 d)时停止.根据孔中发生完全病变的细胞数量，计算出收集的腺病毒滴度(pfu/L).病毒感染滴度(pfu/L)=相同稀释度空斑均数×稀释倍数/病毒液体积.1.5 pAd-HDAC1重组腺病毒感染hUC-MSCs取第3代的hUC-MSCs，待其达到80%融合时，PBS漂洗1次加入感染复数为10 的pAd-HDAC1病毒进行感染(感染组)，以正常培养的P3 hUC-MSCs作为对照组，以pAd-GFP空病毒感染P3 hUC-MSCs作为阴性对照组.将2组细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h后倒置荧光显微镜下观察细胞形态和荧光表达情况.1.6 qRT-PCR检测HDAC1 mRNA的表达收集上述感染的hUC-MSCs，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH作为内参.按照试剂盒说明书配制qRT-PCR反应体系，每组3个重复孔，利用Fast7500 Real Time System进行PCR，95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环.反应结束后记录扩增曲线和溶解曲线，HDAC1的相对表达量(RQ)=2-ΔΔCt，以Graphpad Prism 5作图.1.7 Western Blot检测HDAC1蛋白的表达对上述3组细胞提取总蛋白，测定蛋白浓度后各取100 μg进行SDS-PAGE电泳.切割目的蛋白条带，电转至PVDF膜，然后用50 g/L的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，鼠抗人HDAC一抗(1∶1 000稀释)或鼠抗人GAPDH一抗(1∶500稀释，作为内参)4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次洗去一抗,每次15 min.用辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗在室温条件下温孵育2 h，TBST洗膜3次，用ECL化学发光显影成像.1.8 CCK-8实验hUC-MSCs的增殖将上述3组细胞浓度调整为3×104/mL,分别取100 μL细胞接种于96孔板，每孔各接种3 000个细胞，每组设5个复孔.分别于1、2、3、4、5天后换成新鲜培养基，避光条件下每孔加10 μL CCK-8溶液并继续培养2 h.酶标仪检测450 nm处的吸光度值，记录数据并绘制细胞的生长曲线.1.9 数据处理采用SPSS 18.0进行统计学分析，应用单因素方差分析 3组细胞中HDAC1 mRNA相对表达量和细胞吸光值的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05.2.1 pAd-HDAC1重组腺病毒的构建提取hUC-MSCs的总RNA，获得浓度较高纯度较好的总RNA(图1A).RT-PCR扩增出大小为1 400 bp左右的条带(图1B)，测序后确定为人HDAC1序列.pAdTrack-CMV-HDAC1质粒与pAdEasy1在BJ5183菌体内同源重组后，PacI酶切鉴定得到1条大于23 kb的腺病毒基因组片段和1条4.5 kb的Ori和氨苄青霉素抗性编码基因片段(图1C)，表明 pAd-HDAC1重组腺病毒质粒已成功构建.2.2 重组腺病毒pAd-HDAC1的滴度测定PacI线性化后的pAd-HDAC1，经Lip2000转染至HEK293细胞进行包装和大量扩增.然后利用空斑法计算病毒滴度.在24孔板中接种293细胞，然后用不同浓度的病毒感染细胞，根据孔中发生细胞完全病变的细胞数量，计算出收集的pAd-HDAC1重组腺病毒滴度(pfu/L)约为2.1×1010 pfu/ L.2.3 pAd-HDAC1感染hUC-MSCs及HDAC的表达检测pAd-GFP和pAd-HDAC1感染hUC-MSCs 48 h后，倒置荧光显微镜下可观察到明显的荧光(图2B、C)，说明腺病毒已经进入hUC-MSCs.qRT-PCR和Western Blot检测显示pAd-HDAC1感染组中HDAC1 mRNA和蛋白的表达明显高于空病毒组和对照组中的表达(图2D、E).该结果说明pAd-HDAC1腺病毒已经进入hUC-MSCs并在细胞中成功表达.2.4 pAd-HDAC1对hUC-MSCs增殖的影响如图3所示，pAd-HDAC1感染组细胞的增殖速率明显高于对照组细胞(P<0.05)，该结果说明HDAC1高表达能够促进hUC-MSCs的增殖.HDACs 通过使组蛋白去乙酰化与其他多种转录因子形成特定的转录复合物，调控基因转录过程导致基因沉默，参与细胞增殖、分化等多种活动[1].研究表明MSCs 定向诱导分化过程中，伴随着HDAC1表达水平的下调[5].研究人员发现抑制HDAC的活性能够促进ESCs、NSCs或者MSCs向神经细胞、肝脏细胞、肌肉细胞等多种细胞定向分化[3,4,6-8].因此，为了体外扩增获得足够数量的MSCs而避免MSCs的自发分化，可以通过提高HDAC1的表达而调控干细胞的增殖.与脂质体介导质粒转染相比，重组腺病毒表达载体[9]具有宿主范围广，感染效率高，毒性低、非整合宿主染色体等优点[10].因此，本研究应用Ad-Easy腺病毒表达载体系统[11]，即以携带 GFP 的腺病毒穿梭质粒(pAdTrack-CMV)和腺病毒骨架质粒(pAd-Easy1)作为载体成功制备含有HDAC1基因的腺病毒.该病毒含有CMV 启动子和GFP基因，可在荧光镜下直接观察感染效果，同时不会整合到宿主细胞基因组中，保证了实验的安全性.qRT-PCR和Western Blot结果显示，pAd-HDAC1感染hUC-MSCs后,HDAC1的mRNA和蛋白表达均明显提高，表明本研究成功构建了HDAC1高表达的腺病毒(pAd-HDAC1)，并在干细胞中表达.CCK-8结果显示,HDAC1高表达能够促进hUC-MSCs的增殖，但是对hUC-MSCs定向分化的影响还需要进一步实验验证.因此，本研究采用Ad-Easy系统成功构建了携带 GFP 的pAd-HDAC1重组腺病毒，pAd-HDAC1能有效感染hUC-MSCs，并促进MSCs在体外的增殖.该结果为下一步在体内水平研究pAd-HDAC1对hUC-MSCs增殖、定向分化和对神经系统疾病的治疗作用奠定基础，具有重要的研究意义.【相关文献】[1] WU H, SUN Y E. 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