霉菌与酵母菌计数方法(2015版药典)
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霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20~25℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度30~35℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(MPN法不适用),培养温度30~35℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株得传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3~5ml含0.05%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过得贮存期内使用、1。
3阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cfu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
为更好应用非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法(通则1105)、非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法(通则1106)及非无菌药品微生物限度标准(通则110 7),特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低,甚至使药品丧失疗效,从而对患者健康造成潜在的危害。
因此,在药品生产、贮藏和流通各个环节中,药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则,以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定,也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定,及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中,如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂,在确定其能否适用于所检样品及其用量时,除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性),因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株,而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下,应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基,用于培养基适用性检查,以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定,如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu,那么最高稀释级是1:10 3 。
霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准:《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1.微生物限度标准2.设备、仪器及用具3.消毒液、稀释剂、试液及培养基4.检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法,通则1106 非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法)5.微生物计数法检查6.控制菌检查法7.实验技术8. 附件1.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准(2).目测霉变者以不合格论。
(3).“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定。
2.设施、仪器及用具2.1、设施:2.1.1.微生物限度检查室及相关设施:微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2.其他设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(30~35℃);霉菌培养箱(25~28℃);电炉(或其他适宜的加热装置);恒温水浴;电热干燥箱(250~300℃);电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1.菌落计数器;显微镜(1500X);电子天平或药物天平(感量0.1g);pH系列比色计。
2.2.2.玻璃器皿:锥形瓶(250~300ml,内装玻璃珠若干)、研钵(玻璃或陶瓷制,∮10~12cm)、培养皿(∮9 cm)、量筒(100 ml)、试管(18×180mm)及塞、吸管(1ml 分度0.01,10 ml分度0.1)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁:先用流水冲洗,浸泡于1%~2%盐酸(工业用)液中约2~6小时,除去游离碱质,再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后,再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2~3次,晾干备用。
2.3用过的玻璃器皿:2.3.1未被病原微生物污染的器皿:可随时洗涤。
通则1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时,应按下述规定进行检验,包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外,本法不适用于活菌制剂的检查。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性,应尽可能去除或中和。
供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂,应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂,应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(Most-Probable-Number Method,简称MPN法)。
MPN法用于微生物计数时精确度较差,但对于某些微生物污染量很小的供试品,MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法,检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时,计数方法应重新进行适用性试验。
表1试验菌液的制备和使用注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
霉菌与酵母菌计数方法1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例)白色念珠菌(0)代↓传代培养↓实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基,培养温度20~25℃,培养时间2~3天↓计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度30~35℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu↓计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(MPN法不适用),培养温度30~35℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基1.1菌种试验用菌株得传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。
1。
2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)取白色念珠菌得新鲜培养物↓用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液取黑曲霉得新鲜培养物↓加入3~5ml含0.05%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱↓采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内↓用含0。
05%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。
9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过得贮存期内使用、1。
3阴性对照为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、2、培养基适用性检查按表1规定,接种不大于100cfu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板↓置表1规定条件下培养↓每一试验菌株平行制备2管或2个平皿↓同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验↓被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。
微生物限度检测方法验证操作规程1 目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。
2 依据《中国药典》2015版。
3 范围所有需进行微生物限度检测的产品。
4 责任4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。
4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批,验证/确认结论的审核。
5 程序5.1 由验证小组提出验证申请,验证方案编制完成后,填写《确认和验证方案审批表》,经验证小组会签,报验证委员会审核,由生产负责人和质量负责人批准后,验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后,方可按验证方案试验。
5.2 试验完成后及时编制验证报告,并填写《验证报告审批表》,经验证小组会签,报验证委员会审核,由生产负责人和质量负责人批准后,验证报告结论才可实施。
6 内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。
根据样品特性制订检验方法和检验条件,按制定的方案进行试验,根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合,按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查;若不符合,重新建立制订检验方法和检验条件,再进行验证,直至验证结果符合设立的验证标准。
6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]黑曲霉[CMCC(F)98 003]白色念珠菌[CMCC(F)98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中,于30~35℃培养18~24小时。
取上述培养物各1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液,备用。
6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中,于20~25℃培养2~3天。
一、范围:本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求;适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准:《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1.微生物限度标准2.设备、仪器及用具3.消毒液、稀释剂、试液及培养基4.检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法,通则1106 非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法)5.微生物计数法检查6.控制菌检查法7.实验技术8. 附件1.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。
(1).“—”为不得检出。
(2).目测霉变者以不合格论。
说明:1.“—”为每100 cm中不得检出。
2.目测霉变者以不合格论。
3.“无”为标准依据或无相应规定。
2.设施、仪器及用具2.1、设施:2.1.1.微生物限度检查室及相关设施:微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2.其他设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(30~35℃);霉菌培养箱(25~28℃);电炉(或其他适宜的加热装置);恒温水浴;电热干燥箱(250~300℃);电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿2.2.1.菌落计数器;显微镜(1500X);电子天平或药物天平(感量0.1g);pH系列比色计。
2.2.2.玻璃器皿:锥形瓶(250~300ml,内装玻璃珠若干)、研钵(玻璃或陶瓷制,∮10~12cm)、培养皿(∮9 cm)、量筒(100 ml)、试管(18×180mm)及塞、吸管(1ml分度0.01,10 ml分度0.1)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁:先用流水冲洗,浸泡于1%~2%盐酸(工业用)液中约2~6小时,除去游离碱质,再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后,再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2~3次,晾干备用。
1 目的规范微生物限度检验操作,确保检验结果准确、可靠2 依据《中国药典》 2015 版。
3 范围本标准适用于微生物限度检验。
4 责任中心化验室负责人:对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员:严格按照本规程执行检验操作5 程序5.执行标准:《中国药典》 2015 版。
15.抽样:照《取样标准操作规程》进行26 内容6.需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数1计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(MPN法)。
检查时,按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
6.1.1 设备、仪器及用具6.1.1.1 设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱(30〜35°C)、生化培养箱(20〜25°C)、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。
6.1.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。
6.1.1.3 用具大、小橡皮乳头,洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。
6.1.2 试液6.1.2.1 消毒液A .0.1% 新洁尔灭溶液B. 75聽醇溶液6.1.2.2 稀释液、试剂及配制A. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:取磷酸二氢钾 3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g,加纯化水1000ml,微温溶解,滤清,分装,121°C灭菌15分钟。
B. 聚山梨酯80C. 无菌十四烷酸异丙酯D. pH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3 培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基6.1.4 操作方法6.1.4.1 试验前准备6.1.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头( 1ml、 10ml)、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。
每次试验所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入操作间。
霉菌与酵母菌计数方法
1试验菌液的制备和使用(以白色念珠菌为示例)
白色念珠菌(0)代
↓
传代培养
↓
实验菌液的制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养
基,培养温度20~25℃,培养时间2~3天
↓
计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度30~35℃,
培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu
↓
计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(MPN法不适用),培养温
度30~35℃,培养时间不超过5天,接种量不大于100cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基
1.1菌种
试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
1.2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株)
取白色念珠菌的新鲜培养物
↓
用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑
曲霉的新鲜培养物
↓
加入3~5ml含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化
钠溶液,将孢子洗脱
↓
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内
↓
用含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯
化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液
菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在2~8℃,可在24小时内使用。
稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃,在验证过的贮存期内使用。
1.3阴性对照
为确认试验条件是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。
如阴
性对照有菌生长,应进行偏差调查。
2.培养基适用性检查
按表1规定,接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板
↓
置表1规定条件下培养
↓
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿
↓
同时,用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验
↓
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较,试
验菌应生长良好
3计数方法适用性试验
供试液制备:水不溶性非油脂类供试品
↓
取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,或pH7.2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨
液体培养基
↓
制备成1:10供试液。
↓
若需要,调节供试液pH值至6~8。
必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀
释。
⒉接种和稀释
所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
为确认供试品中的微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
4抗菌活性的去除或灭活
供试液接种后,按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。
若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌数值的50%,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。
⑴加稀释液或培养基体积。
⑵入适宜的中和剂或灭活剂
⑶采用薄膜过滤法。
5供试品中微生物的回收
表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。
微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。
(预方法是平皿法)平皿法包括倾注法和涂布法。
表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿,以算术均值作为计数结果。
(1)倾注法
取照上述“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或灭
活”制备的供试液1ml
↓
置直径90mm的无菌平皿中
↓
注入15~20ml温度不超过
45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基
↓
混匀,凝固,倒置培养。
(若使用直径较大的平皿,培养基的用量应相应增加)
↓
按表1规定条件培养、计数
↓
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组的平均菌落数。
(2)涂布法
取15~20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂
培养基↓
注入直径90mm的无菌平皿,凝固,制成平板
↓
采用适宜的方法使培养基表面干燥(若使用直径较大的平皿,培养基用量也应相
应增加)↓
每一平板表面接种上述照“供试液的制备”、“接种和稀释”和“抑菌活性的去除或
灭活”制备的供试液不少于0.1ml
↓
按表1规定条件培养、计数
↓
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组的平均菌落数
6.结果判断
计数方法适用性试验中,采用平皿法或薄膜过滤法时,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内验均符合要求,照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
7.供试品检查
(1)除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;
(2)胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数;沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。
(3)培养和计数除另有规定外,胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30~35℃培养3~5天,沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20~25℃培养5~7天,。
(4)菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级。