老年性痴呆动物模型

老年性痴呆（AD）动物模型的制作一、简介二、前言1. AD的病理和症状2. AD的分子标志和危险因子三、AD动物模型的分类1. 前脑胆碱能系统损害模型2. 自然衰老认知障碍模型3. 转基因动物模型4. 其它损害造成的AD模型四、AD动物模型的制作1. 穹窿-海马伞切断模型2. IBO损害模型3. 免疫毒素选择性损害模型4. 老年认知障碍鼠模型5. 长期脑供血不足痴呆模型6. Okadaic酸损害模型7. App转基因动物模型五、AD动物模型的应用六、参考文献一、简介本节介绍Alzheimer’s型老年痴呆（AD）的动物模型的制作，首先介绍AD的病理特征和模型的制作原理，然后着重介绍三类AD模型的制作方法。

前脑胆碱能系统损害模型是用机械的、化学的或免疫的方式损害前脑胆碱能系统，造成动物前脑胆碱能系统病变和相关的认知缺失；自然衰老认知障碍模型是用行为筛选的方式，将老年灵长类或鼠类认知能力下降较严重的个体选择出来，它们通常表现出较为严重的脑老化的病理特征；转基因动物模型是用实验方法将外源性App 基因（野生或突变型）导入，使动物过多地表达App基因或突变产物，引起中枢神经系统的Aβ的沉积和相关病理损害或临床症状。

二、前言老年性痴呆是导致老年人生活质量低下和死亡的主要疾病，其中以Alzheimer’s型老年性痴呆（Alzheimer’s disease, AD）最为常见。

AD是一种中枢神经系统退变性疾病，65岁以上人口发病率约5～10%，其主要症状为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般8～10年。

随着人口老年化趋势的加重，AD困扰着许多老年人，带来了严重的社会、经济和家庭问题。

因此，积极研究AD的发病机制和寻找有效的治疗方法是临床和基础医学面临的急迫课题。

但由于AD的病理学机制尚不清楚，要研究其发病机制和试验新的治疗方法，一个重要的突破口是制作AD的动物模型，即在动物上模拟AD的病理改变和临床症状。

制作AD动物模型的前提是对AD的病理和行为变化的充分认识。

(一) AD的病理改变AD的主要病理学改变是患者脑组织出现大量神经纤维缠结（Neurofibrillary Tangles，NFT）、老年斑（Senile plaque），突触和神经元丢失。

NFT是出现在易感神经元胞体和突起内的丝状物，可以通过镀银染色或免疫组化的方法将其显示。

电子显微镜下NFT是由配对缠绕的螺旋丝或15nm的直丝所组成。

老年斑是神经细胞外的斑块状沉积，它同样可以通过镀银或免疫组化方法显示。

NFT和老年斑在正常老年人脑组织也可出现，但在AD患者脑内其数量显著增多。

它们主要沉积在额、颞叶皮质、海马、杏仁等脑区。

累及上述脑的易感神经元，使其功能丧失或死亡。

例如基底前脑胆碱能神经元、新皮质和海马的投射神经元丢失，导致靶的突触输入的减少和失支配，这些病理改变构成了AD认知障碍和记忆减退的神经基础[1-4]。

(二) AD的分子标志和危险因子近年来，随着分子生物学技术的渗入，对AD发病的分子机制的认识有了长足的进步，其中最突出的成就是发现了AD有关的二大分子标志物：Tau蛋白和β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。

Tau是组成细胞骨架的微管相关蛋白（Microtubule associating protein）之一，由于某种原因引起Tau的异常磷酸化，使其从微管上解离，从面导致细胞骨架解聚，干扰了神经细胞功能，进而使受累神经元死亡。

而过磷酸化的Tau本身相互缠绕形成了NFT[5]；Aβ是一个由39～43个氨基酸组成的多肽，它来自于含695～770个氨基酸的前体蛋白（Amyloid procursor-like protein，App）。

业已发现，Aβ沉积和老年斑形成有着密切的关系，Aβ是老年斑的主要成份之一。

用A β的抗体免疫组化方法可显示老年斑。

App基因定位于第21号染色体，在一些早发的家族性AD 的患者其App基因突变已被证实[6-8]。

除上述两种分子物质与AD发病有着密切联系外，与AD发病有关的其它危险因子，主要有年龄、遗传和载脂蛋白E4（Apolipoprotein E4，ApoE4）。

年龄因素是指AD的发病年龄通常在60岁以上，且随着年龄的增大发病率增加；遗传因素是指约20～30%的AD患者有家族遗传性，其中的一部份已发现了基因的改变。

ApoE4是存在于血浆和脑脊液的脂蛋白成份之一，由人类19号染色体长臂上ApoE4基因位点上多个等位基因（ε4、ε3、ε2）所编码。

最近的研究发现AD 患者ε4等位基因频率比对照组显著增高，且AD的病变程度与ε4的等位基因频数有关。

这些资料表明ApoE等位基因的多形性与AD的发病有着密切的联系[9]。

三、AD动物模型的分类和制作原理AD动物模型是在实验动物身上模拟AD患者脑组织的病理变化和行为异常，这是研究AD 发病机制的重要手段，也可为试验和判断治疗AD的药物和疗法提供试验对象。

尽管完全理想的AD动物模型目前尚不存在，但随着神经生物学和分子生物学的进步，许多种AD动物模型相继被制作，并在研究中得到广泛的应用，这些模型为理解AD的病理机制和试验新的药物发挥了重要作用。

现有的AD动物模型是根据不同实验目的所设计的，大多是只能模拟AD的某些病变或症状，根据其制作方法和作用机制，AD动物模型可分为如下几种（表1）：（一）前脑胆碱能系统损害模型该模型是建立在“AD认知障碍的胆碱能假说“的基础上，已知基底前脑的胆碱能细胞发出轴突广泛地投射到新皮质和海马等高级脑区，这一投射与学习记忆和认知功能有着密切的联系。

在任何一个环节阻断或损坏这一投射系统都可导致动物认知障碍和学习记忆能力的损害（图1）。

病理检查发现AD患者基底前脑的胆碱能细胞出现严重溃变，其细胞丢失的程度和患者的认知能力成负相关关系[10]。

因此，这一类AD模型主要着眼于模拟AD的认知缺失和前脑胆碱能系统损害。

根据损害方式的不同，这一类模型又可分为穹窿-海马伞损伤模型、Ibotenic酸损害基底前脑细胞模型以及基底前脑胆碱能细胞免疫切除模型（表1）。

图 1图1 基底前脑胆碱能投射损害示意图A. 切断穹窿的切点；B. 损毁内侧隔核；MS. 内侧隔核；HP. 海马；CC. 胼胝体；FF. 穹窿海马伞（二）自然衰老认知障碍AD动物模型AD是一个年龄相关的疾病，衰老因素在AD发病过程中扮演着重要角色，衰老所特有的病理生理变化及其它病变的影响，是用年轻动物制作的动物模型所不能替代的。

近年来比较流行的模型之一是用老年的灵长类（弥猴、恒猴、罗猴）或鼠类，通过行为筛选的方式，选择带有认知和记忆严重缺失的个体，它们的行为损害与老年人和AD患者的认知损害相类似，同时还可出现某些相应的脑组织病理改变[11]。

（三）转基因动物模型转基因AD动物模型是建立在App基因突变导致Aβ沉积是AD病理改变的中心环节的学说的基础上。

用实验的方法将外源性App基因（野生或突变型）导入，使其在染色体基因组中稳定整合、表达，并遗传给后代。

动物过多地表达App基因或其突变基因产物，引起Aβ的沉积和相关的病理损害或临床症状。

转基因的方法能够直接试验是否野生型或突变型的App，或者Aβ包含片段的过度表达是AD的病因，近年来这一领域的研究非常活跃[11]。

（四）其它损害造成的AD动物模型其它AD动物模型尚有老年动物慢性脑缺血痴呆模型、Okadaic acid（OA）损害模型、铝中毒模型和β-半乳糖损害模型。

慢性缺血痴呆模型是通过结扎老年大鼠的双侧颈总动脉和一侧椎动脉或者一侧锁骨下动脉，造成老年脑的长期供血不足和相应的脑损害，这些脑损害与AD的临床表现和病理改变有一定相似性[12]；OA损害模型是利用OA对丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸化酶（1A 和2A）的特异性抑制作用，以及它对蛋白激酶C（PKC）的激活作用。

1A和2A抑制可以使Tau 蛋白过磷酸化，导致NFT的形成。

同时，PKC激活，1A和2A的活性抑制，可剌激Aβ产生，进而引起Aβ的沉积和老年斑的形成[13]。

表1 老年性痴呆动物模型的分类和制作原理──────────────────────────────────────类型方式原理──────────────────────────────────────前脑胆碱能系统损害模型穹窿－海马伞切断模型机械离断损伤隔-海马胆碱能投射IBO损害模型IBO脑内注射损毁基底前脑神经元胞体免疫毒素损害型脑室投递选择性损毁基底前脑的胆碱能细胞自然衰老认知障碍模型迷宫筛选从衰老鼠中筛选出有学习记忆损害的个体慢性脑缺血痴呆模型结扎脑供血动物脑长期供血不足，造成认知缺失和病理损害OA损害模型脑室投递OA 抑制蛋白磷酸化酶1A和2A剌激PKC的活性转基因动物模型App基因转染App／Aβ蛋白过渡表达───────────────────────────────────────四、AD动物模型的制作方法（－）。

穹窿海马伞损害模型[14,15]1．实验动物：用雄性大白鼠（SD或Wistar鼠种），3～5个月龄，体重250～300克。

2. 材料和试剂：脑立体定位仪，特制刀片，注射器，开颅钻。

3. 操作程序：动物经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，固定于脑立体定位仪上，颅顶区被皮常规消毒手术区皮肤，无菌下操作，沿颅顶中线作长2cm切口，用湿棉球分离骨膜。

于前囟后2.0mm，中线旁1mm处，用牙科钻或自制颅钻打开颅骨，仔细切开硬脑膜，暴露大脑皮质，用特制的宽2mm双刃刀片（剃须刀片制作）按照脑立体定位仪图谱（Paxinos G and Watson C），于前囟后2mm，中线左侧1mm处置刀于脑表面，然后操作定位仪降刀4.1mm，并向外向内各移动1mm和0.5mm。

然后再降刀1mm，外移1.5mm，此时上下抽动刀片数次，依次切断胼胝体缘、扣带回、背侧穹窿-海马伞（图1，右侧）。

留刀三分钟后退出刀片。

手术中要避免损伤上矢状窦，并观察有否出血现象，关闭头皮。

另一种损害方法是分离和移除一部分大脑皮质，直接暴露穹窿，直视下切断穹窿或移除一段（1mm长）穹窿。

动物存活1周至2周，灌注杀死动物，取基底前脑组织切片，用胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组化方法验证，损伤同侧内侧隔核胆碱能神经元较对照侧减少50～60%左右，斜角带垂直支约减少40%。

同时，损伤侧海马内胆碱能纤维（AchE 染色）明显减少。

迷宫测试显示该模型鼠的获取能力和记忆能力匀较对照组明显降低。

（二）鹅膏蕈氨酸（Ibotenic acid, IBO）损害模型IBO是一种谷氨酸受体激动剂，具有强烈的神经兴奋毒性作用，通过与神经元胞体或树突上的NMDA受体相结合导致神经元中毒性损伤而溃变。