细胞遗传学实验
实验一植物染色体去壁、低渗、火焰干燥制片技术
一、实验原理：
用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性，可以减少染色体的变形、断裂等现象，也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。
使染色体各组成部分—长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚，有利于染色体测量和显带的分析。
此法也很简单，首先用酶解法去除植物细胞壁，再利用热胀冷缩的原理，将植物细胞在冰片上用火焰烧烤，用力甩片能使细胞膜破裂，不需要特殊设备，同时也省去了繁杂的压片手续，显著提高了制片的效率。
二、实验目的：
学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术，为染色体显带实验提供了优良的标本。
三、实验步骤：
1材料的制备：
黑麦根尖(2n=14)
根尖材料的制备：
1. 发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(23~32℃)；培养24h 再放入0~4℃冰处理1~7天。
目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；(2)调节工作时间。
再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天；待根尖长度为1.5~2cm即可处理。
2 预处理：化学和物理两种
(1) 化学方法：(适合所有生物)
a. 秋水仙素0.05~0.2﹪(白色粉末，易溶于水的巨毒药品)；
b. 0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，对禾本科植物的随体
很清楚)；
C.а-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水，100ml水中倒入1~2
滴剧烈的振动5分钟)；
（以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5h）
d. 对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀性，只能处理1~1.5h)。
(2) 物理方法：(适合禾本科作物，本次实验所采用)
冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。
预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。
3 固定：
卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸);
固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。
4 保存：
冲洗置换，从95﹪~70﹪的乙醇梯度置换；每次置换需停留20~30min,目的是将固定液中的醋酸从材料中置换掉，最后将材料保存在70﹪的乙醇中备用。
5 解离：将根放在0.2MHCI中，在25℃下浸泡1h。
作用：以软化细胞壁，去除细胞壁之间的果胶质。
解离的目的使胞间层的果胶类物质解体，利于细胞分散，有助于压片；同时解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。
6前低渗：用自来水冲洗材料，再用25℃的蒸馏水浸泡0.5h。
作用：可置换出细胞内的HCI，使细胞充分吸水。
染色体在细胞内处于游离状态，在制片时便于染色体分散。
7 酶解去壁：倒掉蒸馏水，加入2％的纤维素酶与2％果胶酶的混合液，在35-37℃下处理2h。
作用：对细胞壁所含的纤维素、半纤维素和果胶质进行消化。
8 后低渗：用镊子夹住根部抖落分生区，将其它部分丢弃，收集分生区组织，转入指形管，沉淀10min后吸出酶液，加蒸馏水浸泡0.5h。
作用：可置换出酶液。
使细胞充分吸水膨胀，染色体游离在细胞质中，制片时便于染色体分散，是关键步骤。
9 固定：吸去蒸馏水，加3︰1的甲醇固定液，静置15min。
作用：置换出细胞内的水分，便于燃烧。
(甲醇固定液作用有：①具有一定的脆性，甩片时容易使细胞膜破裂。
②能改善染色，有助于以后实验时的吉姆萨染色)。
10 制备悬浮液：吸去上清液，以1︰10的比例加入新鲜的固定液(即一份细胞，10份固定液)，用吸管不停的吸放以捣碎组织，制成均匀的细胞悬液。
11 标本片制备：将冷冻的载玻片斜放30-45°角，点上酒精灯，吸2-3滴细胞悬液在该片上，加热烧烤，此时用力甩片，制作10张标本片。
实验二植物染色体Giemsa—C带技术
一、实验原理：
染色体显带技术是借助于特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。
染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。
从而在以往染色体形态特征（长度、着丝粒位置、臂比、随体等）以外又增添了一类新的标志。
染色体分带技术能有效地鉴别染色体，研究染色体的结构与功能。
C一带是植物吉姆萨分带的一种类型，是染色体经过C 一带程序处理，使染色体着丝粒两侧出现带纹，故名C一带。
二、实验目的：
掌握植物染色体吉姆萨分带技术和方法。
三、实验步骤：
1、制片：选取前两次实验(压片法、去壁低渗法)制备的片子各10张。
2、干燥：两种方法⑴自然干燥松树、洋葱15天，(不超过3过月)；禾本科作物2—15天。
⑵无水乙醇干燥只需要1—12小时即可。
(目的：①染色体具有后熟的作用；②去除染色体上的蛋白质；③使材料凝固在片子上)。
本实验采用自然干燥方法。
3、酸处理：两种方法⑴用45%醋酸在室温下处理1—1.5 h；⑵用0.2MHCl，在25℃下处理1—1.5 h；（处理完毕用，用30℃的蒸馏水过一次）作用：①去除制片上的杂质和染色体上的蛋白质；②破坏细胞质；③使第一次染色褪色。
④与染色体上的DNA或某些碱基结合，使染色体上不同程度碱基脱落，有助于程度不同的显带。
应选用⑵种方法。
(酸处理是变性的过程。
应注意控制时间，如果处理恰倒好处感觉染色体饱满，带纹丰富；如果处理不够，染色体上的色差不明显，观察不到带纹；如果处理过度，染色体很薄，带纹也不丰富)。
4、碱处理：两种方法⑴强碱NaOH、KOH；室温处理，不得超过20秒；(大约15秒) ⑵弱碱 Ba(OH)
2
饱和溶液，在25℃下处理15min。
碱处理也是使染色体变性的过程，作用是与
染色体上的DNA碱基结合，消化DNA。
处理完毕不能直接倒去碱液，以防止Ba(OH)
2
与空气
中CO
2
结合生成的碳酸钡薄膜覆盖在制片材料的表面，影响后续工作的正常进行，所以必须用流动的自来水冲洗，以去除表面的薄膜以及水中的沉淀物,冲洗完毕用30℃蒸馏水漂洗浸泡几分钟，置换出碱液。
5、盐处理：用2×SSC盐溶液(0.3MNaCl+0.03MNaC
6H
5
O
7
2H
2
O)，在60℃下处理1.5h。
盐处
理是使染色体复性的过程，作用(1)调节PH值；(2)修饰DNA上的碱性基团和酸性基团。
1.5h后倒去盐溶液，加入30℃蒸馏水浸泡5分钟，置换出盐溶液。
6、染色：取吉姆萨母液(1％浓度)10-15ml,用磷酸缓冲液(PH6.8-7.2)稀释至1000ml（比
较新鲜的母液15ml,氧化1年以上的母液10ml）。
在25℃下染色120min，然后在显微镜下观察。
四、实验结果
载玻片观察结果有染为淡紫色细胞和蓝色杂质，但未见染色体C带，分析原因：
1.酶解时对温度和时间的把控出现问题；
2.制片时，细胞未破碎，没有甩出染色体；
3.处理玻片时，将材料冲出玻片；
4.当天室温太低影响了氢氧化钡的溶解，溶解不充分；
如下图所示，黑色圆圈内即为一条染色体在着丝粒处的C带。
