下载文档原格式
人类染色体Ｇ带标本制备及观察一、实验目的和要求初步掌握人类染色体标本培养制备的基本方法初步掌握人类染色体G显带标本制备的方法及各号染色体G带带型二、实验内容和原理正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。
1960年，Nowell和Moorhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。
在培养过程中加入秋水仙素可以破坏纺锤体结构，使细胞有丝分裂停止在中期，以便于染色体观察。
通过低渗和固定处理，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。
人体的1ml外周血中一般含有约（1～3）×106 个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用。
本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法，以及染色体标本的制备。
G显带是指Giemsa染液染色后，使每条染色体上显示出深浅交替横纹的技术。
A-T相对丰富的区域染为深带， G-C相对丰富的区域染为浅带。
将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行预处理，胰酶可以从染色体上抽取特定的疏水蛋白，然后用Giemsa染色。
胰蛋白酶法制作简便，成本低廉，制作周期短，显示的带纹清晰，是研究分析染色体的主要常规方法之一。
三、主要仪器设备实验材料：人外周血 (淋巴细胞)实验器具：离心机、恒温培养箱、恒温水浴箱、培养瓶、离心管、注射器和针头（61/2号）、吸管、量筒、火材、洒精灯、载玻片、染缸、试管架、玻璃铅笔、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。
药品和试剂：肝素、秋水仙素、低渗液、固定液、磷酸缓冲液、Giemsa工作液、RPMI 1640培养基、小牛血清、植物血凝素（PHA）等四、操作方法与实验步骤（1）接种和培养。
①在无菌条件下，用灭菌注射器吸取0.2%肝素液（生理盐水配制，灭菌）0.2ml，湿润针筒后，采静脉血2ml，转动注射器使血液与肝素充分混匀。
染色体G显带操作规程1.目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程，以保证结果的准确、可靠。
2.应用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。
3.职责：3.1文件编写：实验室技术员。
3.2文件审核：科室负责人。
3.3文件审批：实验室主任。
3.4执行：细胞遗传室的所有工作人员。
4.内容：4.1实验原理：4.1.1．淋巴细胞的体外培养4.1.1.1．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。
当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。
4.1.1.2．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：DNA合成前期（G1期），约10～24h，为RNA和细胞质的合成；DNA合成期（S期）约为7h，在G1期的基础上，完成DNA的合成；DNA合成后期（G2期）约为4～6h，为后期RNA和细胞质的合成，活跃的RNA和微管蛋白等合成；细胞分裂期（M期）约为1.5h，又分为分裂前期、中期、后期和末期。
4.1.1.3．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基，主要由RPMI1640和牛血清混合而成。
另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH，双抗（链霉素和青霉素）用于抑制细菌的生长等。
4.1.2．纺锤体的抑止4.1.2.1．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。
因此，破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很容易铺展开来。
细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。
微管由微管蛋白组成，微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种，α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。
其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。
染色体G带制备详细流程及核型分析（一）染色体的形态结构体细胞的染色体是46个，23个，其中22对是常染色体。
一对是性染色体。
男性一对XY。
女性为XX。
染色体的形态随着细胞周期的不同而有所改变，在光学显微镜下所看到的染色体是细胞分裂中期染色体（metaphase chromsome）。
每个染色体含有两条染色单体，呈赤道状彼此分离。
只有着丝粒处相连。
根据着丝粒的位置分为三种类型，中部着丝粒型，亚中部着丝粒和端着丝粒型（图21-1）。
图21-1 正常人体细胞的三种染色体1．中部着丝点染色体；2.近中部着丝点染色体；3.近端部着丝点染色体1.非显带染色体特征分为七组A组（1～3）：为最大的具中部着丝粒染色体，这组染色体相互间很易区别。
第1号和第2号染色体大小相似，唯第2号染色体为近中部着丝粒染色体。
第3号染色体较1、2号染色体小，为中部着丝粒染色体。
B组（4～5）：为大的具中部着丝粒染色体。
2对染色体之间在形态和长度上较难区别。
C组（6～12号和X）：为中等大小的具中部或近中部着丝粒染色体。
这组染色体较难区分，其中第6、7、11号和X染色体为中部着丝粒染色体，第8、9、10和12号染色体为近中部着丝粒染色体。
女性为2个X染色体。
男性只有1个X染色体。
D组（13～15号）：为中等大小的具近端着丝粒染色体。
在其短臂上有随体。
与他组染色体有明显区别。
但3对染色体之间较难区别。
E组（16～18号）：为小的具中部或近中部着丝粒染色体。
第16号染色体为中部着丝粒染色体，第17号和18号染色体为近中部着丝粒染色体。
不过，着丝粒位置第18号较第17号染色体更近端部。
F组（19～20号）：为更小的中部着丝粒染色体。
2对染色体之间，形态上很难区别。
G组（21～22号和Y）：为最小的近端着丝粒染色体。
第21号和22号染色体大小相似，且短臂上常连有随体。
Y染色体常比第21和22号染色体大、染色深。
且无随体。
Y染色体长臂2个染色单体比较靠拢，长臂末端也较模糊。
实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤 四、讨论分析一、 实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。
初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。
通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。
在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。
在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。
但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。
在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。
再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。
最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。
胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。
通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。
由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。
关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。
二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。
3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。
骨髓染色体r显带制备实验流程
一、实验目的
通过骨髓细胞染色体G显带的制备,观察染色体形态,掌握骨髓细胞染色体G显带制备的基本方法。
二、主要仪器和试剂
1.细胞培养箱、倒置显微镜、低温高速离心机、水浴、恒温培养箱、微量吸液器等仪器设备。
2.RPMI 1640培养基、胎牛血清、秋水仙素、KCl、固定液、 Giemsa 染色液等。
三、实验步骤
1.取患者骨髓液,加入RPMI 1640培养基,接种细胞,孵育72小时。
2.加入秋水仙素进行细胞周期同步,继续培养4-5小时。
3.收集细胞,低速离心,弃上清。
加入0.075M KCl hypotonic solution,37°C水浴20分钟。
4.1000r/min离心5分钟,弃上清,加入新配制固定液,混匀。
5.4°C固定过夜。
6.将固定后的细胞涂片,自然风干。
7.苏木精-伊红染色液染色,显微镜下观察染色体形态。
四、实验结果
成功制备出骨髓细胞染色体G显带,在显微镜下可清晰观察到染色体形态。
1规范实验室的孕妇脐带血染色体核型分析检测流程，确保检测结果及报告的准确性、可靠性和有效性。
2体外培养人淋巴细胞，于细胞生长旺盛期加入秋水仙素阻止细胞于分裂中期，收获染色体，并制片显带，显微镜下分析细胞核型。
3检查的是胎儿脐带血淋巴细胞染色体，正常情况下可代表人体的染色体核型，但如存在组织的染色体特异性或嵌合体现象，则不能代表胎儿的染色体核型。
另外由于细胞培养克隆消失和染色体计数有限原因，嵌合体可能漏检。
如脐带血混有母血可导致结果是母亲的而非胎儿的。
4脐带静脉全血。
5无菌肝素抗凝管。
66.1 设备：恒温培养箱，烘箱，离心机，显微镜，遗传分析系统。
6.2 试剂：人体外周血淋巴细胞培养基，胰酶，秋水仙素，甲醇，冰醋酸， KCl 、DHANK’S 缓冲液， Giemsa 染色液。
77.1 标本接收，登记标本用无菌肝素管采集，接收标本时登记病人姓名，性别，年龄，电话号码。
7.2 脐血验证(粗筛)将离心管中加入3ml水，加入10M KOH 2-3滴，混均。
加入脐血2-3滴，如立即变褐色，则表示对碱性没有抵抗力，可能是母血；如保持鲜红色一段时间，则表示对碱性有抵抗力，可能是脐血。
7.3 接种在无菌条件下，接种(7 号针头垂直 10 滴)至外周血培养基内。
7.4 培养置37℃恒温箱中培养68-72小时，每24小时轻轻摇晃一次培养瓶，使细胞获得充分营养。
7.5 收获7.5.1 在培养完成前3-4小时，加入浓度为20ug/ml的秋水仙素2-3滴(7号针头垂直滴) 后，继续培养 3-4小时。
7.5.2 将细胞液吸入15ml离心管中，1500rpm离心10分钟，去上清，约留0.5ml。
7.5.3 低渗：加入预热至37℃的0.075M KCl 8ml，吸管用力吹打约50下， 37℃水浴30分钟。
7.5.4 预固定：加入1.5ml甲醇∶冰醋酸=3 ∶ 1的固定剂，轻混匀。
1500rpm离心10分钟，去上清，约留0.5ml。
染色体结构显示和检测1）染色体显带显Q带法1. 漂洗：取经过干热预处理或已老化的染色体标本，置于pH6.0缓冲液中浸5~10分钟。
2. 染色：浸入pH6.0的GM或QD染液中5~10分钟。
3. 漂洗：浸入新鲜pH6.0缓冲液中漂洗两次，每次5分钟。
4. 观察：向标本染色体面滴1~2滴新鲜缓冲液，覆以盖片（避免出气泡），置荧光显微镜下观察。
显G带法胰酶-Giemsa混合显带法1．预处理：取中期染色体标本，置60℃～60℃温箱中20～30分钟，或在37℃温箱过夜，然后浸入0.025M 磷酸缓冲液中，pH6.8，56℃温浴10分钟。
2．消化和染色：用现配制的胰蛋白酶-Giemsa混合液消化和染色10～30分钟，混合液按如下比例配制：0.025 M 磷酸缓冲液pH6.8 73.0 ml甲醇27.0 mlGiemsa干粉50.0 mg0.25%胰酶0.3～0.4 ml3．封片：染色后用自来水冲洗，入蒸馏水漂洗数次、晾干、二甲苯透明2~3分钟，封入中性树脂中。
Giemsa显带法1．预处理：将标本置入60~80℃温箱或烤箱中20~30分钟，亦可在37℃温箱过夜。
2．胰酶消化：用0.85%的NaCl配制0.25%胰蛋白酶溶液消化3~5分钟。
3．染色：取出标本片，先直立于吸水纸上除去多余胰酶液后，随即置入Giemsa染液中，染10分钟。
4．封片：自来水洗，蒸馏水漂洗，晾干，二甲苯透明2~3分钟，封入中性树胶中。
2）姐妹染色单体分化染色BUdR掺入和制片程序1．BUdR培养液制备：先制备好含BUdR的培养液（最终浓度为3~10微克/毫升）。
2．BUdR掺入：如用传代细胞，在末次传代后，改换用含BUdR的培养液培养。
如为人末梢血细胞，一开始就用含BUdR培养液培养（培养瓶放在特制黑色木盒、黑布中或黑纸包裹）37℃温箱内培养。
3．中止掺入与制片：待细胞经历两个细胞周期（人周围血细胞培养48或72小时）4．加秋水仙素—制片。
实验三人类染色体G显带技术【实验目的】了解人类染色体的G显带方法。
【实验原理】人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。
本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带），G 带是目前被广泛应用的一种带型。
因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G 显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。
研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。
每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。
关于G显带的机理目前有多种说法，例如，Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。
有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。
比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。
用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。
一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC 多的染色体段则不易着色。
总的来说，G显带的机理还未搞清。
【实验材料】人外周血染色体标本（在室温下存放三天以上或60℃烤箱中烤片2小时，未经染色）。
【实验器材】烤箱、恒温水浴箱、冰箱、染色缸、温度计。
【实验试剂】0.02％EDTA溶液、0.85％生理盐水、2.5％胰蛋白酶溶液、5％Giemsa液、Giemsa稀释液。
0.5-1N NaOH溶液【实验步骤】1、将25ml生理盐水和25ml0.02％的EDTA溶液倒入立式染色缸中混匀。
染色体检查操作方法染色体检查是一种常用的诊断方法，是指利用显微镜和特定的染色技术，观察分析细胞核内染色体的数量、形态和结构，从而发现染色体异常变异、畸形和突变等情况，确定染色体异常状况，为临床医学诊断提供依据。
本文将详细介绍染色体检查的操作方法。
一、采集标本采集标本时，应选择合适的细胞分裂阶段，以保证染色体成像清晰可见。
常用的标本包括全血、皮肤、脐带血、羊水、胎盘组织和骨髓等，其中全血和皮肤标本最为常见。
1. 全血标本：取3-5mL外周全血，可采用静脉或指尖刺穿的方式获取。
2. 皮肤标本：采用手术刀或刮片取皮肤组织，将组织放置于生理盐水或培养液中，处理效果更佳。
二、染色体培养1. 细胞培养：将采集的标本处理后，进行体外培养，利用特定的培养基和条件，促使细胞分裂、繁殖。
通常使用一种叫做“杜氏培养液”的高浓度培养基，促使细胞增殖并进入分裂期。
待细胞达到特定阶段时，加入“催化剂”（如血清、植物激素或化合物等），从而触发细胞核分裂，形成染色体。
2. 处理步骤：将标本划分至两个机械培养瓶内，加入培养液和催化剂，进行培养。
培养瓶置于恒温培养箱内，维持恒定的温度、湿度和氧气浓度。
例如，在37恒温培养箱中培养48小时，使细胞周期完成，享有完整的染色体。
三、细胞收集1. 收集原液：将培养瓶内细胞取出，滴加药物使细胞吸附在活动载物上。
药物通常选择一种叫做“染色体分离剂”的解离剂，在20-30分钟内处理完成。
2. 处理步骤：将培养瓶中液体转移到50mL离心管中，并使用盐水或培养液冲洗瓶底，同时加入2-3mL染色体分离剂。
开启振荡器，以20-25Hz，振荡周期为10秒，持续20-30分钟，使细胞完全解离。
3. 收集细胞：倒出离心管中的液体，洗涤细胞2-3次，收集洗涤液。
此时细胞已进入离体状态，可以观察染色体的数量、结构和形态。
四、染色1. 常用染色方法：分别为G显带、R显带和C显带。
G显带是目前应用最广的染色方法，可检测组合体、断臂、显珠、微缺等结构，可准确诊断包括唐氏综合症、爱德华综合征、妈妈综合症、Seckel综合症等在内的有关染色体杂乱症，极高的灵敏度和准确性使其成为染色体异常筛查的金标准。
人类染色体标本的制备与G显带核型分析报告概述核型分析是指通过对细胞的染色体观察，了解它们的数量、形态，从而判断个体的性别以及是否存在染色体异常。
本文将介绍人类染色体标本的制备方法以及采用G显带染色技术进行核型分析的过程和结果。
材料与方法标本制备：1.通过体内生长的细胞系培养得到细胞，并将它们发送至染色体形态捕获系统实验室。
2.将收到的细胞进行样品准备。
先加入均浆剂净水，并初次混合。
待与细胞量相等的5％高马尔谷酸(Na2HPO4)特性缓冲液和1％偏硫酸，最后混合。
3.轻轻转动管子，并且离开它说较长时间，使得细胞得以与溶液完全变淡。
4.通过四氯化碳进行固定，直至样品中的细胞结构都没有被损坏。
5.利用各种化学剂处理样本，以预处理出更好的结构。
G显带染色：1.将钟室内的标本压片，使细胞的核形成按制定的标准排序，并在有机玻璃片底部粘贴。
2.加入如下染料：a. Giemsa液：Giemsa指的是罗马帝国时期的波尔多区Giemsa教授。
G显带染色技术将溶液中的Giemsa染色质直到他们的总量到达6倍于DNA总量。
Giemsa染料在滴定时间内还要使染色质呈现某些将染色质透过玻片清楚可见的颜色。
b. Sorenson’s Buffer：Sørensen’s缓冲液是一种被设计为模仿人类体液的缓冲液。
在G显带染色过程中，它发挥的作用是将不同颜色的细胞内组成分离出来，使得它们不会在一幅核型图像中混杂在一起。
3. 在加入染料后将玻璃片封起来，等待颜料与核相结合。
4. 将镜头放置在显微镜底座中，并通过显微镜观察标本。
分析：我们使用的显微镜是能见度很好的显微镜，能够让细胞结构非常清晰可见。
我们可以在屏幕上观察到标本图像。
我们首先计算出图像中每个单独的染色体的数目以及它们的大小和形状。
在一张图像上，我们可以很容易地区分每个单独的染色体，并根据它们的大小、形状和位置来确定它们在细胞核中的位置。
结果我们的细胞核型分析结果显示，这个体细胞核内的染色体数目为46个。
显带染色体检验非显带染色体制备技术不能将每一条染色体的特征完全显示出来，只能根据各染色体的大致特征（大小、着丝粒位置）来识别。
对于染色体结构畸变的诊断和研究受到很大限制。
染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。
自20世纪60年代末以来各种染色技术的应用，染色体显带技术得到了很大的发展。
可以将染色体的个体特征显现出来，据此可准确识别23对不同类型的染色体，从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床染色体疾病的诊断提供了更有效的手段。
染色体经过一定程序处理并用特定染料染色后，在普通光学显微镜或荧光显微镜下可显现出不同深浅颜色的带纹或不同强度的荧光节段叫做染色体带，各号染色体带的形态不同，称带型。
染色体显带的分类通常是按能产生某种带型的方法来划分的。
如用C、G、Q或T 显带技术产生的带分别称为C带、G带、Q带或T带。
按此显带技术可分成两大类：一类是产生的带分布在整条染色体上，如Q、G和R 带；另一类只能使染色体上少数特定的带或结构着色，如C带、T带和N带等。
1971年巴黎会议确定的四种显带技术是：胰酶Giemsa法（G显带）、氮芥喹吖因荧光法（Q显带）、逆向Giemsa法（R显带）和着丝粒区异染色质法（C显带），其中G显带是目前通常采用的显带技术之一，Q显带、R显带和C显带等技术也被用于染色体研究。
四种常用显带技术各具优缺点，有不同的应用。
（一）染色体G显带检验技术G显带是一种广泛应用的技术。
它是用胰蛋白酶处理染色体标本，使染色体蛋白质变性，然后用Giemsa染色，染色体吸收染料，各条染色体上显出深色和浅色相间的带型——G带。
G带在普通光学显微镜下即可观察分析。
G显带法包括四种处理技术，即醋酸-钠盐-Giemsa法、碱处理和磷酸缓冲液温育方法以及胰蛋白酶处理Giemsa染色法等，目前多采用胰蛋白酶处理Giemsa染色法。
外周血染色体G显带技术：染色体在形态结构或数量上的异常被称为染色体异常，由染色体异常引起的疾病为染色体病。
现已发现的染色体病有100余种，染色体病在临床上常可造成流产、先天愚型、先天性多发性畸形、以及癌肿等。
临床上染色体检查的目的就是为了发现染色体异常和诊断由染色体异常引起的疾病。
羊水染色体核型分析：主要用于胎儿宫内诊断是否有先天愚型。
21三体快速诊断：主要用于唐氏综合症的快速诊断
耳聋基因分析：目的就是减少耳聋缺陷，提高人口素质。
做好孕前，孕期，新生儿的耳聋基因检测能够明确耳聋的病因，减缓和避免迟发性耳聋的发生。
达到优生优育的目的。
维生素D定量：主要用于诊断缺钙的病因
TORCH（优生四项）化学发光定量法：弓形虫，巨细胞病毒，风疹病毒和单纯疱疹病毒感染后是造成流产，死胎，死产，新生儿先天畸形和多脏器损伤的主要病原体，因此孕期检测，早起干预治疗，具有特别重要的意义。
医院细胞遗传室G-11式显带法作业指导书1目的用于9号染色体次缢痕多态分析、家系调查，亲子鉴定等研究以及9号染色体倒位的细胞遗传学分析。
2实验方法手工显带法3实验原理G11式显带是一种特异性显示9号染色体次缢痕的显带方法，一般用于9号染色体次缢痕多态分析、家系调查，亲子鉴定等研究以及9号染色体倒位的细胞遗传学分析。
4 性能特征显带处理后可见特异性的9号次缢痕。
5 仪器与耗材光学显微镜、恒温水浴箱、染色缸、吸管、计时器、PH 试纸或PH计。
6 试剂蒸馏水、0.1M氢氧化钠、Giemsa染液。
7 操作程序7.1 制片常规外周血法制备的标本。
7.2 G11显带7.2.1 3ml Giemsa原液中加入蒸馏水47ml，混匀，用氢氧化钠调PH至11。
7.2.2 将染色体玻片放入其中染色5分钟左右。
7.2.3 自来水冲洗，干燥。
7.3镜检观察可见9号染色体次缢痕成紫红色。
9参考范围9号长臂次缢痕显紫色。
10注意事项10.1染色体玻片片龄一般不要超过一周，且在显带之前最好再次75℃烤片5分钟。
10.2 pH值为11是显带成功的关键10.3染色时间可先摸索，如整个背景为蓝色、次缢痕未出现，可相应地延长染色时间；如整个背景为紫红色、次缢痕不明显则可相应地缩短染色时间。
11环境和安全控制11.1试剂中含有防腐剂和稳定剂,请勿直接接触皮肤、眼睛、黏膜，一旦接触，立即用大量清水冲洗。
11.2受检标本均应假定含有传染性病原菌，其废弃过程应遵循实验室《生物安全管理程序》进行处理。
11.3实验过程中应严格控制环境及实验仪器/设备的温度、湿度等相关条件，以确保实验条件稳定。
染色体G显带操作规程1.目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程，以保证结果的准确、可靠。
2.应用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。
3.职责：3.1文件编写：实验室技术员。
3.2文件审核：科室负责人。
3.3文件审批：实验室主任。
3.4执行：细胞遗传室的所有工作人员。
4.内容：4.1实验原理：4.1.1．淋巴细胞的体外培养4.1.1.1．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。
当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。
4.1.1.2．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：DNA合成前期（G1期），约10～24h，为RNA和细胞质的合成；DNA合成期（S期）约为7h，在G1期的基础上，完成DNA的合成；DNA合成后期（G2期）约为4～6h，为后期RNA和细胞质的合成，活跃的RNA和微管蛋白等合成；细胞分裂期（M期）约为1.5h，又分为分裂前期、中期、后期和末期。
4.1.1.3．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基，主要由RPMI1640和牛血清混合而成。
另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH，双抗（链霉素和青霉素）用于抑制细菌的生长等。
4.1.2．纺锤体的抑止4.1.2.1．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。
因此，破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很容易铺展开来。
细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。
微管由微管蛋白组成，微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种，α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。
其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。
故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。
但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂，因此它可使分裂的细胞停留在中期，获得大量分裂相，以供分析之用。
4.1.2.2．秋水仙素（colchicum）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中取出来，故名。
分子式C22H25O6N，纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。
味苦，有毒。
秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。
这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。
在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而染色体加倍。
秋水仙素是一种三环结构化合物，第2和第3个环均是7元环。
它是甲基醚的类似物，包含4个甲氧基，1个乙酰化的初级氨基以及3个非苯型双键。
秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基，这是作用活性不可缺少的反应基团；第二个环内的氨基被酯化，从而可增加其活性；第三个环的水合基团被甲基取代。
正因为如此，秋水仙素不仅易溶于水，而且即便所用的浓度极低，其反应活性仍很高。
4.1.3．低渗4.1.3.1．细胞经过秋水仙素处理后，尽管染色体已经比较适合观察了，但仍还不能满足要求，因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约为7～8微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上，这些均有赖于低渗处理。
覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散，低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开，清楚地显示每一个扭曲的染色体，而且还可以使细胞膨胀，染色体铺展。
4.1.3.2．低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。
可以是水，低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol／L）、氯化钾（0.075mol／L）、稀释的平衡盐溶液或培养基。
处理的时间一般为20～40min，处理时的温度为23～37℃。
早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液，也有些学者使用稀释的人血清。
自从1965年后，人们改用0.075mol／L的KCl作为低渗液，它可以使染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染色时间缩短。
在相差显微镜下观察，KCl低渗处理标本的效果比其他低渗液更好，也适用于显微分光光度分析，当用显带染色时充分显示带型的特点。
4.1.4．固定4.1.4.1．固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程，其目的是在杀死细胞的同时避免所研究成分受到破坏。
就细胞遗传学研究而言，固定的目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节，例如显示常染色质区和异染色质区，初级缢痕和次级缢痕等。
4.1.4.1.1．经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液（金属固定液或非金属固定液）予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉，否则，沉积在细胞表面的秋水仙素会影响染色体的形态，还会阻碍固定液穿透性。
为此，在低渗处理后，应尽早加入固定液进行预固定。
固定剂可迅速地穿透细胞，并将细胞瞬间杀死，使正在分裂的细胞立即阻留在各自特定的细胞周期时相上，否则原有的M期细胞的核分裂会继续下去，染色体松解为染色质，导致研究无法进行。
另外，预固定可使细胞都处于相同的固定微环境中，这样固定收获的细胞不会凝结在一起。
4.1.4.1.2．为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性，就需要是染色质物质沉淀。
在活体条件下，细胞内不同成分的折射系数之间相差较小，在显微镜下不能分辨出明显的染色体结构；随着核蛋白的凝结和沉淀，染色体的折射系数将会发生很大的变化，从而使它们在细胞内成为明显的小体。
因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性，都能使染色质沉淀。
常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物，其中至少有一种化学物必须具备这一特性。
4.1.4.1.3．随着细胞的死亡而出现的另一些变化（特别是蛋白质的自溶作用），往往会破坏染色体的原来结构。
在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。
因为多肽是染色体的主要成分之一，所以，这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。
因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。
此外，在细胞致死的同时，细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。
因此一种好的固定剂当既能起到防腐作用，又能阻止这种分解作用。
4.1.4.1.4．理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。
显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。
尽管如此，哪怕是最佳的固定剂，仍难免有不足之处。
首先细胞被杀死后发生的一些变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分，最后，即便是操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变。
此外，有一些化学物还会导致细胞的皱缩。
4.1.4.2．用作固定剂的化合物又可分为非金属的和金属的两大类。
前者如乙醇、甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等；后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀和醋酸镧等。
其中有几种化合物还可作为蒸汽固定剂（Vapour fixative），也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质，这样就可以在原位制作标本。
另外，按照正在细胞内沉淀蛋白质的特性不同，又可把固定剂分成沉淀性和非沉淀性两种。
沉淀性固定剂如铬酸、氯化汞和乙醇等，非沉淀性固定剂如四氧化锇、重铬酸钾等。
4.1.4.2.1．醋酸是一种理想的染色体的固定剂，它能使核酸沉淀，使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。
在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于破坏。
经醋酸固定的物质还能抵消乙醇的硬化作用。
它可使染色体结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。
这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀，因此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇或类似的化合物一道使用，后者能使组织收缩和硬化。
醋酸作为固定液中的一种成分具有以下优点：①可以与迄今所用的任何一种固定剂同时使用；②浓度可以很低或很高；③具有很强的穿透性能。
此外，醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。
因此它是染料和固定液混合物中必需的一种成分，例如醋酸-洋红、醋酸-奥辛和醋酸-间苯二酚蓝等4.1.4.2.2．甲醇是焦木酸的一种成分，从木材分解蒸馏制得，广泛地用于动物染色体的固定。
它可以使蛋白质沉淀，还具有脱水性，可使蛋白质出现不可逆转的变性，使组织硬化，但其不能有效地固定染色体，易被氧化剂氧化成甲酸，故不能与氧化剂共存。
甲酸是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。
4.1.4.2.3．乙醇的有效浓度与甲醇一样。
它和甲醇一样可以使蛋白质沉淀，还具有脱水性。
可使蛋白质出现不可逆转的变性，使组织硬化。
但是在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙醛，并进而变成醋酸。
它最重要的优点是能够迅速地穿透人组织。
因此，乙醇也被广泛地用作染色体固定剂的一种成分。
乙醇不能与许多金属固定剂（铬酸或四氧化锇）相混用，否则会被氧化。
此外乙醇不能有效地固定染色质，原则上也不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。
但是如果要对染色体的酶进行研究时，可以用80%冷乙醇固定1h 或更多时间；如用于单层培养物，往往以纯乙醇或95%的乙醇固定1～15min，因为酶的反应基团一般是不受乙醇破坏的。
4.1.4.2.4．1886年Carnoy首先用醋酸、乙醇混合作为固定剂，故名为卡诺固定液。
其特点是穿透快，且很利于染色体结构的研究。
目前常用的卡诺固定液是由1份冰醋酸和3份甲醇混合而成的。
所有的动植物和人类染色体的固定都可以用卡诺固定液，固定时间为15min至24h，温度为室温或稍冷。
随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展，因此必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成1:2或1:4等，但是如果过度膨胀则会导致细胞破碎，反而不利于分析。
卡诺固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分，因此经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色，除非使用一些特殊的媒染剂如铬酸。
4.1.5．制片4.1.5.1．固定完成后就进入制片阶段。
早期多采用涂片法、挤压法，后来很快被气干法取代，现今气干法在哺乳类和人类细胞遗传学中广泛应用。
4.1.5.2．涂片法（smear）：细胞是在固定之前就铺展到载玻片上的，而且无需什么处理便可使细胞分散开，整个操作迅速，很适于精细观察。
4.1.5.3．挤压法（squashing）：需要在固定或染色之后给以特殊的处理，然后放上盖玻片加压，如此方能从结实的细胞团块得到散开的细胞。
