烤片对染色体G显带标本质量的影响分析

人体外周血染色体G显带制备的影响因素【摘要】染色体G显带技术是研究染色体数目和结构畸变的基础，整个制片过程繁琐，接种、收获、制片、显带等因素都可影响染色体标本的最终效果。

【Abstract】Chromosome G banding technique is the study of chromosome number and structural abnormalities of the base, The entire production procedure,includinginoculation, harvesting, production, banding and other factors can affect the chromosome specimen of the final results.【Key words】Chromosome G banding；Factors；Remedial measures1染色体G显带玻片的制作1.1取血与接种时间一次性真空采血肝素抗凝管(3 ml规格)，常规消毒肘部皮肤及抗凝管的进针处，抽取静脉血2～3 ml，轻轻摇匀，防止凝固，待接种培养。

当天不能培养的标本应及时置于4℃冰箱存放以免影响细胞的活力，一般在采血后1～3 d内可进行培养。

在4℃冰箱保存6 d的标本我们也曾培养，且染色体质量也不错。

由于存放时间长，有活性的淋巴细胞少，此时应1000 r/min离心10 min后取白细胞层接种。

1.2细胞培养基与接种全血量人体血液中的淋巴细胞是一种分化细胞,它的细胞质很少,RNA 和蛋白质的6合成速度也很慢，淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。

当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutininPHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂，进入淋巴细胞生长周期。

细胞经过68～76 h的培养，处于分裂期的细胞可达20%以上(我们曾做过此类的实验)，此时加入秋水仙素便可获得大量的中期分裂相细胞。

实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤 四、讨论分析一、 实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。

初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。

通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。

在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。

在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。

但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。

在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。

再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。

最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。

本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。

胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。

通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。

由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。

关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。

二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。

3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。

人体外周血染色体G显带制备的影响因素作者：邱惠国林晖侯喜琴赵军宋秀宇来源：《中国实用医药》2011年第27期【摘要】染色体G显带技术是研究染色体数目和结构畸变的基础，整个制片过程繁琐，接种、收获、制片、显带等因素都可影响染色体标本的最终效果。

【关键词】染色体G显带；影响因素；补救措施uo, LIN Hui, ，et al. The First Affiliated Hospital of Xiamen University,xiamen 361003,China【Abstract】structural abnormalities of the base, The entire production procedure,includinginoculation, harvesting, production, banding and other factors can affect the chromosome specimen of the final results.【Key words】； Factors； Remedial measures作者单位：361003厦门大学附属第一医院检验科通讯作者：邱惠国：qhg20042007@染色体G显带是研究细胞遗传学的基础，被广泛地用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的确诊。

整个制片过程繁琐，经历时间较长，任何一个步骤操作不当，均可影响染色体标本制备的最终效果。

经过3500多份标本的制备，我们总结了一些经验。

1染色体G显带玻片的制作1.1取血与接种时间一次性真空采血肝素抗凝管(3 ml规格)，常规消毒肘部皮肤及抗凝管的进针处，抽取静脉血2～3 ml，轻轻摇匀，防止凝固，待接种培养。

当天不能培养的标本应及时置于4℃冰箱存放以免影响细胞的活力，一般在采血后1～3 d内可进行培养。

在4℃冰箱保存6 d的标本我们也曾培养，且染色体质量也不错。

由于存放时间长，有活性的淋巴细胞少，此时应1000 r/min离心10 min后取白细胞层接种。

RDW 均增大,属不均一性大细胞贫血,红细胞巨幼样变。

红细胞指标M CV 、M CH 、H CHC 的测定是进行形态学分类的依据,过去把贫血分为大细胞、正细胞正色素、小细胞低色素、单纯小细胞4个类型,此法忽视了红细胞体积的异质性对指标准确性的影响,不能全面反映红细胞的病理变化。

笔者认为,M CV 及R DW 测定结合了红细胞形态学分类,可得到较可靠的初步诊断意见,进而做特殊检查可明确诊断。

M CV 、RDW 对缺铁性贫血与巨幼红细胞性贫血有较好的诊断价值,可作为一种快速、简单、方便、准确的筛选方法。

参考文献[1]丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:中国科学技术出版社,1997:9.(收稿日期:2010-12-16)v通讯作者,E -mail:zh anggu oyuan9826@sin 。

#经验交流#外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会马 强,刘青松,蔡 燕,邢 艳,张国元v(川北医学院附属医院检验科,四川南充637000)摘 要:目的 总结该室外周血淋巴细胞培养及染色体制备的成功经验,供同行参考与借鉴。

方法 采用外周血淋巴细胞培养基接种外周全血,按照常规方法制作染色体标本,进行镜检。

结果 该室培养的淋巴细胞数量稳定,染色体核型质量佳。

结论 该室制作的染色体标本质量能满足临床染色体核型分析需要。

关键词:染色体; 外周血; 淋巴细胞DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2011.14.061文献标识码:B 文章编号:1673-4130(2011)14-1641-02 染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施,对优生优育工作有着重大意义[1]。

然而,染色体制备过程缺乏有效的质量控制,经验在染色体标本制备过程中占有重要的地位。

为了获得良好的制片,在笔者及同事的摸索下,本室制作的染色体标本质量稳定,基本满足临床分析需要。

笔者就这一过程中的要点与大家分享,以供同行参考。

实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤 四、讨论分析一、 实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。

初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。

通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。

在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。

在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。

但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。

在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。

再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。

最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。

本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。

胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。

通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。

由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。

关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。

二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。

3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。

染色体制备及显带常用试剂1、进口肝素管NH Sodium Heparin肝素具有抑制细菌分裂作用，肝素含量过多时可抑制淋巴细胞的转化。

2、秋水仙素浓度为20μg/ml用量：每瓶培养基用35μl秋水仙素秋水仙素具有特异性地破坏纺锤丝的形成，阻抑分裂中活动，从而使细胞分裂停滞于中期。

秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，可造成分裂相少；相反浓度过高或处理时间过长，可使染色体过于缩短或发生异常分裂现象，甚至染色体断裂。

3、低渗液0.075mol/L Kcl溶液=2.794g Kcl粉+500ml双（三）蒸水【使用前应37℃恒温水浴箱平衡】。

低渗处理可使细胞体积胀大【红细胞破裂，淋巴细胞膨胀】、染色体松散。

低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；低渗处理不够，染色体分散不佳，有细胞胞浆蓝色背景。

4、固定液甲醇：冰乙酸=3：1混合（临用现配）冰醋酸固定液具有膨胀、固定作用，它与醇类混合固定，有利于染色体松散，可获得分散好，易于分析的分裂中期染色体标本。

标本固定不充分，如固定液不新鲜或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊或残留胞浆痕迹，使背景不清。

5、胰酶（现配为佳）0.2g胰酶粉+100ml Hank液→摇匀调PH值7~7.2（常用0.1mol/LNaOH与0.1mol/LHcl调节PH）【使用前应37℃恒温平衡】胰酶消化蛋白。

胰酶的浓度、PH值、胰酶液温度和作用时间，直接影响G显带，带纹是否清晰可辨。

1】、胰酶液的温度偏高，反应速度就快，反之反应速度慢，将配好的胰酶放入水浴箱，37℃平衡15min左右，使胰酶染色缸温度保持在37±0.5℃；2】、胰酶处理时间一般在染色后，镜下观察。

如果细胞呈蓝紫色显不出带纹，说明胰酶作用时间不够；如果染色体边缘发毛或染色体之间连成一片，数不清单条染色体，染色体不规则或形成空泡状说明胰酶作用时间太长；如果细胞的色泽为桃红色，高倍镜下观察，染色体的带纹清晰可辨，说明胰酶的作用时间适当；3】、标本片龄越长，对胰酶处理的抵抗性越长；片龄太长的标本，分带后往往不会出现带纹，而是斑点状染色体，烤片温度太高，带纹不清楚，烤片时间和温度不够带纹发毛；4】、胰酶染色缸要洗干净，用蒸馏水冲2次，除去溶液中二价阳离子；5】、胰酶PH值偏高，玻片偏蓝；6、Hank液（g/L）Nacl 8.00g Kcl 0.40gCacl20.14g MgSO4-7H2O 0.20gNa2HPO4 0.06g KH2PO4 0.06gNaHCO3 0.35g 葡萄糖 1.00g酚红0.02g7、Giemsa使用液蒸馏水：麦氏缓冲液：Leihman染液=7：13：7可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。

羊水细胞培养及染色体制备的影响因素综述1.影响羊水细胞生长的因素1.1羊水细胞的采集时间孕14～24周的羊水细胞培养均有可能成功，但以孕18～22周最好[5]，此时羊水中所含成纤维细胞和上皮样细胞多，羊水增长速度较快，细胞易于培养，且对胎儿的损伤最小。

羊水细胞为来自于胎儿体表、呼吸道、消化道和泌尿生殖道的脱落细胞，死细胞约占95%，需要在无菌环境、适当温度、湿度和酸碱度等条件下经过细胞培养，使活细胞数目增多进而进行染色体核型分析。

不同孕周的羊水细胞培养成功率不同。

宋莉[6]回顾性分析了120例羊水细胞：其中孕周<18周的羊水细胞共35例，培养失败4例，成功率88.6％；孕周在18～22周的羊水细胞共62例，失败0例，成功率100％；孕周>22周的羊水细胞共23例，失败2例，成功率91.3％。

郑娇，李春艳等[7]认为孕周偏小(<18周)，羊水里游离细胞量较少，活性细胞也较少，离心后可见很少量沉淀，接种后需要适当延长培养时间，较正常细胞晚2～3天换液。

反之，大孕周(>26周)羊水里细胞较多，但活性细胞较少，培养成功率降低。

可在离心后稀释羊水浓度，分多瓶培养促进羊水细胞贴壁。

对于孕周过大且含有大量胎脂羊水，须在培养4天后显微镜下观察，如有细胞贴壁须提前换液，才能提高培养成功率。

1.2羊水的性状羊水培养失败的主要原因就是细胞集落过早地老化或成纤维细胞过多，传代后集落细胞变性，形成巨长梭形细胞，使得收获时不能得到足够的分裂相，而血细胞、血液中的某些成分以及胎脂、胎粪等都是引发细胞集落过早老化以影响羊水细胞培养的因素。

羊水细胞培养中会遇到不同性状的羊水标本，如羊水中混有大量胎脂、胎粪、大量的新鲜血液或宫内的陈旧性出血，羊水可呈绿色、红色或褐色等不同的颜色，此时细胞培养难度大。

国内有文献报道，不合格的羊水（如血性羊水、混有胎脂或胎粪、离心后沉淀物过少等）的细胞培养成功率仅为78%[8]。

革兰氏染色法一般步骤和影响其结果准确性的关键因素分析革兰氏染色是一项经典的细菌鉴别手段，自19世纪80年代丹麦的医师GRAM创立起，至今已经近一个半世纪，仍旧在细菌的检测和鉴定分类上被广泛应用着。

在我国，GB 4789系列的国标中很多致病菌的检测也都需要进行革兰氏染色，可见其重要性。

甚至可以说没有精准掌握革兰氏染色的微生物检验员，不会是一个合格的检验员。

革兰氏染色原理细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒染后的颜色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌(G+),后者为革兰氏阴性菌(G-)。

为方便进一步观察，脱色后可再用一种红色染料如碱性番红等进行复染。

阳性菌仍带紫色，阴性菌则被重新染上红色。

有芽孢的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现负反应。

细菌细胞通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色法一般步骤1.涂片固定。

在干净的载玻片中央滴加一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成菌悬液并涂布成直径约1cm的薄层。

为避免因菌数过多聚集成团，不利于观察细菌个体形态，可在载玻片一侧进行上述操作，而在另一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。