脱钙骨组织的染色方法

三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响张大贵;林小芳;张普;周婵萍【期刊名称】《中国现代医生》【年(卷),期】2012(50)24【摘要】目的探讨三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响.方法选择12例骨组织,随机分为3组.A组用14％硝酸脱钙液进行处理,B、C组分别用EDTA脱钙液、PLANK脱钙液进行处理,同时对CD3、CD68、Ki-67和TTF-1染色.结果室温条件下,硝酸脱钙液的脱钙时间最短,但对组织损伤最大.PLANK脱钙液和EDTA脱钙液脱钙效果较好,组织结构完整,形态清晰,免疫组化染色较好.结论室温条件下,三种脱钙液巾PLANK脱钙液和EDTA脱钙液对骨组织脱钙及免疫组化染色效果较好.但南于EDTA脱钙液脱钙时间过长,PLANK脱钙液脱钙均匀,速度快,更适合用于临床病理检查.硝酸脱钙液脱钙最快,但是免疫组化染色效果较差.【总页数】3页(P101-103)【作者】张大贵;林小芳;张普;周婵萍【作者单位】温州医学院附属第二医院病理科,浙江温州325000;温州医学院附属第二医院泌尿外科,浙江温州 325000;温州医学院附属第二医院病理科,浙江温州325000;温州医学院附属第二医院病理科,浙江温州325000【正文语种】中文【中图分类】R446.4+1【相关文献】1.三种脱钙液对免疫组化染色效果的比较 [J], 孙庆妹;刘军2.三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析 [J], 连丽琴;夏凌志;钟惠霞3.四种脱钙液对骨组织HE和免疫组化染色的影响 [J], 李锐;金玉兰;韩一丁;刘红刚4.混合脱钙液与EDTA脱钙液对骨组织切片HE染色影响的分析 [J], 吴拮;孙立国;赵成相;李静;郭国峰;吕荣5.八种脱钙液对骨组织制片后HE染色质量影响的实践探究 [J], 方皓;云杰苗;王雄;袁滋铎;林俞辰;陶子春;薛逢贵;胡爱华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

trap染色答案：Trap染色是用于检测骨组织、骨细胞中特征物质的染色，使破骨细胞呈红色，背景呈绿色或蓝色。

抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）为破骨细胞的标志酶，特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所特有，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。

在含酒石酸的酸性条件下，trap能将萘酚AS-BI 磷酸盐水解，产生的萘酚AS-BI立即与fast red或六偶氮副品红结合，在酶活性部位形成不溶性的红色染料，通过观察红色染料的形成可间接了解酸性磷酸酶的活性，进一步鉴别及分析破骨细胞的状态。

分析：骨组织切片及trap染色实验步骤1、骨组织脱钙：新鲜骨组织固定于4%多聚jia醛24h 以上。

将组织从固定液取出置于EDTA脱钙液内脱钙（不能用含酸的脱钙液脱钙），每3天换一次脱钙液，至骨组织针扎可以顺利通过为止。

2、取材：在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

3、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。

75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I 1h-蜡II 1h-蜡III 1h。

4、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。

先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。

于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

5、切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。

切片漂浮于摊片机40℃ 温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。

待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

6、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20m in-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

脱钙液在微波辐射下对骨组织作用效果及免疫组织化学染色的影响中华病理学杂志/990220 骨组织脱钙常规多采用酸性液体(如硝酸、盐酸、甲酸等)进行脱钙，一般需较长时间，组织细胞结构很难保持完整清晰，有些甚至破坏组织结构很严重，从而影响病理学的诊断和研究。

骨组织中的蛋白抗原得不到很好的保存，有时甚至丢失。

为此我们对9例骨组织用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为脱钙液，利用微波辐射脱钙[1，2]并进行免疫组织化学方法定位，观察骨组织结构改变和蛋白抗原保存情况，得到较满意的结果。

一、材料与方法1.材料：9例骨组织为我科活检标本(骨肉瘤3例，肋骨2例，胫骨2例，股骨2例)，其组织大小为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm；微波炉为浙江临安生产的YWY781B型；EDTA为进口分装，购于北京化学试剂公司；免疫组化试剂为福州迈新生物技术开发公司赠。

2.脱钙液配制：A液：EDTA10 g，PBS缓冲液(pH 7.2)100 ml，加NaOH搅拌溶解后，用1 mol/L HCl调pH至7.2，再加甲醛15 ml。

B液：甲酸15 ml，甲醛10 ml，蒸馏水75 ml。

C液：硝酸5 ml，甲醛10 ml，蒸馏水85 ml。

D液：甲酸10 ml，硝酸3 ml，盐酸5 ml，冰醋酸2 ml，甲醛10 ml，蒸馏水70 ml。

3.脱钙方法：本实验9例骨组织各分两组，即微波脱钙组和室温脱钙组。

微波组：将骨组织放入平底小烧杯内，分别装有上述各种脱钙液，表面加一层液体石蜡[3]，以微波4档间歇脱钙，每次辐射1分钟，每次辐射之间都将烧杯移至室温冷却5分钟，以保证每次的微波辐射脱钙液的温度不至于太高。

室温组：每隔4小时更换一次脱钙液。

以大头针能刺进骨密质为完成脱钙标准。

4.免疫组织化学方法：组织脱钙后经常规组织处理切片，枸橼酸微波恢复抗原后，应用SP法进行免疫组织化学反应[4]，检测骨组织中骨形成蛋白(BMP单抗)和波形蛋白(Vimentin单抗)。

三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响目的探讨三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响。

方法选择12例骨组织，随机分为3组。

A组用14%硝酸脱钙液进行处理，B、C组分别用EDTA 脱钙液、PLANK脱钙液进行处理，同时对CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。

结果室温条件下，硝酸脱钙液的脱钙时间最短，但对组织损伤最大。

PLANK 脱钙液和EDTA脱钙液脱钙效果较好，组织结构完整，形态清晰，免疫组化染色较好。

结论室温条件下，三种脱钙液中PLANK脱钙液和EDTA脱钙液对骨组织脱钙及免疫组化染色效果较好。

但由于EDTA脱钙液脱钙时间过长，PLANK 脱钙液脱钙均匀，速度快，更适合用于临床病理检查。

硝酸脱钙液脱钙最快，但是免疫组化染色效果较差。

标签：脱钙液；骨组织；免疫组化染色骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。

如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。

本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。

1 材料与方法1.1 标本选择12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。

1.2 三种脱钙液①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。

③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。

介绍一种简易快速的骨髓组织脱钙法骨髓组织脱钙法是一种用于骨髓组织样品制备的技术。

它的目的是去除样品中的钙，以便进一步研究骨髓细胞的形态学和功能。

下面将介绍一种简易快速的骨髓组织脱钙法。

步骤1：收集骨髓样品首先，需要收集一定量的骨髓样品。

这可以通过骨髓穿刺或手术获取。

确保收集足够的样品以供后续实验使用。

步骤2：制备溶液接下来，需要制备脱钙溶液。

一般来说，脱钙溶液包含酸性溶液，如乙酸酸液、硝酸或盐酸溶液。

选择合适的酸性溶液取决于实验要求和个人偏好。

请注意，使用酸性溶液时要格外小心，避免与皮肤和眼睛接触，并在通风的地方操作。

步骤3：处理样品将收集的骨髓样品放入装有脱钙溶液的容器中。

确保溶液足够覆盖样品，并轻轻摇动容器以确保均匀混合。

将样品在室温下放置一段时间，以便溶液中的酸性成分可以与骨髓中的钙发生反应。

步骤4：取出样品通过滤纸或筛网等方法，将骨髓样品从溶液中分离出来。

确保尽可能去除样品中的酸性溶液以防止可能的干扰。

这可以通过将样品洗涤数次来完成，使用纯净水或盐水进行洗涤。

重复这个步骤，直到样品完全清洁为止。

步骤5：制备制片将脱钙后的骨髓样品制备成制片，以便进行形态学和功能性分析。

这可以通过将样品放在载玻片上，然后用染色剂进行染色来完成。

步骤6：观察和分析最后，使用显微镜观察制备好的制片。

通过观察细胞的形态学特征和功能性变化，可以获得关于骨髓组织的更多信息。

这种简易快速的骨髓组织脱钙法是比较常见和简单的方法之一、然而，不同的实验要求可能需要不同的脱钙方法。

因此，在进行特定实验之前，请确保了解实验的要求，并选择合适的方法。

另外，注意在操作过程中的安全措施，避免对自己和他人带来任何伤害。

临床病理检验中不同骨组织脱钙液效果的比较李玉莲;徐晓艳【摘要】目的对两种脱钙方法进行比较,获得简单、便捷、快速适用于临床病理制片的脱钙方法. 方法观察两种脱钙液:5％硝酸脱钙液(硝酸5ml加入95 ml蒸馏水)和快速脱钙液(含36％-38％盐酸8ml、冰醋酸5ml、水杨酸10 g、蒸馏水87ml),在常温及微波条件下对骨组织脱钙及HE切片染色效果的影响. 结果常温条件下,5％硝酸使组织结构有些破坏,染色效果不佳.微波条件下,使用快速脱钙液对骨组织结构损伤小,染色效果佳,适合于临床病理的骨组织制片. 结论标本经快速脱钙液处理后,其切片质量大大提高并远远优于普通脱钙液.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2014(045)010【总页数】3页(P996-997,1004)【关键词】骨组织;脱钙液;HE切片【作者】李玉莲;徐晓艳【作者单位】内蒙古医科大学病理学教研室,呼和浩特010059;内蒙古医科大学第一附属医院病理科;内蒙古医科大学病理学教研室,呼和浩特010059;内蒙古医科大学第一附属医院病理科【正文语种】中文【中图分类】R361.2含有骨质的肿瘤，钙化组织及骨髓穿刺组织都很坚硬，要想制成几微米的漂亮HE 切片是很困难的。

脱钙液是决定骨骼、牙齿、病理性钙化或骨化组织切片质量、染色效果的关键技术之一。

目前使用的脱钙液大多数是无机强酸类制剂，虽然脱钙效果好，但造成组织形态，特别是细胞结构的破坏。

因此，在本实验中我们选择了传统的脱钙液和快速脱钙液两种脱钙液进行比较，进而寻找一种更适合于骨组织脱钙的方法。

研究中发现快速脱钙液在不破坏组织结构及影响染色的同时，它可促进脱钙并加快脱钙速度，防止纤维性组织过度膨胀，并且保证了切片的质量，现报道如下。

1 材料与方法1.1 材料收集内蒙古医科大学附属医院2009-2011年手术切除的骨肿瘤、病变骨及骨髓穿刺病人标本共40例。

根据标本的不同将骨组织取成体积为1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的薄片(骨髓一般直径均为0.1 cm)，放入10%中性福尔马林固定24 h，用于脱钙实验。

脱钙骨免疫组化染色方法的构建
吴鸿雁
【期刊名称】《齐齐哈尔医学院学报》
【年(卷),期】2004(025)005
【摘要】在对骨骼生理和病理的研究过程中，经常需要制备脱钙的骨免疫组化标本，然而由于骨骼组织的特殊性，制备好的骨组化标本也并不是一件容易的事。

由于骨组织中60％以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶，脱钙是标本制备中至关重要的过程。

一些强酸如盐酸，硝酸等虽能快速有效除去骨组织中钙盐，但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏，使接下来的工作无法进行；我们仿照目前国外方法：EDTA低温脱钙[1]，得到的结果比较满意，现总结如下。

【总页数】1页(P541)
【作者】吴鸿雁
【作者单位】南京大学医学院附属鼓楼医院病理科,210008
【正文语种】中文
【中图分类】R392
【相关文献】
1.两种常用的免疫组化染色方法对NOS染色效果的比较 [J], 居培;余红民;
2.EML4-ALKVentana全自动免疫组化和手工免疫组化染色方法应用 [J], 周立娟;苏丹;张海青;
3.HE染色切片褪色后再进行免疫组化染色方法的比较 [J], 李丽;杨桂芳
4.HE染色切片褪色后免疫组化染色方法研究 [J], 刘海芳
5.EDTA微波脱钙骨的免疫组化染色 [J], 刘大维;初同伟;张良;邱俊
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。

2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。

4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。

5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。

6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。

7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。

2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。

5.PBS冲洗3次，每次5min。

6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。

7.PBS冲洗3次，每次5min。

8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。

10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

12.DAB显色5min。

13.自来水冲洗10min。

14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。

15.自来水冲洗10min。

16.常规脱水，透明，封片，镜检。

骨组织快速脱钙法
近年来，在生物医学研究领域，研究人员经常需要从骨骼组织中快速脱钙。

快速脱钙
技术可用于细胞组织培养、哺乳动物研究和细胞组织工程制备。

快速脱钙的主要目的是为
了更好地提取或分离细胞或其组织介质，以便进行后续的细胞组学分析或克隆。

现有的快速脱钙技术大多使用高浓度的EDTA来脱除组织中的钙离子，但是该方法有
几个缺点，如：（1）脱除过程耗时较长，（2）由于EDTA有强烈胃溃疡作用，因此需要
慎重使用，（3）EDTA会干扰细胞活性，或产生活性抑制作用，对后期实验的结果有影响，（4）EDTA脱除出的细胞可能是死的，效率低，（5）脱除过程中使用的EDTA无法循环。

因此，开发一种新型快速脱钙技术是有必要的。

该新型脱钙技术基于交联十六烷磺酸
钠（CTAC）和乙醇两个试剂，该试剂可准确、快速地脱除骨骼组织中的钙离子。

CTAC具有水溶性好，无毒、无味、无气味、体积小且可循环利用等优点，通过特定的缓冲系统，可
以准确、快速地调节钙离子，实现快速脱钙。

此外，CTAC不会影响细胞活性，乙醇的加入可以以正常的细胞保护组织，同时不影响细胞活性，保持细胞的生长性。

该方法简单且快速，实验结果表明，该方法与传统的EDTA脱钙方法相比，可以在几
分钟内脱除组织中的钙离子，且可保护细胞的活性，有效增加后期实验的准确性，该方法
值得推广应用。

组织学技术脱钙切片标本制作含钙的组织，骨、牙1 脱钙剂常用：硝酸、盐酸、硫酸、甲酸（蚁酸）、枸橼酸（柠檬酸）、三氯醋酸（三氯乙酸）、乙二胺四乙酸（EDTA）最常用的无机酸为硝酸，最常用的有机酸为EDTA。

（1）硝酸脱钙快，效果好一般用5%硝酸水溶液，不超过10%2毫米厚的骨片脱钙2~3天（2）甲酸良好的脱钙剂。

脱钙较慢，对骨组织结构破坏较轻2~3毫米厚骨片，松质骨约48小时，密质骨7~10天，经常换液染色效果比硝酸好脱钙时加入尿素等试剂，防止纤维性组织过度肿胀而使组织受破坏（3）乙二胺四乙酸（EDTA）很好的脱钙剂，对组织破坏极小，长期脱钙也无明显破坏脱钙后的染色效果好脱钙时间长。

2周以上甚至3个月。

加温至37℃可加快脱钙常用15%水溶液。

2 脱钙液（1）单纯脱钙液：一种脱钙剂浓硝酸5毫升，尿素3~5克，蒸馏水100毫升浓硝酸5毫升，甲醛5毫升，甘油5毫升，蒸馏水100毫升浓甲酸50毫升，70%酒精 50毫升5%甲酸水溶液5毫升，蒸馏水95毫升三氯醋酸5克，10%甲醛100毫升浓盐酸15毫升，氯化钠175克，蒸馏水1000毫升。

用时每200毫升每天加浓盐酸1亳（von Ebner）EDTA15克，蒸馏水100毫升（2）混合脱钙液枸橼酸甲酸液：枸橼酸钠结晶10克，90%甲酸25毫升，蒸馏水75毫升甲酸三氯醋酸液：85%甲酸50毫升，95%酒精50毫升，枸橼酸钠结晶10克，三氯醋酸0.5克，蒸馏水50毫升3 脱钙基本方法⑴取新鲜骨固定于10%甲醛水溶液或稍久。

⑵脱钙（针刺能顺利进入组织），充分水洗（中止脱钙）。

⑶入5%硫酸钠水溶液12~24小时（中和），流水冲洗过夜。

⑷脱水、透明、浸蜡、包埋、切片50%、70%、80%、90%、95%酒精、冬青油透明1、冬青油透明2、二甲苯洗去冬青油（70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、正丁醇1、正丁醇2、软蜡、硬蜡、包埋、切片）切片10微米左右。

⑸苏木精伊红染色。

混合脱钙液与EDTA脱钙液对骨组织切片HE染色影响的分析目的比较不同脱钙液对骨组织的脱钙能力的差异，探讨其对HE染色的影响。

方法选取16例大鼠胫骨标本，运用两种常用的脱钙液（混合脱钙液和EDTA 脱钙液）进行脱钙，比较其脱钙效果和对HE染色的影响。

结果两种脱钙液对骨组织的脱钙能力、HE染色效果影响有显著区别。

结论混合脱钙液时间最短，但切片和染色效果最差；EDTA脱钙液对骨组织损伤小，HE染色效果最好，但用时较长。

Abstract：Objective To compare the difference of different decalcifying fluid on bone decalcification ability，and to investigate its effect on HE staining.Methods 16 cases of rat tibia specimens，using two kinds of decalcifying fluid（mixture of decalcifying fluid and EDTA decalcifying fluid）were decalcified，compare the decalcification effect and the effects on HE staining.Results Two decalcification of bone tissue decalcification ability，HE staining effect has significant difference.Conclusion Mixed decalcifying fluid in the shortest time，but the sectioning and staining effect is the worst；EDTA decalcification of bone HE staining had the best effect，but with a longer time.Key words：Mixed decalcification solution；EDTA decalcification liquid；HE staining骨组织是一种坚硬的结缔组织，由骨细胞和骨基质组成。

三种不同脱钙液在骨组织石蜡切片中的应用比较杜洪;金荣【摘要】目的:比较不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力,优化骨组织石蜡切片的制作流程.方法:选取15例手术切除的新鲜骨标本,运用3种不同的脱钙液(Jenkins脱钙液、14％硝酸水溶液、14％硝酸甲醛生理盐水溶液)进行脱钙,记录脱钙时间,常规脱水、切片、HE染色,镜下观察,对比3种脱钙液对骨和骨髓组织常规病理切片质量和HE染色效果.结果:14％硝酸甲醛生理盐水溶液组脱钙能力最强,脱钙最均匀,耗时最短,既能有效完全除去骨皮质中的钙质,又能保护骨髓组织及细胞的形态完好,切片质量和HE染色的效果最佳;14％硝酸水溶液组脱钙液,使骨组织疏松发泡,组织变黄,对组织的损伤大,脱钙不均匀,组织切片不完整,制片质量和HE的效果最差;Jenkins脱钙液组对组织的脱钙能力、损伤程度、制片质量和HE染色效果良好,14％硝酸甲醛生理盐水溶液组和14％硝酸水溶液组之间.结论:3种脱钙液对骨和骨髓组织都具有良好的脱钙能力,制片质量及HE染色效果比较,14％硝酸甲醛生理盐水溶液＞ Jenkins脱钙液＞14％硝酸水溶液;14％硝酸甲醛生理盐水溶液最适用于临床常规病理制片中骨和骨髓组织的脱钙.【期刊名称】《甘肃医药》【年(卷),期】2016(035)005【总页数】3页(P368-370)【关键词】骨组织;脱钙液;HE染色【作者】杜洪;金荣【作者单位】730050 甘肃兰州,甘肃省肿瘤医院病理科;730050 甘肃兰州,甘肃省肿瘤医院病理科【正文语种】中文骨组织是由骨细胞和骨基质组成的坚硬的结缔组织，骨基质富含以磷酸钙和碳酸钙为主的无机钙盐，二者的存在造成骨组织的硬度较大，不易切片且极易脱片，即便能够勉强制成切片，在蓝色钙盐背景下也难以看清细胞结构，对病理诊断工作造成很大的不便，因此在临床病理活检或实验性动物研究中必须要进行脱钙处理才能进行常规制片和观察［1］。

但是，如果骨组织脱钙过度又会严重影响组织细胞染色效果，或使组织抗原丢失，从而影响对病变组织的病理诊断或科学实验工作［2］。

技术方法两种组织脱钙法对免疫组织化学染色影响比较杜 娟,柳剑英,苏 静(北京大学基础医学院病理学系,北京 100191)[摘 要]目的:了解1%(体积分数)盐酸和10%(体积分数)硝酸脱钙液对多种抗原免疫组织化学染色效果的影响。

方法:选择伴有灶状钙化的软组织标本包括甲状腺乳头状癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和淋巴结各3例,骨组织标本包括活检和尸检病例共9例,将样本分为3组,一组分别用10%(体积分数)硝酸处理24、42和48h ,另一组分别用1%(体积分数)盐酸处理1、2和3h ,还有一组不用酸处理作为对照组,同时进行多种抗原免疫组织化学染色,其中乳腺癌组织作ER 、PR 和K -i 67染色,甲状腺癌组织作TT F -1染色,前列腺癌作34 E12和P504s 染色,结肠癌作AE1/AE3、P504s 和K -i 67染色,淋巴结作CD 3、CD 20和K -i 67染色,骨组织作CD3、CD 20、CD68、CD 235a 、M PO 、K -i 67、A E1/A E3和TTF-1染色。

结果:伴有钙化的软组织和骨组织内多种抗原免疫组织化学染色阳性程度均随酸处理时间的延长而有不同程度的下降,骨组织对酸处理的耐受力比软组织强;不同抗原对酸处理的敏感性不同,TTF-1和K -i 67最为敏感,ER 、CD3、和CD 20耐受性较好。

结论:大多数情况下,盐酸和硝酸处理都会降低组织免疫组织化学染色的敏感性,但是对不同抗原的影响程度不同。

大块骨组织可以采用10%(体积分数)硝酸脱钙,软组织比例较高的骨组织和骨髓活检组织尽可能使用1%(体积分数)盐酸脱钙。

[关键词]脱钙技术;盐酸;硝酸;免疫组织化学[中图分类号]R36-33 [文献标志码]A [文章编号]1671-167X (2011)02-0290-05do:i 10.3969/.j issn .1671-167X.2011.02.025Co m parison of t wo different tissue decalcification m ethods for i m m unohistoche m istryDU Juan ,L I U Ji an -y ing ,S U Ji ng(D epa rt m en t of Patho l ogy ,Peking U n i versity Schoo l of Basic M ed i ca l Sc i ences ,Be ijing 100191,Ch i na)ABSTRACTObjective :To i n vestigate t h e effects of 1%hydr och loric ac i d and 10%n itric ac i d on i m m u -nohistoche m ica l sta i n i n g for several antigens .M et hods :F ifteen cases o f foca lly ca lcified soft tum ors i n -c l u di n g three cases of t h yro i d papillary carc i n o m a ,three o f breast i n vasi v e ducta l carcino m a ,three of prostate cancer ,three of colon adenocarc i n co m a and t h ree o f nor m a l ly m ph nodes ,w ere selected i n th is study ,and so w ere n i n e cases of bone and bone m arro w tissue fr o m b i o psy and au topsy .T issue sa m ples w ere div i d ed i n to three groups .One group w as each soaked i n to 10%nitric acid for 24,42and 48h,another group w as each incubated i n 1%hydr och l o ric ac i d for 1,2and 3h .The o t h er g r oup w hich w as no t treated w ith ac i d w as regarded as contro.l Then i m munoh istoche m ical sta i n i n g w as conducted i n these sa m ples for an ti g ens as fo llo w s :ER,PR and K -i 67in breast invasive ducta l carc i n o m a ;TTF -1i n thyroid papillar y carci n o m a ;34 E12and P504s i n prostate cancer ;AE1/AE3,P504s and K -i 67i n co l o n ade -nocarcinco m a ;CD3,CD20and K-i 67i n ly m ph nodes ;CD3,CD20,CD68,CD235a ,MPO,K -i 67,AE1/AE3and TTF-1in bone tissue .R esults :A fter the tissues deca lcificated in bo th acid so l u ti o ns for so m e ti m e ,t h e numbers o f positi v e cells decreased and the i n tensity of i m m unosta i n i n g beca m e w eaker ,wh ich w as proportionate to ti m e .Bone tissue w as less i n fluenced than calc ified soft ti s sue .D ifferent antigens sho w ed d ifferent sensiti v ity to the sa m e ac i d treat m en.t TTF -1and K -i 67w ere the t w o m ost vu l n erable an -tigens a m ong t h e m;wh ile ER,CD3and CD20w ere the least influenced .The effects o f decalcifica ti o n on i m m unostai n i n g o f one antigen w ere the sa m e i n d ifferent tissues .Conc l u sion :I n m ost cases ,both hy -drochloric acid and n itric acid deca lcificati o n can lo w er the sensitivity o f i m munoh istoche m ical sta i n i n g ,but have different effects on different anti g ens .It is better to use 10%nitric aci d for decalc ification of relati v ely lar ge bone tissue and to use 1%hydrochloric ac i d for bone m arro w tissues and bone tissues con -ta i n i n g m uch m ore so ft tissue .KEY W ORDS Decalcification techn i q ue ;H ydrochloric acid ;N itric acid ;I m m unoh i s toche m istry基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划,2007CB815602-5)资助Supported by the N ati on al Basic Res earch P rogra m of Ch i n a (973Progra m,2007CB815602-5)C orrespond i ng au t hor s e -m ai,l li u ji anyi ng @b j m u 网络出版时间:2011-3-17 15 37 00 网络出版地址:htt p ://k.i net/k c m s /d etail/11.4691.R.20110317.1537.004.h t m l骨组织和钙化软组织内含有大量以磷酸钙和碳酸钙为主的无机钙盐,组织质地较硬,往往难以直接制片[1-4],即便能够勉强制成切片,在蓝色钙盐背景下也难以看清细胞结构,对病理诊断工作造成很大290 J OURNAL OF PEK I NG UN I VERSITY(H EALT H SC IENCES ) V o.l 43 No .2 Apr .2011的不便,因此这类组织需要脱钙处理后才能进行常规制片和观察。

脱钙骨硫堇-苦味酸染色法
一、脱钙骨切片制作
1．脱钙：新鲜骨10%福尔马林或4%多聚甲醛固定，5%硝酸或10~15%EDTA液脱钙。

或以硝酸脱钙兼固定液处理：
硝酸5%，甲醛10%，水80%，甘油5%
2 蒸馏水洗去多余的酸液。

3 5%硫酸钠水溶液处理。

4 自来水浸泡或冲洗充分。

5 脱水、透明或脱水兼透明：
脱水、透明：70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、无水酒精、无水酒精-二甲苯、二甲苯
脱水兼透明：70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、正丁醇2~4次
6 浸蜡：
60~65℃石蜡浸2次，各30分钟和45~60分钟
7 包埋、切片、展片、烘干：
切片厚度10微米左右（8~20微米）
二、硫堇-苦味酸染色法
方法：
⑴入硫堇氨液染色3~5分钟，蒸馏水速洗。

硫堇氨液：硫堇（劳氏紫， Thionin）0.125克，蒸馏水100ml，浓氨水1~2滴，混合后过滤。

⑵入苦味酸(Picric acid)饱和水溶液（约1.22克/100ml）处理1~2分钟，蒸馏水速洗。

⑶95%酒精分色两次或95%酒精甲醛液（1：1）1~2小时。

⑷无水酒精脱水，可经石炭酸-二甲苯、二甲苯透明，中性树胶加盖玻片封固。

结果：
骨小管、骨陷窝及哈佛氏管（中央管）呈棕色至棕黑色，背景呈浅棕色。

注意：
此法用火棉胶切片效果较好。

硫堇氨液染色要掌握好时间，过染则背景着色深，使骨小管显示不清晰。