肠出血性大肠杆菌O157：H7的快速可视化检测

大肠杆菌O157：H7检测方法的新进展大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠埃希菌(EHEC)血清型中极为重要的一组。

美国是发生O157:H7型肠出血性大肠杆菌引发的食物中毒的第一个国家，此后，在加拿大、德国、英国、日本等多国由此种菌引发的食物中毒不断发生，由此菌产生的感染问题日益严重，因此对该菌的控制已成为世界性问题。

寻求对EHEC快速、准确的检测方法是解决此问题的关键，因此大肠杆菌O157:H7检测方法的研究逐渐受到重视。

1 细菌学分离法细菌学分离法原理是采用培养基—山梨醇麦康凯琼脂，根据O157:H7绝大多数菌株不发酵山梨醇的特性进行分离。

但是由于还有部分血清型的大肠杆菌O157和某些革兰氏阴性菌也存在不发酵山梨醇的特性，因此需要对此方法进行改良。

其一，经加入鼠李糖和头孢克肟改进成为CRSMAC，可提高分离的敏感性；其二，作为一种单管筛选培养基，将H7抗血清加入SMAC半固体，检测EHECO157:H7。

此方法检测EHECO157:H7的优点是简单、直观、成本低，但是由于发酵山梨醇的O157:H7变异菌株和非O157血清型的 EHEC不能用山梨醇培养基分离，因此其最大缺点是敏感性和特异性都很差。

2 免疫学方法采用免疫学方法检测大肠杆菌O157：H7的方法较多，主要检测菌体抗原O157和鞭毛抗原H7，常见的有如下五种方法：2.1 血清凝集方法血清凝集实验用来观察可疑菌与O157抗血清是否特异性凝集，目前为达到简便快速以及增强特异性的效果，采用凝集试验与分离培养方法结合进行的方式较多。

此类方法因O157抗血清常与小肠结肠炎耶尔氏菌06血清型、厄班血清型、马耳他及其他血清型大肠杆菌O157等存在交叉反应，所以检测非O157血清型的EHEC不能应用此法。

2.2酶联免疫法(ELISA)随着酶联免疫技术在微生物检验中的广泛应用，对于大肠杆菌O157：H7的检测，酶联免疫法逐渐成为常用方法之一，其原理是通过连接在磁珠上的抗体及碱性磷酸酶标记抗体实现待测细菌的双抗体夹心检测。

LAMP实时浊度法快速检测肠出血性大肠杆菌O157的研究肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157发病率越来越高，已经被世界卫生组织列为新的病原菌。

而大肠杆菌的传统检测方法消耗时间长、步骤多而复杂，因此开发高效、快速、特异性高的鉴定方法，已经成为当务之急。

在分子生物学水平上来研究EHEC O157的核酸结构和分子特征，采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法来进行检测EHEC O157，将可能取代PCR检测成为大肠杆菌O157快速检测的发展方向。

LAMP 实时浊度法是利用浊度仪全程监控等温扩增过程，主要通过LAMP扩增反应过程中会产生的一种白色沉淀副产物焦磷酸镁，与反应液中靶基因得到扩增的量成正比，通过沉淀产生的起始时间判断反应的进行的程度。

本研究主要针对EHEC O157的抗原基因rfbE和产Vero毒素的毒力基因stx1和stx2，设计特异性的LAMP引物对。

经条件优化后确定最适反应体系为，内引物（FIP和BIP）各1.6μM、外引物（F3和B3）各0.2μM、20mM Tris-HCl（PH8.8）、10mM KCl、8mMMgSO4、10mM（NH4）2SO4、0.1％Tween20、0.8M甜菜碱、8mM MgSO4、1.4mM dNTP、8U Bst DNA聚合酶和2μl DNA，63℃恒温反应60min以及在80℃下5min结束反应。

使用优化后的系统进行LAMP反应以确定3种引物的特异性、稳定性及灵敏度，研究结果显示，该方法的最低检出限为l03CFU/mL，比普通PCR法灵敏度提高100倍，可以检测添加菌量为100CFU/25g(mL)的样品。

运用此法对珠海地区的200份食品样品进行检测，为食品风险评估提供了基础数据。

LAMP实时浊度法解决了常规的LAMP法只能对反应终点进行检测的缺陷，它能对整个反应过程进行实时监控，无需通过凝胶电泳分析反应产物，使方法所得数据准确可靠，效率高，同时具有操作简单、灵敏快速等优势，是食品中致病微生物快速筛检的一种良好方法。

畜禽产品中肠出血性大肠杆菌O157：H7 的检测作者：黄梅清等来源：《福建畜牧兽医》 2017年第4期黄梅清1，2 蔡羲1，2 郑敏1，2 吴南洋1，2*（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州 350013）摘要为了解大肠杆菌O157：H7在畜禽产品中的带菌情况，采集2个屠宰场、福州市部分超市及农贸市场上的畜禽产品（猪肉、禽肉、蛋、内脏）631份。

采集的样品经改良EC新生霉素增菌肉汤增菌后，增菌液用快速检测试纸条和酶联免疫反应测试盒进行检测；菌液涂抹于山梨醇麦康凯琼脂平板和大肠杆菌O157显色培养基平板，选取可疑菌落用乳胶凝集试剂盒进行检测，结果均未检出大肠杆菌O157:H7。

关键词大肠杆菌O157：H7 动物产品检测分析文献标识码：A文章编号：1003-4331（2017）04-0019-02Detection of Escherchia coli O157:H7 from animal productsHuang Meiqing1,2 Zheng Min1,2 Cai Xi1,2 Wu Nanyang1,2*（1.Institnte of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013;2.Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center, Fuzhou 350013）Abstract To detect the Escherchia coli O157:H7 from animal products, six hundred and thirty-one animal products were collected from slaughterhouse, supermarket and farmers market in Fuzhou city. The collected samples were culturedin modified EC neonatal broth,at 37 ℃ for 20 hours,and the enriched cultures were cultivated on Sorbitol Maconkey Agar Plate and Escherichia coli O157 chromogenic medium plate. The cultures were detected by rapid test strip and ELISA kits. Escherichia coli O157:H7 was not detected from those animal products.Key words Escherchia coli O157:H7 Animal products Detection Analysis大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌（Enterohem-orrhagic Escherichia coli，EHEHC）的一个主要菌型，是一种新型肠道致病菌[1]。

肠出血性大肠杆菌O157快检方法的研究肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7感染性腹泻已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。

完善检测手段是进行该病流行病学调查以及疾病防控的关键问题之一。

本研究以stx1、stx2、eae和filC为靶基因建立了EHEC O157:H7 Mul-PCR 检测方法,同时优化了选择性增菌培养基,提高了检测的敏感性。

进而装备成试剂盒,便于储存和应用。

对各种模拟样品和100份肉牛粪便样品进行了检测,证明具有高度的敏感性和特异性。

随后针对EHEC O157毒力基因的特异性片段,设计了引物和探针,建立了基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR检测方法,在定性检测的基础上,能够进一步测定检测样品目的菌的污染程度,评价风险强度。

为进一步完善检测方法,本试验还建立了抗O157表面抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该细胞株分泌抗体特异性强,亲和力高,可用于EHEC O157免疫学检测方法的建立。

以其建立的免疫磁性分离方法,用于样品的集菌,将PCR检测的敏感性提高了两个数量级。

并用特异性单克隆抗体及兔抗O157多克隆抗体制备了EHEC O157胶体金免疫层析检测试纸条,敏感性为106CFU/mL。

具有操作简便、快速、结果准确、易于判读的特点,可用于大量样品的检测。

本研究形成一套系统的检测方法,为EHEC O157的流行病学研究及其疾病防控提供了坚实的技术支持。

第31卷,第10期 光谱学与光谱分析Vol .31,No .10,pp2598-26012011年10月 Spectro sco py and Spectr al Analy sisO cto be r ,2011　SPR 生物传感器快速检测大肠杆菌O157∶H7的研究斯城燕,叶尊忠＊,王一娴,盖　玲,王剑平,应义斌浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州　310029摘　要　建立了一种基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance ,SP R )原理的生物传感器方法,实现了快速检测大肠杆菌O 157∶H7。

研究选用BIA CO RE 3000系统及葡聚糖修饰的CM 5芯片,先用EDC /N HS 将芯片活化,然后抗体直接通过酰胺键固定在金表面,再用乙醇胺封闭,这样处理之后的芯片就可用于检测大肠杆菌O157∶H 7。

利用NaO H 溶液对芯片再生,实现对多个不同浓度样品检测,采用时间对响应单位(RU )记录数据。

该法检测大肠杆菌O157∶H 7的检测限为3×105CF U ·m L -1,RU 变化值和大肠杆菌O157∶H7的浓度在一定范围内相关性良好,相关系数达到0.99。

检测时间短,一个样品仅需5～7min ,再生效果好,芯片可重复使用50次以上。

可快速、在线、稳定地检测大肠杆菌O157∶H7,有望成为一种在线检测食品致病性微生物的有力手段。

关键词　SPR ;大肠杆菌;快速检测;再生中图分类号:Q 67 文献标识码:A D OI :10.3964/j .issn .1000-0593(2011)10-2598-04　收稿日期:2011-01-10,修订日期:2011-05-06　基金项目:国家自然科学基金项目(20907041),浙江省自然科学基金项目(Y2080914)和浙江省钱江人才计划项目(2008R10027)资助　作者简介:斯城燕,女,1986年生,浙江大学生物系统工程与食品科学学院硕士研究生 e -m ail :sichengy anz hj @＊通讯联系人 e -mail :z zye @zju .edu .cn引　言 根据中国疾病预防控制中心(CDC )的统计报告表明,我国每年发生的由致病菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件总数的30%～90%,目前大肠杆菌O157∶H7是国际公认的食源性致病菌之一。

粪便标本肠出血性大肠杆菌O157:H7的分离方法包括标本采集和增菌、免疫磁珠富集和培养、生化反应、血清学和毒力因子鉴定等步骤。

1．粪便标本增菌1)采集的标本应插入卡里－布莱尔半固体保存培养基中，立即送实验室接种于增菌培养基（EC肉汤+10mg/L新生霉素或Tryptic Soy Broth）；2)增菌培养：增菌液可用添加10mg/L新生霉素的EC肉汤。

也可用1/8N 的HCl+0.5%NaCl溶液，将标本处理30秒后，再用胰大豆胨培养液增菌。

2．免疫磁珠富集方法1)取下磁板，然后将事先编号的1.5ml离心管置于Dynal MPC－M架上；2)重新悬浮E.coli O157的DynaL磁珠,直到底部的沉淀消失。

吸取抗E.coliO157磁珠，每管20ul；3)取1ml增菌培养物的标本, 加入管中，然后盖紧管，每加一个样品,都要换新管；4)颠倒Dyna架几次, 然后在室温条件下, 置于 Dynal MX3样品混合器上,不断轻轻搅动,以阻止磁珠沉淀,持续时间10分钟（如果没有混合器，可人工混合）；5)将磁板插入到Dynal MPC－M上颠倒支架数次，以浓缩磁珠沉淀到管壁，作用持续3分钟；6)用配套的开盖器打开试管，小心的吸取悬浮液（包括残留在管盖上的液体），并弃掉（请检查影响产物出现的因素）；7)将磁板从Dynal架取下；8)加入1ml洗涤缓冲液（PBS—吐温），吸管不要接触小离心管，以免造成样品及缓冲液的交叉污染；然后盖上盖，将Dynal MPC－M架颠倒数次，以重新悬浮磁珠；9)重复5－8的步骤；10)重复5－7的步骤；11)用100微升冲洗缓冲液（PBS－吐温）重新悬浮磁珠细菌混合物。

用一个混合器做短暂的混匀。

此为富集的肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌悬液；12)将上述菌悬液划线接种于CT－山梨醇麦康凯（C－头孢菌素类抗生素、T－亚碲酸钾）等选择性培养基上，370C培养16～24小时。

3．生化反应、血清学和毒力因子鉴定1)生化反应鉴定：将疑似肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌落进生化反应。

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR 检测胡 慧1，陈雅君1，段志刚1，孟振北2，彭新然2，张龙现1，崔保安1，王亚宾1,*(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.漯河出入境检验检疫局，河南 漯河 450046)摘 要：为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction ，RT-PCR)方法，针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE 设计一对特异引物，建立SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 检测方法，并进行灵敏度、重复性和特异性实验，同时与常规PCR 方法进行比较。

结果显示所建立的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7，细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL ，临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL 的大肠杆菌O157:H7。

与常规PCR 方法相比，SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。

本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。

关键词：大肠杆菌O157:H7；rfbE 基因；SYBR Green Ⅰ；实时PCRReal-time PCR Detection of Specific Gene in Escherichia coli O157:H7HU Hui 1，CHEN Ya-jun 1，DUAN Zhi-gang 1，MENG Zhen-bei 2，PENG Xin-ran 2，ZHANG Long-xian 1，CUI Bao-an 1，WANG Ya-bin 1,*(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China ；2. Luohe Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Luohe 450046, China)Abstract ：A real-time PCR method was developed for the rapid and specific detection of Escherichia coli O157:H7. A pair of primers was designed according to the conserved sequence of rfbE gene in Escherichia coli O157:H7. The SYBR Green I real-time PCR method for detecting Escherichia coli O157:H7 was established. The sensitivity and specificity of this method was analyzed through the comparison with traditional PCR methods. The results indicated that the developed SYBR Green I real-time PCR method had the characteristics of excellent specificity, sensitivity and repeatability. The sensitivity of this developed method was 2 × 101 CFU/mL in pure cultures and 1 × 102 CFU/mL in artificially contaminated meat samples. In addition, the established method was also used for the detection of clinical samples. The results showed that the detection rate of real-time PCR for Escherichia coli O157:H7 was significantly increased when compared with traditional PCR. Therefore, the established real-time PCR method is a rapid, specific and sensitive method for the detection of Escherichia coli O157:H7.Key words ：Escherichia coli O157:H7；rfbE gene ；SYBR Green I ；real-time PCR中图分类号：R378.21 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)12-0278-05收稿日期：2010-08-19基金项目：河南省重大公益科研项目(81100912300)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAQ01047)； 漯河市科技计划项目(081203)作者简介：胡慧(1976—)，女，讲师，博士，研究方向为动物病原学。