肠出血性大肠杆菌(EHEC)PCR检测试剂盒

中国检验检测202丨年第1期食品中肠道出血性大肠埃希氏菌能力验证结果分析与讨论马蓉吉瑞周露马秋莲朱聿元(宝应县产品质量综合检验检测中心，宝应225800)摘要：为了提升实验室对食品中肠道出血性大肠埃希氏菌的检测能力，增强实验室竞争能力，本实验室参加了认监委 组织的食品中肠道出血性大肠埃希氏菌检测能力验证活动依据GB4789. 6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致 泻大肠埃希氏菌检验》，采用PCR方法检测毒力基因，对疑似菌进行鉴定。

发现编号19-H566和19-L321样品均检出肠道出 血性大肠埃希氏菌。

说明利用PCR方法检测致泻性大肠埃希氏菌的毒力基因能够有效的鉴别其致病型。

关键词：能力验证;肠道出血性大肠埃希氏菌;PCR检测中图分类号:TS201.3 文献标识码：A DOI：10. 16428/lO-1469/tb.2021. 01.030〇引言大肠埃希氏菌属于大肠埃希氏菌属，广泛分布在 人体和自然界中，大部分菌种对人体不会产生危害i l]。

但是，有些带有致病基因的菌种会引起人类肠道感染，并可引发致死性并发症:2],这类菌株被称为致泻性大 肠埃希氏菌(DEC)。

根据致泻性大肠埃希氏菌的致病 情况不同可将其分为5种类型及11种相关毒力基因：肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC)、肠道侵袭性大肠埃 希氏菌(EIEC)、肠道致病性大肠埃希氏菌（EPEC)、肠 产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、肠粘附性大肠埃希氏 菌(EAEC)。

其中，肠道出血性大肠埃希氏菌为最严重 的一种致病性大肠埃希菌，自1983年以来多次在世界 各地广泛流行，对人类的健康构成极大威胁11。

肠道 出血性大肠埃希氏菌的感染基本属于食源性疾病，牛 肉、牛奶、鸡肉、蔬菜、水果、饮料及水等均可成为传染 源0]，因此，对食品中肠道出血性大肠埃希氏菌的检测 就显得尤为重要。

然而，传统的微生物学分离、鉴定以 及血清学方法在检测病原微生物方面日益显现不足，PCR技术，B P聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)以其快速、灵敏以及特异性强的优势，成为了病 原微生物快速鉴别与分型的重要技术之一。

肠出血性大肠埃希菌实验室检测研究进展肠出血性大肠埃希菌( Enterohemorr hagic Escher ichia coli ,EHEC) 是一种新的致病性大肠杆菌, O157:H7 是EHEC 最主要的血清型。

EH EC O157:H7的致病力很强, 主要通过食物和饮水传播, 可引起出血性结肠炎( HC) 、溶血性尿毒综合征( HUS) 和血栓性血小板减少性紫癜( TTP) 。

HC 最常见, HUS 和TTP 的病死率较高, 有时可高达30% 以上。

我国已将肠出血性大肠杆菌列为21 世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12 种病原微生物之一。

同时，O157:H7菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。

已经成为全球性的公共卫生问题。

因此，特异、灵敏、快速的检测方法对于预防其暴发流行显得尤为重要。

本文就该菌近年来实验室检测技术方面的研究进展进行综述。

1 细菌的培养分离1.1 标本采集及增菌腹泻患者的粪便标本最好在发病早期及未用抗生素前采集, 可提高细菌培养的成功率, 以采集腹泻病人血性便为主, 注意无菌操作。

环境中EHEC O157:H7监测对象为动物粪便、水源和食物等标本。

标本通常用EC 肉汤增菌。

对EHEC O157:H7, 目前有两种选择性增菌液, 即改良EC 肉汤( mEC) 和改良胰酶大豆肉汤( mTSB) 。

前者在EC 肉汤的基础上降低胆盐浓度( 0.112%) 并添加新生霉素, 后者向TSB 添加3 号胆盐、缓冲剂和新生霉素。

用这些培养基增菌可提高肉类、奶类和粪便中O157:H7的检出率。

1.2分离培养1.2.1山梨醇麦康凯( SMAC) 琼脂平板EH EC C O157:H7不发酵山梨醇, 而绝大多数其他肠道菌群发酵山梨醇。

用该特点将麦康凯琼脂中的乳糖替换成山梨醇( 1%) , 可用于选择培养[1]。

该法简便易行, 在发病早期( 症状出现1~ 2 d) , 可从大多数患者的粪便中检出致病菌, 随着病程后延, 检出率降至33%左右[2]。

专利名称：一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒专利类型：发明专利
发明人：杨国林
申请号：CN201610483856.8
申请日：20160627
公开号：CN105925661A
公开日：
20160907
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用于食品中肠出血性大肠杆菌检测的试剂盒。

肠出血性大肠杆菌EHEC为出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的病原体。

引起人类疾病的主要是O157：H7血清型。

现有技术的检测方法耗时耗力，检测不便，而本发明提供了特异性检测肠出血性大肠杆菌EHEC的试剂盒，试剂盒中含有特异性结合肠出血性大肠杆菌EHEC的适配子，所述适配子为单链DNA。

本发明试剂盒具有检测时间短、研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，在食品与卫生安全检测中得到广泛应用。

申请人：杨国林
地址：100101 北京市朝阳区北四环东路97号北京联合大学
国籍：CN
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五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒研发背景大部分的大肠杆菌是人或动物倡导的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病。

致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发。

根据发病机制、临床特征、流行病学特征、O抗原血清及细菌的毒力测定，可将致泻大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌（EPEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、粘附性大肠杆菌（EAEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）。

目前针对致泻大肠杆菌的常规实验室检测方法仍然较为薄弱，需要研究快速、简便、准确的分子生物学方法。

【检验原理】五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11种毒力基因，针对这11种毒力基因，天津生物芯片试剂盒使用11对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点特异性结合，PCR反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大肠杆菌快速分型检测的目的。

【使用方法】1.试剂配制（试剂准备区）从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化，将PCR反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用前2000rpm离心10s。

设所需要的管数n（n=样本数+1管阴性对照品），每个测试反应体系试剂配置如下表。

计算所需要的n管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管中，充分混合均匀，分装至无菌PCR反应管中，每管24μl。

2.PCR扩增（扩增和产物分析区）将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm离心10s。

向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品各1μl，震荡混匀，于2000rpm离心10s。

将PCR管放入PCR仪中，使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2小时：Step 1 94℃ 5minStep 2 94℃ 30sStep 3 63℃ 30s 30 个循环Step 4 72℃ 90sStep 5 72℃ 5min3.结果判断（扩增和产物分析区）从PCR管中取出2μl PCR产物与9μl阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有11条带，分别为1487bp、1111bp、910bp、766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp和102bp。

大肠杆菌O157：H7 - 简介大肠杆菌O157:H7 - 简介肠出血性大肠杆菌(EHEC)是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。

以O157:H7血清型为代表菌株。

大肠杆菌O157:H7 - 生物学特征1、EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。

革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。

其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。

2、EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37?可耐受5小时;3、耐低温，能在冰箱内长期生存;在自然界的水中可存活数周至数月;4、不耐热，75? 1分钟即被灭活;对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。

5、EHEC 的最适生长温度为33-42?，37?繁殖迅速，44-45?生长不良，45.5?停止生长。

6、EHEC O157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。

EHECO157:H7虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光，即MUG阴性。

7、EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。

血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定。

前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验;后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验。

8、EHEC O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素(VT)，也称作类志贺氏毒素(SLT)，是EHEC的主要致病因子。

Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。

该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。

B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成。

肠出血性大肠杆菌(EHEC)肠出血性大肠杆菌（EHEC）大肠杆菌（E.coli）是一种在人和温血动物肠道内常见的细菌。

大多数大肠杆菌菌株无害。

然而，一些菌株，例如肠出血性大肠杆菌（EHEC）可引起严峻的食源性疾病。

它主要通过食用被污染的食物传染给人类，这些食物如生的或烹调不彻底的绞碎肉制品和原料奶。

它作为一个公共卫生问题的重要性得到承认是在1982年继美利坚合众国的一次该病暴发之后。

肠出血性大肠杆菌产生的毒素称为志贺样毒素或类志贺毒素，这是由于它们与志贺氏痢疾杆菌产生的毒素相像。

肠出血性大肠杆菌可在7℃-50℃的温度中生长，其最佳生长温度为37℃。

一些出血性大肠杆菌可在pH值达到4.4和最低水活度（Aw）为0.95的食物中生长。

通过烹调食物，使食物的全部部分至少达到70℃以上时可杀灭该菌。

O157:H7大肠杆菌是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型；然而在散在病例和暴发中也常常涉及其它血清类型。

肠出血性大肠杆菌引起的疾病肠出血性大肠杆菌引起的疾病症状包括腹部绞痛和腹泻，一些病例可能进展为血性腹泻（出血性大肠炎）。

还可能消失发烧和呕吐。

埋伏期3至8天，平均为3至4天。

大多数病人10天内康复，但是有少数病人（特殊是幼儿和老年人）的染病可能进展为威逼生命的疾病，例如溶血尿毒综合症（HUS）。

溶血尿毒综合症的特点是急性肾衰竭、溶血性贫血和血小板削减。

据估量，10%的肠出血性大肠杆菌感染者可进展为溶血尿毒综合症，病例死亡率为3%至5%。

总体来说，溶血尿毒综合症是幼儿急性肾衰竭的最通常缘由。

25%的溶血尿毒综合症病人可发生神经并发症（例如癫痫发作、中风和昏迷），在大约50%的幸存者中发生通常是轻型的慢性肾病。

不同年龄组的肠出血性大肠杆菌感染的发病不尽相同，所报病例的最高发病率发生在15岁以下的儿童中（美利坚合众国每10万病例中占0.7）。

63%至85%的病例是由于通过食物感染病菌。

肠出血性大肠杆菌进展为溶血尿毒综合症的百分比在散在病例（3%-7%）和与暴发相关的病例（20%或更多）之间有所不同。

医疗机构肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O104:H4腹泻病防控工作指引肠出血性大肠杆菌（EHEC）O104:H4腹泻病属于感染性腹泻，是我国法定报告的丙类传染病。

医疗机构应做好病例发现和报告、隔离治疗与管理、标本采集与送检、医院感染控制工作。

一、病例的发现与报告医疗机构的首诊医生通过对病人作出初步诊断，如病人有血便要加强对病人病原学检索，详细询问病人流行病学史可以提高发现病人和暴发疫情的敏感性。

1. 病例定义临床诊断病例：发病前10天有疫区旅行史（德国），且符合下列条件之一者：（1）有血性腹泻，腹部痉挛性疼痛等症状（2）有溶血性贫血、血小板减少及肾功能受损等HUS临床表现实验室确诊病例：临床诊断病例符合下列二项之一者（1）从粪便标本中分离到EHEC O104:H4菌株,且STX2毒素检测或其基因检测阳性（2）从粪便标本中检测到至少stx2、terD、rfbO104及fliC H4基因扩增阳性。

2. 病例发现与报告医疗机构执行职务的医务人员发现肠出血性大肠杆菌腹泻临床诊断病例、实验室确诊病例时，应于24小时内网络直报《疾病监测信息报告管理系统》，报告病种为“其它感染性腹泻”，“备注”中注明肠出血性大肠杆菌腹泻、是否发生溶血性尿毒综合征以及德国旅行史等情况。

并根据病例诊断进展及时做好报卡订正、删除等工作。

如果发现2例及以上肠出血性大肠杆菌腹泻聚集性病例，应于将情况于初步诊断后2小时内报告所属区县疾控中心。

二、病例管理及治疗原则1. 病例管理由于病人的预后较差，病死率高，因此病人需要住院隔离治疗。

急性期采取肠道病预防措施。

因为感染剂量极低，病人必须在连续二次粪检或直肠拭子检查呈阴性后，方准解除隔离，从事食品加工或照顾小孩、病人的工作，二次采样间隔≥24小时，并且应在最后一次抗菌素治疗48小时之后。

2. 治疗原则目前尚无特效手段可用于肠出血性大肠杆菌出血性肠炎治疗。

治疗目的以缩短病程、缓解病情、预防溶血性尿毒综合征（HUS）和血栓形成性血小板性紫癜（TTP）的发生、防止把病原菌传播给密切接触者。

肠出血性大肠杆菌O157：H7胶体金免疫检测试纸条的制备食源性病原微生物是当今食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因,在食源性病原微生物中,肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7是重要的病原之一。

本实验旨在制备抗0157：H7特异单克隆抗体,建立0157：H7胶体金免疫层析检测方法,为临床快速诊断以及带菌动物、环境污染物和食品等现场检测样品的快速筛查提供简便快速的检测手段。

研究内容分为三个部分：1.分泌抗大肠杆菌0157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立将E.coli O157:H7用甲醛灭活超声破碎,免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了7株分泌抗E.coli O157:H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为2E7、2F5、1G9、1D3、2H7、2G11和1C3,Ig 亚类分别是IgG2b κ、IgG2a κ、IgM κ、 I IgMκ、IgG2b κ、IgM κ和IgG2a κ。

用间接ELISA检测,1G9和2G11细胞培养上清液的效价为1.6×103,腹水效价均为1×1011；1C3、2E7、2F5、1D3和2H7细胞培养上清液的效价为1×101-2×102,腹水效价均为4×102-1×106。

相加ELISA结果显示,1D3和2H7mAbs对应相同的抗原表位,而其它五株对应不同的抗原表位。

用间接ELISA分析特异性,2E7、2H7和1D3为抗EHEC0157：H7特异性单克隆抗体,其它四株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。

Western blotting表明,1C3、1G9、2G11、2E7、1D3和2H7六株mAbs在蛋白分子量约35kD处有特异性条带,而mAbs2F5则未显示蛋白带。

2.大肠杆菌0157：1：17单克隆抗体胶体金免疫检测试纸条的研制采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,用纯化的单克隆抗体2E7标记,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜(NC)上；组装成双抗夹心法0157：H7胶体金免疫层析检测试纸条。

大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒组成:干制生化鉴定试剂:4种/盒×10 盒;0.5麦氏浊度比浊管:1支;配套试剂:Kovacs氏靛基质试剂1瓶、甲基红试剂1瓶、V-P甲、乙液试剂各1瓶; 使用说明书:1份实验操作步骤:
1. 从铝箔袋中取出试剂盒,打开盒盖,在试剂盒的长条槽中加入0.5mL无菌水;2. 用接种环从平板上挑取新鲜培养的单个纯菌落至适量无菌水中,制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液;3. 接种菌悬液分别至试剂盒的4个圆孔中,每孔接种量0.2mL,盖上盒盖,36℃±1℃培养24h。

结果判定:保存条件和保质期:室温避光保存1年。

其他相关试剂盒：名称用途及用法大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 用于大肠杆菌的IMVC 生化系统鉴定(GB4789.38-2012)，包括蛋白胨水、MR、VP和西蒙氏枸橼酸盐共 4 种生化鉴定试验和配套试剂(靛基质、甲基红、VP甲乙液)阪崎肠杆菌干制生化鉴定试剂盒Enterobacter sakazakii Dehydration Biochemical Identification Kit 用于阪崎肠杆菌的生化鉴定(GB4789.40-2010)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、西蒙氏柠檬酸盐、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蜜二糖、D-蔗糖和苦杏仁苷共10种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡)志贺氏菌干制生化鉴定试剂盒Shigella Dehydration Biochemical Identification Kit 用于志贺氏菌的生化鉴定(GB4789.5-2012)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、靛基质、尿素、水杨苷、七叶苷、甘露醇、棉子糖、ONPG、甘油、葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸对照、粘液酸、三糖铁、半固体共17 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)单增李斯特氏菌干制生化鉴定试剂盒Listeria Monocytogenes Dehydration Biochemical Identification Kit 用于单增李斯特氏菌的生化鉴定(GB4789.30-2010)，包括MR、VP、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、木糖、甘露醇、七叶苷共8 种生化鉴定试验和配套试剂(糖发酵添加剂、甲基红、VP 甲乙液)沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒Salmonella Dehydration Biochemical Identification Kit 用于沙门氏菌的生化鉴定(GB4789.4-2010)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、氰化钾对照、氰化钾、靛基质、尿素、甘露醇、山梨醇、ONPG、三糖铁共10 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)大肠埃希氏菌O157:H7干制生化鉴定试剂盒E.coli O157:H7 Dehydration Biochemical Identification Kit 用于大肠埃希氏菌O157:H7/NM的生化鉴定(GB/T4789.36-2008)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、MR、VP、靛基质、西蒙氏柠檬酸盐、纤维二糖、棉子糖、三糖铁、半固体共11种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质、甲基红、VP甲乙液)蜡样芽孢杆菌干制生化鉴定试剂盒Bacillus cereus Dehydration Biochemical Identification Kit 用于蜡样芽孢杆菌的生化鉴定(GB 4789.14-2014)，包括葡萄糖、VP、硝酸盐、明胶、动力培养基(蜡样)、甘露醇、西蒙氏柠檬酸盐、溶菌酶肉汤共8种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、硝酸盐还原甲乙液、VP 甲乙液)副溶血性弧菌干制生化鉴定试剂盒Vibrio parahaemolyticus Dehydration Biochemical 用于副溶血性弧菌的生化鉴定(GB 4789.7-2013)，包括无盐胨水、6% 盐胨水、8% 盐胨水、10% 盐胨水、葡萄糖、蔗糖、乳糖、Identification Kit 甘露醇、氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、VP、ONPG、3%NaCl三糖铁、3%NaCl半固体共16种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、糖发酵添加剂、VP甲乙液)致泻大肠埃希氏菌干制生化鉴定试剂盒Diarrheogenic E.coli Dehydration Biochemical Identification Kit 用于致泻大肠埃希氏菌的生化鉴定(GB/T4789.6- 2003)，包括氨基酸对照、赖氨酸脱羧酶、氰化钾对照、氰化钾、靛基质、尿素、三糖铁、半固体共8种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、靛基质)小肠结肠炎耶尔森氏菌干制生化鉴定试剂盒Yersinia enterocolitica Dehydration Biochemical Identification Kit 用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化鉴定(GB/T 4789.8-2008)，包括氨基酸对照、鸟氨酸脱羧酶、VP、蔗糖、鼠李糖、棉子糖、甘露醇、山梨醇、尿素、半固体共10 种生化鉴定试验和配套试剂(无菌石蜡、糖发酵添加剂、VP 甲乙液)。