超敏反应性疾病医疗管理知识学检测(PPT 68页)

2.标本：待测血清。 3.包被缓冲液、洗涤缓冲液、反应终止液（2 mol/L
H2SO4）等。 4.酶标板、微量加样器、酶标仪、温箱等。
操作步骤
1.包被羊抗人IgE抗体 （4℃过夜，洗涤）
2.封闭（0.5%的小牛血清或牛血清清蛋白）
3.加样（梯度稀释的IgE校准品、待测血清、阳性对照、 阴性对照、空白对照 ）
果超出此范围，应对样品进行适当的稀释，使样品中IgE的浓度 在线性范围内再行测定。
结果分析
以IgE校准品的参考含量（IU/ml）为横坐标，以对应A 值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测样品的A值，在标准 曲线中查出稀释后样品中IgE的浓度，再乘以稀释倍数，即 为原样品中IgE的浓度。1IU=2.4ng。
第七单元
超敏反应性疾病的免疫学检测
实验一 血清IgE的检测
一、血清总IgE的检测
实验目的
1.掌握ELISA双抗体夹心法测定血清总IgE的方法。 2.熟悉IgE在I型超敏反应中的作用和临床意义。
实验原理
待测抗原
ELISA双抗体夹验材料
1.羊抗人IgE抗体、HRP标记的羊抗人IgE抗体、IgE 校准品、TMB（四甲基联苯胺）。
注意事项
1. 不同批次的组分不可混用，且只能在效期内使用。 2. 检测标本只限于人血清、血浆。 3. 如果样本在3天内检测，可以保存在2~8℃，否则应冷
冻保存，避免反复冻溶。 4. 如果标本含有不溶物，离心去除。溶血、浑浊或含有
叠氮钠的标本不可用。 5. 加样器枪头不可混用，避免交叉污染。
结果分析
实验材料
1. 检测条 包被有特异性过敏原的NC膜 2. 碱性磷酸酶标记的抗人IgE 3. 标本稀释液 4. 碱性磷酸酶底物 5. 浓缩洗液（10X） 洗液按照1:10倍稀释 6. 标本 待测血清用标本稀释液按照1:10倍稀释。
操作步骤
稀释好的洗液将检测条要充分浸透，放在摇床上摇10分钟 倒掉洗液，加入稀释好的测试者血清，放于摇床室温反应1.5小时 倒掉小槽中的血清，依次加入洗液，震荡10分钟，重复三次 每槽加入碱性磷酸酶标记的抗人IgE，放于摇床上室温反应30分钟 将碱性磷酸酶标记的抗人IgE倒掉，用洗液洗三次，每次10分钟 加入碱性磷酸酶底物，放于摇床，避光反应约10分钟 去掉底物溶液，用纯水洗三次，每次5分钟 将检测条放在干燥纸上，等检测条完全干燥后判定检测结果
IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药 物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。上述疾病 时IgE升高的程度并不一致，在过敏性支气管肺曲菌病时最为显著，其值可达5000～ 20000ng/ml，除了此病和特应性皮炎以及在花粉季节之外，任何血清总IgE水平大于 5000ng/ml的患者均应考虑寄生虫感染的可能性。
通过显色区带确定血清中含有哪种sIgE，进而判断 待检者对哪种过敏原过敏。
临床意义
slgE测定是体外检测变应原的重要手段，主要用于Ⅰ 型超敏反应的诊断。该检测条包被有多种特异性过敏原，通 过检测血浆（血清）中过敏原slgE，筛查待检者对何种过敏 原过敏，为临床进行脱敏治疗奠定基础。
小结和讨论
1.人类I型超敏反应可表现为全身性超敏反应和局部性 超敏反应两种。
思考题
1. ELISA双抗体夹心法定量测定血清总IgE的原理及 应注意的问题有哪些？
2. 测定血清总IgE的临床意义？
二、血清特异性IgE的检测
实验目的
1.掌握斑点酶免疫印迹法检测sIgE的原理和方法。 2.熟悉sIgE在I型超敏反应中的作用和临床意义。
实验原理
斑点酶免疫印迹法：用NC膜作为固相支持物，检测区的不同区域 包被有特异性的过敏原，质控区包被有兔抗鼠Ig抗体。检测时将稀释的 病人血清加入反应槽内，血清中的sIgE与NC膜上的相应过敏原结合。 通过洗涤去掉未结合的游离物质，再加入酶标记的抗人IgE抗体，此抗 体会与检测区NC膜上的sIgE结合，同时会与质控区上的兔抗鼠Ig抗体 结合。如标本中无sIgE，酶标抗体不能结合在检测区相应过敏原区带上 。通过洗涤去掉未结合的标记物，然后加入底物显色。通过显色区带确 定血清中含有哪种sIgE，进而判断待检者对哪种过敏原过敏。
4.37℃温育2h，洗涤
EE E E
5.加入工作浓度的HRP标记的羊抗人IgE
6.37℃温育2h，洗涤
7.加入底物，37℃温育15分钟 8.加入终止液，终止反应
9.492nm波长测各孔吸光度值（A值）
注意事项
1.包被抗体量、酶标抗体的加入量等可影响测定结果，需预先摸索最 佳条件。
2.洗涤要彻底，必要时可加大洗涤液的浓度。 3.结果判断须在10分钟内完成。 4.IgE含量与吸光度值在一定范围内呈线性关系，如果样品的测定结
思考题
1. 测定血清sIgE的方法有哪些？各有何优缺点？ 2. 测定血清sIgE的临床意义？
实验二 红细胞表面不完全抗体的检测
一、直接Coombs试验（试管法 ）
实验目的
1.掌握直接Coombs试验的原理和操作方法。 2.熟悉Coombs试验的临床意义。
实验原理
＋
患者红细胞
Coombs试剂
临床意义
血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示，1IU＝2.4ng，相当于WHO标 准冻干血清制剂0.00928mg内所含的IgE量。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、 年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐 带血IgE水平小于0.5IU/ml，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成 人血清IgE水平约在20～200IU/ml之间，一般认为大于333IU/ml（800ng/ml）时为异 常升高。
2.在5类免疫球蛋白中，IgE是血清中含量最低，半衰期 最短，分解率最高，对热最不稳定的Ig。而在I型超 敏反应患者体内，IgE含量显著增高。
3.血清总IgE的含量是由各种抗原IgE的总和决定。正常 人血清IgE含量极微，约0.1～0.9mg/L水平。临床上 一般采用敏感性较高、稳定性较好的化学发光免疫 测定法、酶联免疫测定法进行检测。