微生物碳氮磷测定

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）操作步骤土壤的前处理（过筛和水分调节略）熏蒸称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。

首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。

将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。

另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。

其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。

浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。

熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。

微生物量碳、氮的转换系数为0.45。

土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。

微生物在土壤碳氮磷循环中的功能与调控研究土壤是地球上最重要的生态系统之一，它承载着丰富的生物多样性和庞大的微生物量。

微生物在土壤碳、氮、磷循环中扮演着至关重要的角色。

它们通过多种功能和调控机制参与到这些关键元素的转化和循环过程中。

本文将重点探讨微生物在土壤碳氮磷循环中的功能与调控研究。

1. 微生物在土壤碳循环中的功能与调控1.1 分解有机质土壤微生物通过分解有机质，将有机物转化为无机碳，使之能够被其他微生物和植物利用。

这一过程称为有机质矿化，能够释放大量的二氧化碳。

腐生微生物，如真菌和细菌，是主要的分解者，它们分泌酶类解聚有机物质，并利用产生的碳源维持自身生长和代谢。

1.2 呼吸作用微生物通过呼吸作用将有机碳和无机碳氧化为二氧化碳。

这一过程释放出的二氧化碳可供植物进行光合作用，从而形成碳循环的闭合循环。

微生物呼吸的速率会受到环境因素的影响，如温度、湿度和土壤质地等。

1.3 产生胞外酶微生物分泌的胞外酶能够降解有机质分子，从而提高土壤中的可利用碳。

胞外酶的活性受到土壤理化性质和微生物本身的调控。

2. 微生物在土壤氮循环中的功能与调控2.1 固氮作用一些微生物具有固氮的能力，可以将大气中的氮气转化为可供植物吸收利用的氨或亚硝酸盐。

植物合作菌根真菌和一些自由生活的氮结固菌是主要的固氮微生物。

固氮作用能够提供土壤中的有效氮源，从而促进植物生长和生态系统的氮循环。

2.2 氨化作用微生物通过氨化作用将有机氮转化为氨，这一过程称为氨化。

氨化作用主要由硝化细菌和硝化古菌参与，它们在土壤中将有机氮、氨和亚硝酸盐转化为硝酸盐。

硝酸盐是植物的主要氮源之一，对植物的生长发育具有重要影响。

2.3 反硝化作用反硝化作用是一种微生物呼吸过程，微生物通过反硝化作用将硝酸盐还原为氮气，从而释放出大量的氮气。

反硝化细菌是主要的反硝化微生物，它们在缺氧条件下对硝酸盐进行还原。

反硝化作用在土壤氮循环中起到重要的调控作用，能够减少土壤中的硝酸盐浓度，影响植物对氮营养的吸收。

微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。

之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。

2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。

使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。

上述处理均在通风橱里操作。

3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。

若是气密性不好，使用少些凡士林密封。

步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。

2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。

3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。

4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。

土壤微生物量碳氮磷测定方法一、试剂配制微生物量碳试剂：1 硫酸钾溶液[c(K2SO4)=0.5mol·L-1]：称取硫酸钾（K2SO4，化学纯）87.10g，先溶于300ml去离子水中，加热，转移溶液至容器中，再加少量去离子水溶解余下的部分，转移溶液至同一容器中，如此反复多次。

最后定容至1L；（需大量配制）2 生物量C氧化剂：1.2800g在130℃下烘干两个小时的K2Cr2O7与400mlH2O，2L的优级纯浓硫酸混合，配成2.4L的混合氧化剂溶液，在室温，棕色瓶中保存；3 葡萄糖标准储备液（100mg/L）：准确称取0.2502g的无水葡萄糖溶于1000mL的容量瓶中，存放在4℃冰箱，使用时稀释为所需标准溶液；微生物量氮试剂：4 醋酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50％的氢氧化钠溶液调节pH 至5.2；5 茚三酮试剂：23g分析纯水合茚三酮溶解于750ml二甲基亚砜，加入250ml醋酸锂缓冲液，混合30min，使氧气和氮气排出；（注意此试剂在使用前一天配置，室温下密封保存）6 氢氧化钠溶液（10mol/L）：400g分析纯氢氧化钠溶于去离子水，稀释至1L；7 柠檬酸缓冲液：42.0g分析纯柠檬酸和16.0g氢氧化钠，溶于900ml去离子水，用10mol/L氢氧化钠调节Ph至5.0，再用水稀释至1L；8 乙醇溶液：95%分析纯乙醇与去离子水按体积比1：1比例混合；9 1mg/ml的硫酸铵标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵(称前105℃烘2h)溶于0.5moL/L硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000mL，摇匀，于4℃冰箱中保存。

10 0.1mg/ml的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10mL1mol/L的硫酸铵标准储存液于100mL容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100mL．摇匀。

土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。

配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。

待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。

（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。

（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。

要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。

值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。

（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。

土壤微生物碳、氮测定方法—熏蒸提取法1、提取液的制备：仪器：抽气皿、无醇氯仿，抽气机，大铝盒，分析天平，小三角瓶（50ml）、大塑料瓶（250ml），三角瓶（100ml）。

试剂的制备：无醇氯仿（提取方法：用1N硫酸溶液与氯仿按体积比2：1于分液漏斗中震荡混匀，静置分离，共做三次，再用去离子水代替硫酸与氯仿2：1混匀，震荡分离，共三次，将提纯的放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠保存。

）分析步骤：1、称取相当于干土12.5g的鲜土于大铝盒中，在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，放几张小纸片以便于观察沸腾，放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机，盖上黑布，置于阴暗处（25℃）熏蒸24小时，到时间后，取回小烧杯，后反复抽真空3~5次，排除氯仿。

2、另称取一批同等重量的土放入干燥器中作未熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。

3.将上述步骤中的两批土样转移到大塑料瓶中（此操作应尽快进行）每个瓶内50ml0.5M硫酸钾溶液，盖紧瓶塞，震荡30分钟，取出，用定量滤纸过滤到100ml 大三角瓶中，应立即测定，如果不立即测定，可用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在4℃的冰箱中24小时。

微生物氮的测定—消煮，碱化蒸馏法仪器：定氮仪，烘箱，开氏瓶（50ml），移液管（2，5，25ml），小漏斗，小三角瓶（150ml）试剂的制备：去离子水，浓硫酸（化学纯），硼酸指示剂，10M氢氧化钠（化学纯），硫酸铜溶液。

分析步骤：吸取上述步骤中的过滤液25ml放入到开氏瓶中，加入2ml浓硫酸（固定滤液中的氨），放入到烘箱中在60~70℃烘2~3天，直至瓶内还剩下3ml左右滤液，取出加入3ml浓硫酸和1ml硫酸铜溶液，放上小漏斗在电炉上消煮，消至瓶内颜色呈天蓝色（半小时左右）为止，取下冷却，同时用0.5M硫酸钾溶液25ml 代替滤液做空白。

用去离子水洗净小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml10M氢氧化钠溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接受蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时停止蒸馏，蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道、用1/2硫酸标液（0.01）滴定馏出液，颜色由蓝色刚变成紫红色为终点，记录数据。

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