大学精品课件：实验1 酪蛋白的制备

法 掌握一种检测牛乳质量的方法
实验原理
酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的 80%~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合 80%~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合 蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相 结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不 含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定， 含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定， 利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。 酪蛋白在其等电点时由于静电和为零，同种电荷间的排斥 作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到 pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙 pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙 醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂志除去。
仪器、 仪器、原料和试剂
仪器：温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、电炉、烧杯、 仪器：温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、电炉、烧杯、 量筒、表面皿、天平等 原料：市售牛乳 试剂：95%乙醇和乙醚 试剂：95%乙醇和乙醚 pH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L pH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L 乙醇、乙醚混合液：乙醇：乙醚=1： 乙醇、乙醚混合液：乙醇：乙醚=1：1（体积比）
实验步骤
1、酪蛋白等电点沉淀 将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加入至40℃左右的乙 100mL牛乳放到500mL烧杯中，加入至40℃ 酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸或酸度剂调试。 酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸或酸度剂调试。 将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤， 将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤， 收集沉淀。 2、除脂类杂质 将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30mL95%的 将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30mL95%的 乙醇中。将此悬浮液倾入布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液， 再倒入乙醇再倒入乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后再用乙醚洗 涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿 上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称 重后，计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白质量 重后，计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白质量 （g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求 g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求 出实际获得百分率。

23.. 抽40表橡滤℃面皮装水皿塞置浴）（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管， 利利利离利离利牛利牛利利利利牛利牛 牛利利利用用用心用心用乳用乳用用用用乳用乳乳用用用等 等 等 机 等 机 等 中 等 中 等 等 等 等 中 等 中中 等 等 等电电电，电，电主电主电电电电主电主 主电电电点点点点点要点要点点点点要点要 要点点点天天时时时时时蛋时蛋时时时时蛋时蛋 蛋时时时平平溶溶溶溶溶白溶白溶溶溶溶白溶白 白溶溶溶，，解解解解解质解质解解解解质解质 质解解解滤滤度度度度度是度是度度度度是度是 是度度度纸纸最最最最最酪最酪最最最最酪最酪 酪最最最（（低低低低低蛋低蛋低低低低蛋低蛋蛋低低低ΦΦ原原原原原白原白原原原原白原白 白原原原==99理理理理理，理，理理理理，理， ，理理理ccmm，，，，，含，含，，，，含，含 含，，，））将将将将将量将量将将将将量将量 量将将将，，牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛牛3333355555打打乳乳乳乳乳乳乳乳乳乳乳乳乳乳ggggg孔孔/////LLLLL的的的的的的的的的的的的的的，，，， ，器器pppppppppppppp酪酪酪酪 酪，，HHHHHHHHHHHHHH调调调调调调调调调调调调调调蛋蛋蛋蛋 蛋表表至 至 至 至 至 至 至 至 至 至 至 至 至 至白 白 白 白白面面，，，，，，，，，，，，，，是是是是 是皿皿酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪一一一一 一蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋些些些些 些白白白白白白白白白白白白白白含含含含 含沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉磷磷磷磷 磷淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀蛋蛋蛋蛋 蛋下下下下下下下下下下下下下下白白白白 白来来来来来来来来来来来来来来的的的的 的，，，，，，，，，，，，，，混混混混 混再再再再再再再再再再再再再再合合合合 合用用用用用用用用用用用用用用物物物物 物乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙，，，， ，醇醇醇醇醇醇醇醇醇醇醇醇醇醇pppppIIIII和和和和和和和和和和和和和和为为为为 为乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙乙。。。。 。醚醚醚醚醚醚醚醚醚醚醚醚醚醚洗洗洗洗洗洗洗洗洗洗洗洗洗洗涤涤涤涤涤涤涤涤涤涤涤涤涤涤沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉沉淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀淀除除除除除除除除除除除除除除去去去去去去去去去去去去去去脂脂脂脂脂脂脂脂脂脂脂脂脂脂类类类类类类类类类类类类类类杂杂杂杂杂杂杂杂杂杂杂杂杂杂质质质质质质质质质质质质质质可可可可可可可可可可可可可可得得得得得得得得得得得得得得纯纯纯纯纯纯纯纯纯纯纯纯纯纯的的的的的的的的的的的的的的酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪酪蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋白白白白白白白白白白白白白白。。。。。。。。。。。。。。 4. 通风柜 利用等电点时溶解度最低原理，将牛乳的pH调至，酪蛋白沉淀下来，再用乙醇和乙醚洗涤沉淀除去脂类杂质可得纯的酪蛋白。

用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次，最后用无水乙醚洗沉淀2次，抽干。 用蒸馏水洗沉淀（不要搅散）3次，再次离心，3000r/min，10min，弃上清。
试剂材料
1. 牛奶 （ 40℃预热 ） 2. 95%乙醇 3. 无水乙醚 4. 0.2M pH4.7HAC-NaAC 缓冲液 （ 40℃预热 ） 5. 乙醇-乙醚混合液（V/V=1/1） 从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法
原理
牛乳中主要蛋白质是酪蛋白，含量35g/L， 酪蛋白是一些含磷蛋白的混合物，pI为。 利用等电点时溶解度最低原理，将牛乳的 pH调至，酪蛋白沉淀下来，再用乙醇和乙 醚洗涤沉淀除去脂类杂质可得纯的酪蛋白。
主要器材设备
1. 离心机， 天平，滤纸（Φ=9cm），打孔器， 抽滤装置（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管，橡皮塞）
操作
1. 将牛奶和pH4.7HAC-NaAC 缓冲液预加热至40℃， 2. 用离心管取50mL的牛奶再缓缓加入50mL的pH4.7HAC-NaAC
缓冲液，不时搅拌均匀，将悬浮液冷至室温，离心，3500r/min， 15min，弃上清，得酪蛋白粗制品。 3. 用蒸馏水洗沉淀（不要搅散）3次，再次离心，3000r/min， 10min，弃上清。 4. 在沉淀中加入约20mL95%乙醇，搅拌片刻，将悬浊液全部转移 到布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次，最后用无水 乙醚洗沉淀2次，抽干。 5. 将沉淀摊开在表面皿上，风干（或烘干），得酪蛋白纯品。 6. 称量，计算含量和得率。 含量： 酪蛋白 g/100mL牛乳 （g%） 得率： 测得含量/理论含量×100% （理论含量为 牛乳）
7HAC-NaAC 缓冲液 （ 40℃预热 ）
234... 4通抽0表橡风滤℃面皮装柜水皿塞置浴）（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管， 得7在用抽在 牛77在抽7用 牛用用用抽利7学77学在7得HHHHHHHH率沉乙滤沉乳沉滤乙奶蒸蒸蒸滤用习习沉率AAAAAAAA： 淀 醇 装 淀中 淀 装 醇馏 馏 馏 装 等 从 从 淀 ：CCCCCCCC（--------中-置中 主中置-水水水置电牛牛中NNNNNNNN测测乙乙4aaaaaaaa加（加 要加（洗洗洗（点乳乳加得 得0醚醚AAAAAAAA℃入布入 蛋入布沉沉沉布时中中入CCCCCCCC含含混混预约氏约 白约氏淀淀淀氏溶制制约缓缓缓缓缓缓缓缓量量合合热漏质漏（（（漏解备备2222冲冲冲冲冲冲冲冲//液液0000理理斗是斗不不不斗度酪酪mmmm液液液液液液液液）洗洗论论，酪，要要要，最蛋蛋LLLL， ， ， ， ， ， ， 预沉沉含含9999抽蛋抽搅搅搅抽低白白不不不不不不不加5555淀淀量量滤白滤散散散滤原的的% % % %时时时时时时时热22××瓶，瓶）））瓶理原原次次乙乙 乙乙搅搅搅搅搅搅搅至11，含，，，理理333，，醇醇 醇醇4拌拌拌拌拌拌拌00次次次0圆量圆圆将和和00最最，， ，，均均均均均均均℃，，，% %形形形牛方方3后后搅搅 搅搅匀匀匀匀匀匀匀，5再再再抽抽抽乳法法用用拌拌 拌拌g，，，，，，，次次次/滤滤滤的无无片片 片片将将将将将将将L离离离，管管管p水水刻刻 刻刻悬悬悬悬悬悬悬H心心心酪，，，乙乙，， ，，浮浮浮浮浮浮浮调，，，蛋橡橡橡醚醚将将 将将液液液液液液液至333白皮皮皮洗洗悬悬 悬悬000冷冷冷冷冷冷冷，是000塞塞塞沉沉浊浊 浊浊至至至至至至至酪000一）））淀淀液液 液液rrr室室室室室室室蛋///些mmm22全全 全全温温温温温温温白次次含iii部部 部部，，，，，，，nnn沉，，磷，，，转转 转转离离离离离离离淀抽抽蛋111移移 移移心心心心心心心下000干干白到到 到到mmm，，，，，，，来。。的布布 布布iii3333333，nnn混5555555，，，氏氏 氏氏再0000000合弃弃弃漏漏 漏漏0000000用rrrrrrr物上上上斗斗 斗斗///////乙mmmmmmm，清清清中中 中中醇iiiiiiipnnnnnnn。。。抽抽 抽抽和I，，，，，，，为滤滤 滤滤乙1111111。。。 。。5555555醚mmmmmmm洗iiiiiiinnnnnnn涤，，，，，，，沉弃弃弃弃弃弃弃淀上上上上上上上除清清清清清清清去，，，，，，，脂得得得得得得得类酪酪酪酪酪酪酪杂蛋蛋蛋蛋蛋蛋蛋质白白白白白白白可粗粗粗粗粗粗粗得制制制制制制制纯品品品品品品品的。。。。。。。酪蛋白。

随加随摇，观察实验现象。
[制备酪蛋白+双缩脲溶液（1%CuSO4+酒石酸加纳+1%KOH）=？]
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五、实验结果、计算与分析
结果一：酪蛋白的制备： 1、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白g/10mL
2、酪蛋白得率=测定含量/理论含量×100%
牛乳酪蛋白理论含量为3.5g/100mL
结果二：酪蛋白的溶解度鉴定：
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二、实验原理
1.牛乳中酪蛋白制备 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电 点为4.7-4.8。利用等电点时溶解度最低的原理，将 牛乳的pH调至4.7-4.8时，酪蛋白就沉淀出来。用 乙醇洗涤沉淀物，乙醚除去脂类杂质后便可得到 纯的酪蛋白。
二、实验原理
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1.酪蛋白溶于哪些溶液？
蒸馏水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及 饱和氢氧化钙（表格形式，状态：不溶解，部分溶解，全部溶解）
结果三：酪蛋白的双缩脲反应：
4、酪蛋白的双缩脲反应分析。（颜色描述并分析）
（为何酪蛋白与双缩脲试剂反应呈现紫红色？）
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六、思考题
1、为什么调整溶液的pH值可以将酪蛋白沉淀出来？ 2、氨基酸是否能发生双缩脲反应？为什么？
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四、实验步骤
1、酪蛋白的制备：
（3）往沉淀物中加入5mL蒸馏水，混匀后2000r/min 离心5min， 弃去上清液。
（ 4 ） 将 洗 净 的 沉 淀 物 加 入 3mL无 水 乙 醇 ， 混 匀 后 2000r/min离心5min， 弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。
（5）将沉淀物全部摊开在已称过重的滤纸上，置于 25℃烘箱中烘干。

相关知识点：蛋白的特性与蛋白的分离纯化、 牛乳中的成分、酪蛋白的特性。
ห้องสมุดไป่ตู้

实验重点：利用等电点原理分离牛乳酪蛋白。
分离纯化的一般流程
获得蛋白质溶液
机械、化学方法破细胞壁
分离蛋白或浓缩蛋白
等电点沉淀、盐析 有机溶剂
纯化蛋白
离子交换、凝胶过滤、亲和
纯度鉴定
电泳、毛细管电泳、HPLC
牛乳
等电点（pH）
生物化学实验
2009
生物化学实验规则

实验前必须认真预习实验内容 实验过程中认真按照实验步骤和操作规程进行实验、保持 安静 结束实验做好各自的卫生工作，由指导老师同意，签字之 后方可离开实验室 (公用、个人） 安排值日生（8次） 及时整理实验报告



实验一 牛乳中酪蛋白的制备

实验目的：学习蛋白粗提方法。
乳清蛋白
酪蛋白
溶解性（有机溶剂）
杂蛋白
酪蛋白纯品
（本次实验仅用乙醇）
操作步骤



4ml牛奶 调节pH 加入4mLpH4.7缓冲液，摇匀 离心（一人一支） 水洗涤（4ml、3次、4000rpm、5min） 醇洗涤 （4ml乙醇离心一次、 再加4ml乙醇用玻棒 搅匀，倒入 漏斗中滤干，60℃） 称重，计算（预先称滤纸重量，小数点后两位恒重） 保存样品（2ml离心管，写上学号）
离心机的使用


平衡！ 20位同学一组
SDS-PAGE示意图
电泳分离后，凝胶上的蛋白 质可以被染色（考马斯亮蓝 可以与蛋白质结合）
logMr=K-bX， Mr － 分子量 X － 迁移率 k、b － 常数

（3）加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用 95%乙醇洗涤产品。 （4） 乳糖成脎试验 取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管 中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂，摇匀，试管 口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇， 加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结 晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形 态，可证实为乳糖。 ①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触 及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。（选做） （5）旋光法测定含量（选做） 见资料中nunai
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考 马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在 488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色 素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值 与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测 定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时 间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室 温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立， 试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵 敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量， 测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常 用的微量蛋白质快速测定方法。
4．计算酪蛋白的质量浓度和得 率
准确称量从牛奶中分离出的酷蛋白纯品。 (1)计算酪蛋白实际的质量浓度 实际质量浓度以1L，牛奶中酪蛋白的质 量(g)表示。 (2)计算得率 酪蛋白得率／％＝酪蛋白实际的质量浓度 /酪蛋白的理论质量浓度×100 式中：牛奶中酪蛋白的理论质量浓度为35g/L
5．酪蛋白纯度测定 － 考马斯亮蓝法
1 000µg／mL标准蛋 白液（mL） 蒸馏水（mL）

等电点法 离心分离技术
实验试剂
牛乳 醋酸钠缓冲液0.2M、PH４.8 乙醇（用于除脂） 乙醚（用于脱水）
牛乳4ml
40℃水浴预热10分钟（HAC缓冲液同时预热）用滴管 加入HAC缓冲液约4ml（PH4.8）离心，10000转/分， 5分钟
清液
沉淀
用 4 m l 蒸 馏 水 洗 涤 离 心 ,10 0 0 0 转 / 分,5分钟(除沉淀中可溶物)
清液
沉淀
95%乙醇4ml洗涤离心， 10000转/分，5分钟(除脂)
清液
沉淀
乙醚4ml洗涤离心，10000转/ 分，5分钟(脱水)
清液
沉淀 0.1NNaOH4ml 加 水 至10ml
待测
1. 40℃水浴预热,布朗运动加速蛋白分 子的碰撞。
2.等电点附近蛋白质的溶解度最低， 并不意味着蛋白质会沉淀出来。
3.酪蛋白是酸性，溶解于碱性溶液中， 方便下次双缩脲法测定
注意事项
离心机使用安全说明： 1.离心前配平 2.离心中不能用手触摸机体 3.停止旋转后再取离心管
移液管的正确操作
离心机操作
1.开启离心机电源开关。 2.打开离心机机舱盖。
3.检查离心机转头与离心管的规格是否适 配。
4.平衡离心管及内容物（把装有样品的离 心管放在托盘天平上配平）。
实验一 酪蛋白的制备
目的要求
掌握等电点法分离蛋白质 学习从牛乳制备酪蛋白的原理和
方法
实验原理
酪蛋白是含磷蛋白质的混合物， 牛乳中酪蛋白含量平均为35克/L。
酪蛋白在其等电点时溶解度低， 将牛乳调至PH4.8，酪蛋白可从牛 乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，从酪蛋白粗 制剂中除去脂类杂质。
实验方法

实验步骤
酪蛋白样品的纯化 在沉淀中加入约10ml水，搅拌片刻，离心10min （3000r/min），弃去上清液。 在沉淀中加入约10ml乙醇，搅拌片刻，离心10min （3000r/min），弃去上清液。 在沉淀中加入约10ml乙醇-乙醚，搅拌片刻，离心 10min（3000r/min），弃去上清液。
实验一牛乳中酪蛋白的制备
1、任务背景
酪蛋白是乳蛋白中最丰富的一类蛋白，占乳蛋白的80%~82%。酪蛋 白不是单一蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质，以磷酸酯键与苏氨酸 及丝氨酸的羟基相结合。酪蛋白还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨 基酸，但不含半胱氨酸。酪蛋白在牛乳中的含量约35g/L，比较稳定， 利用这个性质可以检测牛乳中是否掺假。 2、任务目标 ①学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。②掌握等电点沉淀法提取 蛋白质的方法。 3、工作原理 牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳中 约占总蛋白量的3/4，牛乳中约占总蛋白量的5/6。酪蛋白是一种含 磷蛋白的不均一混合物。蛋白质在其等电点pH溶液中溶解度降低。 根据这个原理，将牛乳的pH调整至4.7，即酪蛋白的等电点时，酪蛋 白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的 酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。除去酪蛋白的滤液中，尚含有球蛋 白、清蛋白等多种蛋白质。
实验步骤
鲜奶4℃，离心15min（3000r/mim）,除去上层脂肪； 各组取离心管架、50ml离心管； 取牛奶15ml，置离心管中，在40℃预热5min。 在搅拌下，加入醋酸aOH 或10%醋酸进行调整pH为4.7；
水浴10min，冷却至室温，离心10min（3000r/min）； 弃去上清液，得酪蛋白粗制品。
在沉淀中加入约10ml乙醚，搅拌片刻，将全部的混悬 液转移至布氏漏斗中抽滤。