大量Pichiapastoris酵母基因组DNA的提取

Pichia酵母表达系统使用心得摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。

本文搜集多位用户对Pichia的使用心得和注意事项，值得一看。

生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++RealTime ready 智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点--使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点--酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

酵母的dna提取实验报告
（最新版）
目录
一、实验目的
二、实验材料
三、实验步骤
四、实验结果
五、实验讨论
六、实验结论
正文
一、实验目的
本实验旨在通过提取酵母的 DNA，研究酵母的基因组成，并为后续的基因工程实验提供 DNA 样本。

二、实验材料
1.酵母菌种
2.蒸馏水
3.乙醇
4.氯化钠
5.滤纸
6.蒸馏器
7.离心机
三、实验步骤
1.酵母菌种的准备：选用新鲜的酵母菌种，将其放入蒸馏水中，保持适当的浓度。

2.提取 DNA：将酵母菌种放入离心机中，离心一定时间后，取出上清液。

向上清液中加入适量的氯化钠，使 DNA 逐渐析出。

3.滤过：将析出的 DNA 溶液倒入装有滤纸的漏斗中，通过滤纸将杂质滤除。

4.洗涤：将滤纸放入蒸馏水中，反复洗涤，直至滤纸上的 DNA 纯净。

5.乙醇沉淀：将洗涤后的滤纸放入乙醇中，静置一段时间，DNA 会逐渐沉淀。

6.收集 DNA：将沉淀后的 DNA 收集起来，即为提取的酵母 DNA。

四、实验结果
通过实验，成功提取到了酵母的 DNA，实验结果符合预期。

五、实验讨论
在实验过程中，我们发现在加入氯化钠后，DNA 的析出速度较快，说明氯化钠对 DNA 的析出有一定的促进作用。

此外，通过多次洗涤和乙醇沉淀，我们成功地提取到了纯净的酵母 DNA。

六、实验结论
通过本实验，我们成功地提取了酵母的 DNA，为后续的基因工程实验提供了必要的材料。

1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

一种微波快速提取可用于qPCR 的酵母基因组DNA 的方法孙宇飞1，2，方宇婷1，2，邓冬梅1，2（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室（广西科技大学），广西柳州545006）摘要：研究微波快速提取可用于qPCR 分析的酵母基因组DNA 的方法.在微波作用下分别采取干法和湿法制备酵母基因组DNA 样品提取物与试剂盒法制备的提取物进行比较，通过紫外分光法、琼脂糖凝胶电泳、常规PCR及qPCR 等方法检测提取物浓度与纯度.结果表明微波法提取物可用于常规PCR 分析，其中微波干法提取物用于qPCR 分析可获得准确的检测结果.关键词：微波；qPCR ；基因拷贝数；酵母基因组DNA 中图分类号：Q78；Q503DOI ：10.16375/45-1395/t.2019.02.0110引言毕赤酵母是目前广泛使用的一种重组蛋白表达宿主，具有生长速度快、培养方便、培养基廉价且适合表达真核生物的重组蛋白等优点，已经在科学研究和生产实践中得到广泛应用[1-3].然而在毕赤酵母工程菌株构建过程中，有部分重组子细胞内质粒与基因组DNA 发生多次整合，导致这些重组子携带了多拷贝外源基因.多拷贝外源基因对于毕赤酵母细胞表达外源蛋白具有影响，通常可使外源蛋白表达量增加[4]，但也有部分情况会使外源蛋白表达量降低[5].另外，多拷贝重组子面临遗传稳定性的风险，后代容易发生丢失高量表达的性状，影响工程菌株在工业生产中的应用.而且多拷贝现象也会影响对外源基因在毕赤酵母宿主上表达量的正确评估：如果未进行拷贝数鉴定，将无从判断重组子的高表达量是由于自身表达调控因素引起的还是由于具有多基因拷贝数引起.因此在使用毕赤酵母作为外源蛋白表达宿主的研究中，对重组毕赤酵母菌株基因组DNA 内外源基因拷贝数的鉴定显得非常必要.定量PCR （Quantitative PCR ，qPCR ）方法是一种可准确鉴定核酸样品中目的片段数量的方法，可用于毕赤酵母重组子的外源基因拷贝数鉴定[6-7].然而qPCR 分析对样品纯度有一定要求，而常规高纯度样品制备需要价格昂贵的基因组提取试剂盒.微波法制备分子生物学样品已有较多实例[8-10]，具有简便快捷的特点，但用于qPCR 样品的制备仍未见报道.本文利用微波炉开发了一种简便、廉价的快速制备可用于qPCR 分析的酵母基因组DNA 样品的方法，使毕赤酵母的外源基因拷贝数鉴定时间缩短且费用降低.收稿日期：2019-02-27基金项目：广西高校糖资源加工重点实验室开放课题（2015TZYKF06）；广西科技大学“大学生创新创业训练计划”项目（201710594161）资助.作者简介：孙宇飞，博士，副教授，研究方向：微生物酶工程，E-mail:3893@.第30卷第2期2019年6月广西科技大学学报JOURNAL OF GUANGXI UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Vol.30No.2Jun.2019孙宇飞等：一种微波快速提取可用于qPCR的酵母基因组DNA的方法73第2期1材料与方法1.1菌株、仪器及试剂毕赤酵母（Pichia pastoris GS115）重组菌株KC-5，整合双拷贝外源CALB基因，本实验室构建.Nano⁃drop1000微量核酸蛋白测定仪（Thermo），GeneAmp9700PCR扩增仪（ABI），7500Real-time PCR扩增仪（ABI），凝胶电泳成像系统（BioRad），Media微波炉（额定微波功率700W），Centrifuge5418离心机（Ep⁃pendorf）.Dream Taq PCR试剂盒（Fermentas），DNA Marker（Takara），SYBR Premix EX Taq II qPCR试剂盒（Takara），PCR八联管（Axygen），EZNA Yeast DNA试剂盒（Omega）.YPD培养基（1%Yeast Extract，2%Peptone，2%Dextrose，固体平板加入2%琼脂粉），其余为国产分析纯试剂.1.2微波辅助提取基因组DNA将菌株KC-5在YPD平板上划线培养3d（30o C）.用无菌牙签刮取直径约5mm的单菌落到0.5mL无菌离心管中.1）微波干法：将样品置于微波炉以中低火处理（额定微波功率30%）5min，处理时炉中同时放入盛有50mL水的三角瓶.处理完毕在离心管内加入20μL TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0），手指剧烈弹动离心管1min，4000×g离心1min，上清液即为基因组DNA样品.2）微波湿法：在离心管中先加入20μL TE缓冲液，混匀后再同样微波处理5min.手指剧烈弹动离心管1min，4000×g离心1min，取上清液备用.取2μL样品用微量核酸蛋白测定仪检测.1.3试剂盒法提取基因组DNA在50mL离心管（含5mL YPD液体培养基）中接种KC-5单菌落，摇床培养24h（250r/min，30o C）.将菌液调至OD600=1，取1mL菌液经4000×g离心5min，收集菌体按照EZNA Yeast DNA试剂盒说明书操作提取酵母基因组DNA.用100μL试剂盒自带EB缓冲液洗脱，取2μL样品用微量核酸蛋白测定仪检测.取5μL试剂盒法、微波干法和微波湿法的基因组DNA提取液进行琼脂糖凝胶（1%，m/v）电泳分析.1.4PCR检验基因组DNA取微波法和试剂盒法提取的基因组DNA溶液用TE缓冲液分别稀释至20ng/μL用作模板.配制50μL PCR反应体系扩增1392bp的毕赤酵母his4基因部分片段（GenBank No.U14126.1），反应体系为Dream Taq预混液25μL，ddH2O19μL，P U his4（5´-CAGCATCAGGGAAGTGG-3´）2μL，P D his4（5´-TTG⁃GCAGAAAGAGTTGT-3´）2μL，DNA模板2μL.空白对照组不加DNA模板.扩增程序为94o C预变性5min，接着30个循环的扩增反应（94o C30s，55o C30s，72o C1.5min），最后再72o C延伸7min.取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶（1%，m/v）电泳分析.1.5荧光定量PCR（qPCR）检验基因组DNA将试剂盒法提取的基因组DNA用ddH2O稀释10倍作为模板，配制25μL qPCR反应体系分别扩增CALB基因和参考基因G片段，而微波干法提取的基因组DNA则直接用为模板.首先配制7倍体积的公共溶液（SYBR Premix EX Taq II溶液78μL，ddH2O63μL，ROX Reference Dye II3.1μL，基因组DNA模板6.2μL），混匀后分装两管，每管75μL.其中一管加入引物P RTC1（5´-CCAAACCCATCCTTCTCG-3´）和P RTC2（5´-GGCGTTGACCATGTACTCC-3´）各1.5μL，另一管加入引物P RTG1（5´-GTCGGGACACGCCT⁃GAAACT-3´）和P RTG2（5´-CCACCTTTTGGACCCTATTGAC-3´）各1.5μL，混匀后分别以25μL/管分装到八联管的3个小管中进行扩增.扩增程序为95o C预变性30s，40个循环的扩增反应（95o C变性5s，第30卷广西科技大学学报60o C 延伸34s 同时收集荧光数据）.平行进行3次实验，用参考基因的△C T 法计算CALB 基因拷贝数[11].2结果与分析2.1酵母基因组DNA 紫外吸收检测在波长220~350nm 的紫外光范围内扫描样品DNA 的吸收峰曲线，结果见图1，样品DNA 浓度见表1.3种方法都能够获得具有核酸特征吸收峰（260nm ）的样品，但样品的浓度和纯度差异显著.根据260nm 吸收值计算提取物核酸浓度，试剂盒法提取物的浓度最低，微波干法提取物的浓度最高，微波湿法提取物的浓度居中.这似乎提示微波炉法提取物的核酸含量高、效果好.然而结合260/280及260/230的紫外光吸收比值进行分析，可发现试剂盒法提取物的核酸样品纯度很高（260/280=1.8），而微波法提取物则因含有较多杂质使核酸样品纯度降低.这些杂质（如RNA 、DNA 片段、核苷酸等）的增色效应使微波法提取物260/280值提高，也导致基因组DNA 表观浓度增大.另外胞内释放的碳水化合物、多肽等杂质降低了微波法提取物的260/230值.微波干法和微波湿法提取物中的杂质主要成分也有所区别，总体而言，微波干法提取物中核酸类杂质较多而湿法提取物中碳水化合物、多肽类杂质较多.2.2酵母基因组DNA 电泳为了检验3种方法提取物中基因组DNA 的直观浓度，各取5μL 提取液进行琼脂糖凝胶电泳分析.试剂盒法提取物在图2泳道3中显示具有一条约15kb 大小的较清晰条带，条带弥散少，说明试剂盒法获得的基因组DNA质量较好.而两种微波法的提取物在图2中都没有条带，说明提取物中基因组DNA 实际浓度很低以至于所加样液中基因组DNA 量达不到溴化乙锭染料显色阈值.结合紫外吸收曲线的结果进行分析，说明微波法提取物的真实核酸浓度比试剂盒法提取物浓度（29ng/μL ）低，其表观浓度高应当是样品中杂质增色效应导致.2.3常规PCR 扩增his 4基因为了检验微波炉法提取物是否可用于常M-DNA Marker （DL15000）；1-微波干法提取物；2-微波湿法提取物；3-试剂盒法提取物.图2酵母基因组DNA 电泳图Fig.2Electrophoretogram of the yeast genome DNA samples（a ）试剂盒法提取物（b ）微波干法提取物（c ）微波湿法提取物图1酵母基因组DNA 样品的紫外吸收曲线Fig.1UV Absorbance curve of the yeast genome DNA samples提取物试剂盒法微波干法微波湿法260/2801.802.232.05260/2301.461.150.81浓度/（ng ·μL -1）291553784表1酵母基因组DNA 样品的浓度Tab.1Concentration of the yeast genome DNA samples74第2期孙宇飞等：一种微波快速提取可用于qPCR 的酵母基因组DNA 的方法规PCR 扩增，选取毕赤酵母GS115菌株的his 4基因作为目的基因进行PCR 扩增分析.图3（a ）显示试剂盒法提取物和两种微波法提取物都可用作模板，扩增出大小与预期相符的his 4基因片段（1392bp ）且无明显拖带和弥散现象，说明这3种方法提取的DNA 都可用于常规PCR 扩增反应.然而与试剂盒法提取物相比，微波法提取物的PCR 产物条带较淡，说明其样液中基因组DNA 浓度较小.根据3种提取物表观浓度数据（表1）统一配制成“29”ng/μL 样品溶液并进行PCR 扩增检验（图3（b ）），发现三者仍都能扩增出1392bp 的his 4基因条带，然而各条带的浓淡差异显著，进一步说明微波法提取物的基因组DNA 浓度低于试剂盒法提取物.此外图3（b ）中微波干法提取物的PCR 产物条带最淡，这是因为所用PCR 模板溶液稀释倍数较大（53倍），如用提取物原液为模板，则其PCR 产物条带与微波湿法差异并不显著.总之，微波干法和湿法提取物都能用于常规PCR 扩增，效果并无明显差异.2.4荧光定量PCR （qPCR ）分析因荧光定量PCR 分析对样品的纯度和浓度有一定要求，为了保证分析结果的稳定与准确，使用糖类、多肽等杂质相对较少的微波干法提取物作为PCR 模板进行qPCR 分析，同时以试剂盒法提取物为参照检验两者分析结果的差异.另外为了检验此样品的定量分析效果，选择具有两拷贝CALB 脂肪酶基因的重组毕赤酵母菌株KC-5进行qPCR 分析.实验结果显示，无论是以试剂盒提取的样品（图4（a ））还是微波法提取的样品（图4（b ））作为模板进行qPCR 分析，都获得令人满意的稳定而准确的CALB 拷贝数数据.微波法提取物qPCR 分析结果显示KC-5的CALB 基因拷贝数为1.92（±0.145），而试剂盒提取物qPCR 分析结果显示KC-5的CALB 基因拷贝数为2.01（±0.088）.虽然微波法提取物的CALB 基因C T 值达到26.9，比试剂盒法提取物的CALB 基因C T 值大了8.2，即其提取物中基因组DNA 浓度仅为试剂盒法提取物的2-8.2（0.34%，约（a ）试剂盒法提取物为模板（b ）微波法提取物为模板.CALB 为外源脂肪酶基因，参考基因G 为酵母内源GAPDH 基因片段，Threshold line 设为0.2（图中水平线），每次检测设3个平行.图4KC -5菌株CALB 基因拷贝数的qPCR 检测Fig.4CALB gene copy number of the KC -5strain detected with qPCR test（a ）以提取物原液为模板（b ）以提取物稀释液（“29”ng/μL ）为模板M -DNA Marker （DL2000）；C -空白对照；1，4-试剂盒法提取物；2，5-微波干法提取物；3，6-微波湿法提取物.扩增产物his 4片段长1392bp.图3常规PCR 扩增产物电泳图Fig.3Electrophoretogram of the conventional PCR detection results7576广西科技大学学报第30卷10pg/μL），但这并不影响微波法提取物用于qPCR分析的结果准确性与精确性.3讨论对酵母细胞进行分子生物学分析时首先需要获得其基因组DNA，但结构坚韧的酵母细胞壁给破壁提取基因组DNA及后续PCR检测带来阻碍.如果直接使用酵母菌液或菌苔作为模板进行菌落PCR扩增，细胞破壁的过程主要依靠PCR预变性和变性阶段的热处理，不能保证提取效果使PCR检测的结果不稳定[12].因此酵母细胞的破壁成为酵母菌落PCR的关键.目前常用的破壁方法主要有煮沸法、煮沸冻融法、酶法、超声波法、玻璃珠研磨法、微波法等[12-15].煮沸法设备试剂要求简单，但效果同样不稳定.煮沸冻融法利用高低温差及胞内水分结晶膨胀破壁，效果相对较好但处理时间长、设备贵.酶法采用水解酶类（如蜗牛酶、溶菌酶）温和破壁，对DNA损伤小但处理耗时且破壁不完全.超声波法利用振荡引起的机械剪切力和水力空化效应能较好的达到细胞破壁效果，但对设备的要求高，而且超声处理产生的自由基对核酸等生物分子有损伤.玻璃珠研磨法成本低，但操作过程耗时较长，也有专用玻璃珠振荡破壁仪可快速破壁但成本昂贵.微波法利用微波对酵母细胞内部偶极分子（如液泡中的水分）高频往复运动，产生的内摩擦热而使胞内水分温度升高汽化从而达到胀破细胞壁的目的.该方法破壁快速简便，且只需廉价微波炉即可进行，因此在生物大分子提取中得以应用.有研究报道对长期浸泡于福尔马林的样品采用微波法也能较好的提取DNA，DNA含量可达（2.16±0.95）μg/μL[16].本研究比较了微波辅助的干法和湿法提取效果.微波干法以酵母菌落为处理对象，微波对酵母细胞的作用更直接而强烈，但胞内核酸酶可能会在基因组DNA释放出来时破坏DNA的结构；微波湿法以TE缓冲液悬浮的酵母菌液为处理对象，TE缓冲液可以在基因组DNA释放时抑制胞内核酸酶的作用从而保护DNA，期待获得更完整的基因组DNA分子样品.根据核酸分子在260nm处的特征吸收峰计算核酸浓度是分子生物学常用技术之一.该方法简便快捷，然而对样品的纯度有较高要求.根据样品260/280及260/230数据可定性分析样品中杂质的主要类型.本研究中，微波干法提取物的260/280值偏大，提示杂质主要为RNA、寡核苷酸、核苷酸类产生增色效应的分子.由于微波能够使偶极分子加快振动产生大量热能，因此微波对有极性的DNA分子也有一定作用.微波作用的时间、强度（功率）直接影响到DNA分子的完整性，低强度的微波辐射就能使大鼠DNA损伤[17]，还会降低DNA样品的可扩增性[18].在作用时间相同的情况下，干法提取时微波传递给DNA分子的能量比湿法提取的大，因为湿法加入的TE缓冲液消耗了部分微波的能量.另外微波干法提取过程中胞内核酸酶有可能对DNA分子造成伤害，也会增加样品的紫外吸收.因此干法提取物中DNA的损伤程度应更大，受损的DNA分子由于增色效应导致表观浓度增加.湿法提取物的260/280值较小，但260/230值较大，说明含有较多蛋白、多糖类杂质.其来源应当是高温的TE缓冲液将细胞壁的蛋白和多糖类物质提取出来成为杂质.微波干法和湿法都可提取出酵母基因组DNA，但干法提取物中DNA损失较大而蛋白、多糖杂质较少；湿法提取物中DNA较完整但蛋白、多糖类杂质较多.为了获得高质量的DNA样品，可联合其他技术共同处理.如采用SDS、溶菌酶、剧烈振荡和微波共同作用可对难处理的放线菌细胞进行破壁，提取较为满意的基因组DNA样品[19].使用试剂盒法提取物进行qPCR分析效果好，但是样品平均提取时间长达5h，且需要专用细胞壁破壁仪器及较昂贵的试剂盒.根据核算，试剂盒法每个样品提取成本约需20元，与此相比微波法制备微量基因组DNA样品所耗时间仅10min，仅需准备廉价的微波炉以及几乎可忽略的耗费.因此微波法提取的酵母基因组DNA非常适合用于通过qPCR法大量快速鉴定酵母重组子的基因拷贝数等应用.微波作用形式对提取效果也有影响.孢子具有极坚固的外壁，其DNA的提取难度较高.将炭疽孢子样品放在铝箔膜构成的“蝴蝶结”小穴结构中，微波被引导聚焦到孢子上，20s即可完全提取所有孢子的DNA[20].因此了解微波作用的机制才能更好的开发微波辅助提取基因组DNA的新方法.微波除了可用于辅助提取基因组DNA外还具有其他生物学过程辅助效果，如可帮助加快DNA限制性酶切、连接、活化等酶法操作DNA的过程[21]，只要20~50s处理即可达到标准处理效果，极大地节约了处理时间.随着微波作用机理的不断深入探讨，微波辅助处理生物样品必将获得更广泛的应用.孙宇飞等：一种微波快速提取可用于qPCR的酵母基因组DNA的方法77第2期4结论使用微波干法和微波湿法制备的酵母提取物具有核酸紫外吸收特性，经PCR扩增分析证实其含有酵母基因组DNA，可作为模板用于常规PCR扩增分析.微波干法提取物用于qPCR分析具备一定准确性和精确性，可满足大量筛选酵母重组子基因拷贝数的要求.参考文献[1]AHMAD M，HIRZ M，PICHLER H，et al.Protein expression in Pichia pastoris：recent achievements and perspectives forheterologous protein production[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（12）：5301-5317.[2]LOOSER V，BRUHLMANN B，BUMBAK F，et al.Cultivation strategies to enhance productivity of Pichia pastoris：a review[J].Biotechnology Advances，2015，33（6Pt2）：1177-1193.[3]邓冬梅，潘淑兰，劳振华，等.脂肪酶Lip2在蚕丝表面交联固定及其催化性质[J].广西科技大学学报，2018，29（2）：84-90.[4]雷清，陈勇，刘晓.恶性疟原虫pfs25多拷贝基因在毕赤酵母中的表达分析[J].生物技术，2012，22（3）：23-27.[5]黄义德，吴金芸，徐轶彦，等.人骨形态发生蛋白4多拷贝表达盒的构建及其表达[J].福建师范大学学报（自然科学版），2011，27（6）：66-70.[6]NYBO K.qPCR：single copy targets[J].Biotechniques，2013，54（1）：22-23.[7]FLETCHER SJ.qPCR for quantification of transgene expression and determination of transgene copy number[J].Methods in Mo⁃lecular Biology，2014，1145：213-237.[8]潘力，崔翠，王斌.一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法[J].微生物学通报，2010，37（3）：450-453.[9]ORSINI M，ROMANO-SPICA V.A microwave-based method for nucleic acid isolation from environmental samples[J].Lettersin Applied Microbiology，2001，33：17-20.[10]JOSHI L T，MALI B L，GEDDES C D，et al.Extraction and sensitive detection of toxins A and B from the human pathogenClostridium difficile in40seconds using microwave-accelerated metal-enhanced fluorescence[J].PLoS One，2014，9（8）：e104334.[11]SUN Y F，LIN Y，ZHANG J H，et al.Double Candida antarctica lipase B co-display on Pichia pastoris cell surface based ona self-processing foot-and-mouth disease virus2A peptide[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2012，96（6）：1539-1550.[12]剧海，梁东春，郭刚，等.用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较[J].天津医药，2003，31（5）：270-272.[13]罗中钦，程琳，张茜，等.丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法[J].生物技术通报，2015，31（9）：79-83.[14]王志纯.超声波温育处理提取水稻种子DNA方法探讨[J].福建农林大学学报（自然科学版），2015，44（5）：449-455.[15]REBECKA von P，LARS von P，CHRISTOPHE D，et al.A high-throughput DNA extraction method for barley seed[J].Eu⁃phytica，2003，130（2）：255-260.[16]WU S S，QIAN X，YU X C，et al.Microwave heating of long-term formalin-fixed surgical pathology specimens improves qual⁃ity of extracted DNA[J].Applied immunohistochemistry&molecular morphology，2012，20（5）：512-517.[17]MEGHA K，DESHMUKH P S，BANERJEE B D，et al.Low intensity microwave radiation induced oxidative stress，inflam⁃matory response and DNA damage in rat brain[J].Neurotoxicology，2015，51158-51165.[18]IMAIZUMI K，TANIQUCHI K，OQAWA Y.An evaluation of the effect of microwave irradiation on bone decalcification aimedto DNA extraction[J].LeQ Medical（Tokyo），2013，15（5）：272-277.[19]JIANG Y X，WU J G，YU K Q，et al.Integrated lysis procedures reduce extraction biases of microbial DNA from mangrovesediment[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111（2）：153-157.[20]ASLAN K，PREVITE M J，ZHANG Y X，et al.Extraction and detection of DNA from Bacillus anthracis spores and the vege⁃tative cells within1min[J].Analytical Chemistry，2008，80（11）：4125-4132.[21]DAS R H，AHIRWAR R，KUMAR S，et al.Microwave-mediated enzymatic modifications of DNA[J].Analytical Biochemistry，2015，471：26-28.第30卷广西科技大学学报A rapid yeast genomic DNA extracting method assisted by microwaveusing in qPCR testSUN Yufei 1,2,FANG Yuting 1,2,DENG Dongmei 1,2(1.School of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China;2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources (Guangxi University ofScience and Technology),Liuzhou 545006,China )Abstract:A rapid yeast genomic DNA extracting method assisted by microwave using in qPCR test was studied.The yeast genomic DNA was prepared by the microwave-assisted dry method and the wet method respectively.Then the samples were tested by ultraviolet spectrometry,agarose gel electrophoresis,general PCR amplification and quantitative PCR assay successively,comparing with the sample prepared by a commercial reagent kit.Results show that both extracts from the microwave-assisted dry method and the wet method were able to use for general PCR amplification.Moreover,a considerable accurate and precise result can be achieved when the extract from dry method was used in the qPCR assay.Key words:microwave;quantitative PCR;gene copy number;yeast genomic DNA（责任编辑：黎娅）Simulation study on electronic differential control of low-speedfour-wheel hub electric vehicleWANG Peng,TAO Xiaosong,CHEN Le,WANG Wei(School of Automobile,Chang 'an University,Xi 'an 710000,China)Abstract:Hub motor driven electric vehicle is a pure electric vehicle outstanding representative.The electronic differential control system is one of the basic configuration of hub motor driven electric vehi-cle.In view of the four wheel electric vehicles at low speed,this paper proposes an electronic differen-tial control strategy based on joint speed and slip ratio control.By calculating reference wheel speed Ackermann &jeantand steering model and using the method of logic gate limit value to control the wheel slip ratio,we get the target wheel speed.The "magic formula"tire dynamics model is established to get the optimal slip ratio of the wheel,then Ackermann &jeantand steering model is established,by using the model to calculate the vehicle four wheel turns the reference speed,the electronic differential control system are designed.The simulation results show that the control system can effectively realize the differential steering and makes the wheel slip ratio at the optimal slip ratio.Key words:electric vehicle;hub motor;electron differential velocity;tire model;MATLAB/Simulink simulation（责任编辑：黎娅）（上接第52页）78。

酵母dna提取方法
宝子，今天咱来唠唠酵母DNA提取方法哈。

酵母这小玩意儿可有趣了，它里面的DNA提取也不是啥特别难搞的事儿。

咱先得把酵母细胞给弄破，就像打开一个小宝藏盒子一样。

一种办法呢，是用酶。

那些特殊的酶就像小剪刀一样，把酵母细胞的细胞壁剪开，让里面的东西能跑出来。

这就像是给宝藏盒子找到了一把特制的钥匙。

然后呢，要把细胞里面的蛋白质啥的和DNA分离开。

这就有点像从一堆宝贝里面挑出咱最想要的那一个。

可以用一些化学试剂，这些试剂就像小助手一样，把蛋白质啥的都带走，只留下DNA在那儿乖乖待着。

还有哦，在这个过程中，温度也很重要呢。

就好像酵母DNA是个小宝贝，温度合适的时候它就特别听话。

要是温度不对呀，可能就调皮捣蛋，不好提取了。

一般来说呢，有个合适的温度范围，在这个范围内，整个提取过程就会顺利很多。

提取出来的DNA呢，咱还得好好保存。

就像对待自己心爱的小玩具一样，要放在合适的地方。

一般是放在特定的缓冲液里，这样DNA就能安安稳稳地待着，等着我们去研究它啦。

宝子，酵母DNA提取虽然有点小复杂，但只要按照这些小窍门来，也不是啥超级难的事儿。

就像玩游戏过关一样，一步一步来，总能成功提取到那神秘的酵母DNA 的。

。

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证收稿日期：2009-03-11基金项目：黑龙江省生物菌种资源共享平台建设（KT05A400-1）作者简介：宋庆凤（1983-），女，黑龙江人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

*通讯作者：李杰，副教授，硕士生导师，研究方向为植物分子遗传学与基因工程。

E-mail:lijie_neau@宋庆凤，暴立娟，李杰*（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）摘要：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。

用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。

研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP 启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX ，成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPH α。

并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn 2为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现xyn 2基因在毕赤酵母中的高效表达。

在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU 替换载体上原有的α-Factor 信号肽，结果表明，INU 信号肽能够有效引导XYNII 的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达载体；GAP 启动子；INU 信号肽中图分类号：文献标识码：A文章编号：1005－9369（2009）07－0055－05Construction and probation of neotype secreting expression vectors for Pichia pastoris /SONG Qingfeng,BAO Lijuan,LI Jie （College of Life Sciences,Northeast Agricul-tural Unive rsity,Harbin 150030,China )Abstract:Pichia pastor is is one of the foreign protein expression system which has been widelyused.The expression vectors for Pichia pastoris are varied,but they can not be used in food vocation,because of the need of methanol in expression and the leading-in of antibiotic gene by transformation.This research designed to replace the methanol induced AOX promoter by Pichia pastoris 's constitutional promoter,GAP promoter,and successfully constructed the secreting expression vector pGAPH αfor Pichiapastoris .The gene encoding endo-β-1,4-xylanase from Trichoderma Reesei,and xyn 2gene were used as a reporter gene,and then the function probation indicated that the xyn 2gene could be overexpressed inPichia pastoris .Based on this neotype secreting expression vector pGAPH αⅡ,we replaced the α-Factor by inulase gene's signal peptide sequence which had been optimized in codon,the results showed that the showed gene's signal peptide could also utility guide the secreting expression of xyn 2gene.Key words:Pichia pastoris ;expression vector;GAP promoter;INU signal peptide 随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

毕赤酵母表达实验手册（作参考）部分试剂中英文名称：小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）500*B （0.02%生物素Biotin）、100*H （0.4%Histidine 组氨酸）10*D （20%Dextrose 葡萄糖）、10*M （5%Methanol 甲醇）10*GY （10%Glycerol 甘油）、100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0）Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer）YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）YPD培养基的配制：每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g 250g 1%蛋白栋20g 500g 2%葡萄糖20g 500g 2%※注：配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。

※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基}每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g 68g 0.17% （NH4）2SO4 5g 200g 0.5%葡萄糖20g 800g 2% 注：这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。

完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）：省却成分粉剂 1.3g(见表13.1.1)YNB-AA/AS 1.7g（NH4）2SO4 5g葡萄糖20g*(另外，后3种成分可用27g极限培养预混合物代替)CM省却成分粉剂（CM dropout powder）即所谓的减少成分粉剂（minus powder）或删除成分粉剂（omission powder），它们缺少了表13.1.1中某一种营养成分但含其他营养成分。

酵母基因组DNA 快速提取试剂盒目录号：DN20适用范围：适用于快速提取各种酵母基因组DNA试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成 保存50次 平衡液 室温 5 ml 缓冲液YB 室温20 ml 结合液CB 室温11 ml 抑制物去除液IR 室温25 ml 漂洗液WB 室温15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 15 ml Lytic Enzyme -20℃2.5 ml 蛋白酶K 粉（可选）20mg/ml -20℃20mg 吸附柱AC 室温50个 收集管（2ml ） 室温 50个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:目录编号包装单位 DN200150次 DN2031 50次（带蛋白酶K ，带Lytic Enzyme ）1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状（20mg），收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。

3.Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。

蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。

适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。

约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。

纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。

酵母细胞经lytic Enzyme处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

一种简便高效的酵母基因组提取方法唐巧玲;付鹏飞;王旭静;王志兴【摘要】提取基因组进行检测是酵母研究过程中的必要步骤之一.以毕赤酵母菌株GS115作为研究对象,主要成分为0.2 mol/L醋酸锂和1％ SDS的酵母裂解液能高效的裂解酵母细胞壁.与两种酵母基因组提取试剂盒相比,该方法从相同体积的酵母培养液中获得的基因组的量高5倍以上,并且操作简便、快速,能在2h内完成一次提取过程,极大地缩短了时间.以GS115中的内源AOX基因为目的基因,对提取的基因组进行PCR检测和Southern杂交检测,进一步验证了基因组的质量.因此,本文建立了一种简便、快速、经济而高效的酵母基因提取方法.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2012(002)004【总页数】4页(P293-296)【关键词】酵母;GS115;基因组提取;溶壁酶【作者】唐巧玲;付鹏飞;王旭静;王志兴【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081【正文语种】中文酵母因其遗传背景清楚、操作简便、生长快速等特点,常常作为真核基因表达的模式体系。

此外,酵母还广泛应用于食品生产和基因工程。

在研究过程中,提取酵母基因组进行目的基因的检测是必要步骤之一。

酵母细胞壁厚实坚韧,厚度为0.1～0.3 μm,重量占细胞干重的18%～30%,它的结构类似三明治,外层为甘露聚糖,中间是蛋白质分子层,内层为葡聚糖。

外层的甘露聚糖主链以α-1,6 糖苷键结合,支链以α-1,2 或α-1,3 糖苷键结合,内层的β-葡聚糖主链以β-1,6 糖苷键结合,支链以β-1,3糖苷键结合,形成网状结构,维持细胞壁的强度和韧性[1]。

因此,有效的破除酵母细胞壁是成功提取高质量酵母基因组的关键。

目前,文献报道了多种酵母基因组提取方法,如碱裂解法[2]、反复冻融法[3]、液氮研磨法[4]、超声波破碎法[5]、珠磨法[6]、蜗牛酶法[1]和溶壁酶法[7]等,这些方法利用的原理不同,各有利弊。

Transformation of Pichia pastoris GS115毕赤酵母电转化方法电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。

线性化质粒DNA对Pichia pastoris GS115的转化一、菌体的准备：（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；YPD培养基配方：注意高温灭菌的温度1 L培养基：900 mL水中加入10 g Yeast extract, 20 g peptone，20 g葡萄糖；定容至1L，在115o C条件下灭菌25 min；（2）取100~500μl的培养物接种至含有100ml新鲜培养基的250 mL三角摇瓶中，28~30℃、180 rpm培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；（3）将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用20 mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；（4）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；（5）按步骤3离心，用20 ml的冰预冷的1 M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；（6）按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；（7）备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。

二、电击转化：（8）将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10 μl TE溶液(或灭菌ddH2O)中，加入5μl ssDNA (ssDNA需要在沸水中煮5 min变性，然后迅速转移到冰上，放置5 min 使之成为单链状态)，与80 μl的上述步骤6所得的感受态菌体混匀(轻弹混匀)，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；（9）将电转化杯冰浴5min；（10）电击：电压1.5kV；电容25μF；电阻200－400Ω。

电击时间为10 msec。

（11）电击完毕后，加入1ml 4℃预冷的1M山梨醇溶液将菌体用枪头轻轻混匀，转至1.5ml的EP管中；（12）将菌体悬液涂布于MD平板上，如果菌液浓度高，可涂布两个平板；（13）将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现，大约3－4天。