酵母基因组的提取
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酵母菌基因组DNA的提取实验方法页数:1
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真菌基因组DNA的快速提取页数:1
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细胞基因组DNA的提取.ppt页数:28
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酵母菌表面展示操作步骤之基因重组和构建
酵母菌表面展示操作步骤之基因重组和构建酵母菌表面展示是一种常用的蛋白质表达和展示技术，可以用于各种研究和应用领域。
其中，基因重组和构建是实施酵母菌表面展示的关键步骤之一。
本文将详细介绍酵母菌表面展示操作中的基因重组和构建步骤。
一、基因重组和构建的原理基因重组和构建是指将目标蛋白质的基因序列插入到酵母菌表面展示载体上，使其能够被酵母菌表面展示。
这一步骤包括以下几个关键的操作过程：1. 寻找合适的表达载体：根据目标蛋白质的特性和需要展示的表面酵素活性，选择合适的表达载体。
常用的载体包括pYD1、pCTCON2等。
2. 提取目标基因：从目标蛋白质的源菌中提取基因序列，通过PCR扩增获得目标基因片段。
3. 消化酵母菌表面展示载体：使用限制性内切酶对表达载体进行切割，以产生适当的限制性内切片段。
4. 连接目标基因和载体：将目标基因片段与切割后的载体通过DNA连接酶进行连接。
连接时需确保目标基因与载体之间的方向一致，以便正确表达。
5. 转化酵母菌：将连接好的重组载体转化到酵母菌中，可使用化学转化或电穿孔法。
二、基因重组和构建的操作步骤下面将具体介绍酵母菌表面展示操作中的基因重组和构建步骤：1. 寻找合适的表达载体根据实验需求选择合适的表达载体。
常用的表达载体包括pYD1、pCTCON2等。
根据需要选择合适的酵母菌，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）或表面展示酵母（Pichia pastoris）。
2. 提取目标基因从目标蛋白质的源菌中提取基因序列，可以通过细菌基因组DNA提取试剂盒等常用试剂盒进行提取。
提取后，使用PCR扩增获得目标基因片段。
3. 消化酵母菌表面展示载体将所选择的表达载体进行消化，使用适当的限制性内切酶切割载体。
消化后的载体含有适当的限制性内切片段，以便与目标基因连接。
4. 连接目标基因和载体将目标基因片段与切割后的载体进行连接，可采用DNA连接试剂盒等常用试剂盒进行连接。
酵母基因提取实验报告
一、实验目的1. 学习酵母基因提取的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用CTAB法提取酵母基因组DNA的方法。
3. 熟悉DNA纯化、定量和鉴定等实验技术。
二、实验原理酵母基因提取是通过物理或化学方法将酵母细胞中的DNA与蛋白质、RNA等杂质分离的过程。
CTAB法是一种常用的DNA提取方法，其原理是利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）与DNA的结合能力，以及酚/氯仿等有机溶剂的界面作用，将DNA从细胞中提取出来。
三、实验材料与仪器1. 材料：酵母菌（如酿酒酵母）、Tris-HCl缓冲液、NaCl、CTAB、酚/氯仿、无水乙醇、RNase A、DNA标准品、琼脂糖凝胶电泳系统等。
2. 仪器：高速离心机、恒温培养箱、紫外分光光度计、凝胶成像系统、电泳仪、微波炉等。
四、实验步骤1. 酵母菌培养：将酵母菌接种于YEP培养基中，于28℃恒温培养箱中培养至对数生长期。
2. 酵母菌收集：用无菌吸管吸取适量酵母菌培养液，转移到无菌离心管中，以8000 r/min离心5分钟，弃上清液。
3. 细胞裂解：向离心管中加入适量Tris-HCl缓冲液、NaCl、CTAB、酚/氯仿，混匀后室温放置10分钟。
4. 分相：将上述混合液转移至新的离心管中，以12,000 r/min离心5分钟，弃上清液。
5. DNA纯化：向沉淀中加入适量Tris-HCl缓冲液、酚/氯仿，混匀后室温放置10分钟。
6. 分相：将上述混合液转移至新的离心管中，以12,000 r/min离心5分钟，取上清液。
7. 洗涤：向上清液加入等体积的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟。
8. 离心：以12,000 r/min离心5分钟，弃上清液。
9. 洗涤：向沉淀中加入适量70%乙醇，混匀后室温放置5分钟。
10. 离心：以12,000 r/min离心5分钟，弃上清液。
11. DNA溶解：向沉淀中加入适量TE缓冲液，室温放置5分钟，使DNA溶解。
12. 定量：利用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度。
酵母实验-学生版
酵母系列大实验设计PCR介导的酿酒酵母基因敲除1、实验目的学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因一步敲除法的原理，掌握酵母的转化方法，了解酵母生长及遗传学特性。
2、实验原理酵母菌作为最简单的真核生物，能以单倍体和二倍体两种形式稳定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以自由的在单倍体和二倍体之间进行转换，在生物学研究中有着得天独厚的优势。
首先酵母菌生长速度很快。
对数期生长的单倍体菌株在YPD（富营养天然培养基）90分钟分裂一代，在合成培养基中140分钟分裂一代。
其次，酵母的基因组很小，遗传背景相对简单，是一种很容易进行遗传操作的模式生物。
酿酒酵母的基因组只有12052 Kb,其基因组序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报道，只有不到5%的ORF含有内含子，其中有约5700个蛋白编码基因，分散在16条染色体上。
上世纪90年代末，由数个实验室联合进行的酿酒酵母基因组敲除项目的完成是酵母遗传学研究的里程碑事件。
在这个项目中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌株库、杂合子二倍体菌株库以及非必需基因的纯合子二倍体菌株库。
这个项目几乎完成了全部ORF的敲除，为生物学研究，特别是组学研究，提供了十分强大的系统性研究工具，为后续基因功能的研究奠定了坚实的基础。
此外，酵母作为真核生物，与高等生物在很多代谢通路和蛋白表达调节等方面是高度保守的，为高等生物相关基因，例如疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。
目前，酿酒酵母已经具有一套十分灵活快速的遗传操作体系。
酵母允许外源质粒以独立复制子游离于基因组之外存在，也允许其整合到基因组中。
但跟其他生物相比，酵母比较独特且强大的特点是外源序列的整合依赖于同源重组机制。
之前提到的基因组敲除项目的完成就是依赖于高效率的同源重组，如图-1所示。
人们利用PCR的方法，在筛选标记基因两侧引入待敲除基因（YFG，your favorite gene）特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源重组的作用下，一些细胞的对应基因位点的内源性序列被含有同源臂的外源序列直接取代，并通过选择培养基筛选出来。
酵母文库构建原理
酵母文库构建原理
酵母文库构建原理是指利用酵母作为表达载体构建基因文库的方法。
酵母文库是由数百万个基因克隆所组成的DNA资源库，可以用来研究基因功能、蛋白质相互作用等生物学问题。
酵母文库的构建过程包括以下几个步骤：
1. 酵母基因组DNA的提取和片段化：从酵母细胞中提取总DNA 并用限制酶酶切，获得大小为数千到数万碱基对的DNA片段。
2. DNA片段的连接到载体上：将上述DNA片段与载体（如质粒或噬菌体）上的兼容酶切位点配对后用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子。
3. 重组DNA分子的转化到酵母细胞中：将上述重组DNA分子转化到酵母细胞中，使其在细胞内复制并表达。
4. 筛选目标基因：通过筛选、鉴定，找到目标基因的克隆，进而研究其功能和调节机制。
总之，酵母文库构建原理充分利用了酵母细胞在基因工程中的独特优势，为研究基因功能、蛋白质相互作用等提供了有效的手段。
- 1 -。
酵母基因组DNA快速提取试剂盒
产品简介
本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，用于 提取酵母细胞中的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新 型材料，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合 物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。
使用本试剂盒回收的 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、构 建、Southern 杂交等实验。
10. 向吸附柱中加入 500 µl 漂洗液 W2，12,000 rpm(~13,400×g )离心 30 秒， 倒掉废液。
11. 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2 分钟，倒掉废液。将 吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留 会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
12. 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 µl 洗脱缓冲液 TE，室温放置 2-5 分钟，12,000 rpm(~13,400×g )离心 2 分钟， 将溶液收集到离心管中。 注意：为增加基因组 DNA 的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室 温放置 2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g )离心 2 分钟。 洗脱缓冲液体积不应少于 50 µl，体积过小影响回收效率。 洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内(可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围)，pH 值低于 7.0 会降 低洗脱效率；且 DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。
操作步骤：
使用前请先在漂洗液 W2 中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 取酵母细胞（最多不超过 5×107cells），12,000 rpm(~13,400×g )离心 1 分钟，
本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，用于 提取酵母细胞中的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新 型材料，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合 物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。
使用本试剂盒回收的 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、构 建、Southern 杂交等实验。
10. 向吸附柱中加入 500 µl 漂洗液 W2，12,000 rpm(~13,400×g )离心 30 秒， 倒掉废液。
11. 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心 2 分钟，倒掉废液。将 吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留 会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
12. 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 µl 洗脱缓冲液 TE，室温放置 2-5 分钟，12,000 rpm(~13,400×g )离心 2 分钟， 将溶液收集到离心管中。 注意：为增加基因组 DNA 的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室 温放置 2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g )离心 2 分钟。 洗脱缓冲液体积不应少于 50 µl，体积过小影响回收效率。 洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内(可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围)，pH 值低于 7.0 会降 低洗脱效率；且 DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。
操作步骤：
使用前请先在漂洗液 W2 中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 取酵母细胞（最多不超过 5×107cells），12,000 rpm(~13,400×g )离心 1 分钟，
重组法酵母转基因的操作流程
重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。
一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。
-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。
-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。
-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。
-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。
2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。
-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。
-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。
-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。
3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。
酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。
-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。
-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。
-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。
-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。
-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。
-电泳过程中伴有导入液的减量。
结束电泳时，针尾切割成小片。
-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。
-调整酵母细胞浓度。
-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。
-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。
-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。
-回收转化后的酵母菌体并进行培养。
4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。
-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。
-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。
-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。
酵母基因组的提取
［１２］ ＳＡＭＡＲＺＩＪＡ Ｄ， ＳＩＫＯＲＡ Ｓ， ＲＥＤＺＥＰＯＶＩＣ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃ ｒｅｍｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｒｔｉｓａｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ， ２００２， １５７： １３－１７．
［６］ ＢＡＳＡＲＡＮ Ｐ， ＢＡＳＡＲＡＮ Ｎ， ＣＡＫＩＲ Ｉ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ＰＣＲ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００１， ４２： ４５－４８．
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ
ＸＩＮＧ Ｆｕ－ｇｕｏ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｐｅｉ－ｊｕｎ１，ＴＡＮ Ｘｕｎ－ｇａｎｇ１，ＸＵ Ｙｏｎｇ－ｌｉ１ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｃｅａｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０７１， Ｃｈｉｎａ；
从图1可以看出用本文所提供的方法所提取的酵母基因组与用试剂盒所提取的酵母基因组分子大小是一样的而用本文所提供的方法提取的酵母基因组的条带比用试剂盒所提取的酵母基因组的条带要亮很多说明用本文的方法提取的酵母基因组的量比用试剂盒提取的量大
210 2007, Vol. 28, No. 03
食品科学
※生物工程
［８］ ＧＡＲＤＥ Ｓ， ＢＡＢＩＮ Ｍ， ＧＡＹＡ Ｐ． ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｃｍＡ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９（５）： ５１５１－５１５３．
［６］ ＢＡＳＡＲＡＮ Ｐ， ＢＡＳＡＲＡＮ Ｎ， ＣＡＫＩＲ Ｉ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ＰＣＲ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００１， ４２： ４５－４８．
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ
ＸＩＮＧ Ｆｕ－ｇｕｏ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｐｅｉ－ｊｕｎ１，ＴＡＮ Ｘｕｎ－ｇａｎｇ１，ＸＵ Ｙｏｎｇ－ｌｉ１ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｃｅａｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０７１， Ｃｈｉｎａ；
从图1可以看出用本文所提供的方法所提取的酵母基因组与用试剂盒所提取的酵母基因组分子大小是一样的而用本文所提供的方法提取的酵母基因组的条带比用试剂盒所提取的酵母基因组的条带要亮很多说明用本文的方法提取的酵母基因组的量比用试剂盒提取的量大
210 2007, Vol. 28, No. 03
食品科学
※生物工程
［８］ ＧＡＲＤＥ Ｓ， ＢＡＢＩＮ Ｍ， ＧＡＹＡ Ｐ． ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｃｍＡ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９（５）： ５１５１－５１５３．
重组法酵母转基因的原理与操作流程
重组法酵母转基因的原理与操作流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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毕赤酵母的基因表达及其初步纯化
毕赤氏酵母作为表达载体的优点
1、表达效率高，遗传稳定性好 2、结构简单，表达调控机理比较清楚 3、有Pr加工系统 4、培养简单，成本低廉 5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的
分泌却很少，利于下游的纯化 （毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达
系统。）
一、实验材料
• DH5α、pPICZαA 、GS115、TOP10、， pQE4Aβ15
• 离心收集沉淀，取适量沉淀进行12% SDSPAGE 分析。
• 并用Band Scan 软件进行蛋白质纯度分析.
蛋白质的分离纯化方法
——Alade
四种分离纯化方法
• 1、根据分子大小不同进行分离纯化 • 2 、根据溶解度不同进行分离纯化 • 3 、根据电荷不同进行分离纯化 • 4 、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
• TBST 洗涤 5 次，H来自P-DAB 底物显色试剂 盒显色.
Western Blot 原理 a
• Western Blot与Southern印迹杂交或 Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测 物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。
Western Blot操作步骤
• 1、蛋白样品制备 • 2、蛋白含量的测定 • 3、SDS－PAGE电泳 • 4、转膜 • 5、免疫反应 • 6、化学发光，显影，定影 • 7、凝胶图象分析
6、重组蛋白的鉴定与分析
6.2 质谱分析
• 从考染（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检 测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白 带， 进行基质辅助激光解吸附电离飞行时 间质谱分析.
• 挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、 甘油、生物素……）的培养基上摇床培养
1、表达效率高，遗传稳定性好 2、结构简单，表达调控机理比较清楚 3、有Pr加工系统 4、培养简单，成本低廉 5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的
分泌却很少，利于下游的纯化 （毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达
系统。）
一、实验材料
• DH5α、pPICZαA 、GS115、TOP10、， pQE4Aβ15
• 离心收集沉淀，取适量沉淀进行12% SDSPAGE 分析。
• 并用Band Scan 软件进行蛋白质纯度分析.
蛋白质的分离纯化方法
——Alade
四种分离纯化方法
• 1、根据分子大小不同进行分离纯化 • 2 、根据溶解度不同进行分离纯化 • 3 、根据电荷不同进行分离纯化 • 4 、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
• TBST 洗涤 5 次，H来自P-DAB 底物显色试剂 盒显色.
Western Blot 原理 a
• Western Blot与Southern印迹杂交或 Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测 物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。
Western Blot操作步骤
• 1、蛋白样品制备 • 2、蛋白含量的测定 • 3、SDS－PAGE电泳 • 4、转膜 • 5、免疫反应 • 6、化学发光，显影，定影 • 7、凝胶图象分析
6、重组蛋白的鉴定与分析
6.2 质谱分析
• 从考染（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检 测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白 带， 进行基质辅助激光解吸附电离飞行时 间质谱分析.
• 挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、 甘油、生物素……）的培养基上摇床培养
酵母单杂交实验dna载体构建流程
酵母单杂交实验DNA载体构建流程1.引言酵母单杂交实验是一种常用的研究基因互作或蛋白相互作用的方法。
在酵母单杂交实验中，需要构建适合该实验的DN A载体。
本文将详细介绍酵母单杂交实验DN A载体的构建流程。
2.实验原理在酵母单杂交实验中，需要构建包含目标基因的D NA载体。
DN A载体的构建通常由以下几个步骤组成：2.1D N A提取首先，从参与实验的酵母菌株中提取D NA。
可以使用商业D NA提取试剂盒或自制D NA提取方法。
确保提取的D NA质量和纯度满足实验要求。
2.2扩增目标基因利用聚合酶链反应（P C R）方法，从酵母菌株的基因组DN A中扩增目标基因。
设计合适的引物，使扩增出的目标基因片段与DN A载体连接所需的限制性内切酶切位点相匹配。
2.3D N A片段连接将扩增出的目标基因片段与适当的DN A载体进行连接。
使用限制性内切酶切割目标基因片段和DN A载体，使它们产生互补的粘性末端，在适当的缓冲液中对其进行连接。
使用DN A连接酶催化连接反应，形成目标基因片段与D NA载体的连接产物。
2.4转化酵母菌将连接产物转化到酵母菌中。
通过电击法或化学法将连接产物导入酵母菌细胞中。
待酵母菌细胞经过恢复和选择后，转化出的菌落中将含有目标基因的DN A载体。
2.5验证构建成功进行酵母单杂交实验前，需要对构建的DN A载体进行验证。
可以通过限制性内切酶切、PC R扩增、测序等方法验证目标基因的正确连接和插入。
3.实验步骤根据上述原理，下面给出酵母单杂交实验D NA载体构建的详细步骤：3.1D N A提取-从酵母菌培养物中收集菌落。
-使用D NA提取试剂盒或自制方法提取DN A。
-检测D NA的质量和纯度，确保满足实验要求。
3.2目标基因扩增-根据目标基因序列设计引物。
-进行P CR反应，扩增目标基因片段。
3.3D N A片段连接-利用限制性内切酶切割扩增出的目标基因片段和DN A载体。
-在相关缓冲液中进行D NA片段连接反应。
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［１１］ ＲＯＳＳＥＴＴＩ Ｌ， ＧＩＲＡＦＦＡ Ｇ． Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｉｒｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｍ１３－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ， ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｄａｔａｂａｓｅｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００５， ６３： １３５－１４４．
［９］ ＢＬＡＩＯＴＴＡ Ｇ， ＰＥＰＥ Ｏ， ＭＡＵＲＩＥＬＬＯ Ｇ． １６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ， Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ２５： ５２０－５２７．
［２］ ＭＡＳＡＲＵ Ｎ， ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ Ｍ， ＯＫＡＭＯＴＯ Ｔ． Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｂｏｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆＬ ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ６８： ２２０９－２２１３．
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８０４Ｒ台式离心机 德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公 司；ｖｏｒｔｅｘ ｖ１ ｐｌｕｓ 振荡器 ＢｉｏＳａｎ 公司；恒温摇床 ＺＨＷＹ－１００Ｂ 上海智诚公司；凝胶成像仪 美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ 公司。 １．２ 酵母基因组的提取方法
接种酵母到 ２．５ｍｌ 酵母试管培养基中（ＹＰＤ 培养基）， ３０℃，培养 １６～１８ｈ；取 １．５ｍｌ 酵母培养液，室温下， １５００ × ｇ 离心 ５～１０ｍｉｎ 收集菌体；菌体用灭菌水洗 １ 次， １５００ × ｇ离心 ５ｍｉｎ；菌体用 ２００μｌ ＳＣＥＤ（１ｍｏｌ／Ｌ 山梨醇、 １０ｍｍｏｌ／Ｌ 柠檬酸钠、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ 二硫苏糖醇）溶液重悬，加入 ３ ０μｌ １ ０ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 溶菌酶 （Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）３７℃温浴 １ｈ；加入 １００μｌ ２％ＳＤＳ 混匀，－ ２０℃ 冰冻，然后室温震荡溶解，反复 ３ 次；向悬浮液中加 入１５０μｌ ５ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ（ｐＨ ８．９）轻轻混匀，然后１００００ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ；将上清转移到一新的 １．５ｍｌ 离心管中，加入 ２ 倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置 ５ｍｉｎ 后 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ；除去上清，将沉淀溶解在３００μｌ ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０） 中，加入 ６μｌ ＲＮａｓｅ （１０ｍｇ／ｍｌ），３７℃温浴 ３０ｍｉｎ；加入饱和酚和 氯仿各 １５０μｌ 充分混匀，然后 １００００ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ；转 移上清到新的１．５ｍｌ 离心管中，加入１／２体积的 ７．５ｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ７．５）和等体积的异丙醇，－ ２０℃放置 ２０ｍｉｎ 后 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ；除去上清，加入 ３００μｌ ７０％ 乙 醇漂洗沉淀一次，１００００ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ；风干除去乙 醇，用 ２ ０μｌ Ｔ Ｅ 溶解酵母 Ｄ Ｎ Ａ。
※生物工程
食品科学
2007, Vol. 28, No. 03 211
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｙｅａｓｔ；ｔｏｔａｌ ＤＮＡ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ 中图分类号：Ｑ７８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０３－０２１０－０３
［１２］ ＳＡＭＡＲＺＩＪＡ Ｄ， ＳＩＫＯＲＡ Ｓ， ＲＥＤＺＥＰＯＶＩＣ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃ ｒｅｍｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｒｔｉｓａｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ， ２００２， １５７： １３－１７．
［８］ ＧＡＲＤＥ Ｓ， ＢＡＢＩＮ Ｍ， ＧＡＹＡ Ｐ． ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｃｍＡ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９（５）： ５１５１－５１５３．
［３］ ＣＨＡＶＥＳ Ａ Ｃ Ｓ Ｄ， ＦＥＲＮＡＮＤＥＺ Ｍ， ＬＥＲＡＹＥＲ Ａ Ｌ Ｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ６８： ５６５６－５６６２．
［１３］ ＱＵＥＮＥＥ Ｐ， ＬＥＰＡＧＥ Ｅ， ＫＩＭ Ｗ Ｓ． Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， ２００５， ２４８： １０１－１０９．
参考文献：
［１］ ＷＡＲＤ Ｌ Ｊ， ＢＲＯＷＮ Ｊ Ｃ， ＤＡＶＥＹ Ｇ Ｐ． Ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １９９８， １６６（１）： １５－２０．
１ 材料与方法
１．１ 材料和仪器 溶菌酶（分析纯） 美国Ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｓ饱和酚 北
京 鼎 国 公 司 ； 乙 醇 （ 分 析 纯 ） 青 岛 化 工 公 司 ； 异 丙 醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氯仿（分析 纯） 国药集团化学试剂有限公司；ＳＤＳ（分析纯） 美国 Ｓｉｇｍａ 公司。
［７］ ＢＲＩＧＩＤＩ Ｐ， ＳＷＥＮＮＥＮ Ｅ， ＶＩＴＡＬＩ Ｂ． ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎ ｆｅｃｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｏｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｙｏｇｕｒｔ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００３， ８１： ２０３－２０９．
210 2007, Vol. 28, No. 03
食品科学
※生物工程
酵母基因组的提取
ห้องสมุดไป่ตู้
邢福国 １ ， ２，张培军 １ ，谭训刚 １ ，徐永立 １
（１．中国科学院海洋研究所，山东 青岛 ２６６０７１；２．中国科学院研究生院，北京 １０００４９）
摘 要：酵母是低等真核生物，被广泛应用于食品生产和基因工程。提取酵母基因组对于应用酵母进行实验研究 非常重要，本文摸索出了一套简单、经济、高效的酵母基因组的提取方法，为进行酵母研究提供方便。 关键词：酵母；基因组；提取
［４］ ＤＵＢＯＣ Ｐ， ＭＯＬＬＥＴ Ｂ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｉｒｙ ｉｎｄｕｓｔｒｙ［Ｊ］． Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ， ２００１（１１）： ７５９－７６８．
［５］ ＭＣＣＡＲＴＮＥＹ Ａ Ｌ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｕｔ ｆｌｏｒａ［Ｊ］． Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ， ２００２， ８８： ２９－３７．
［１０］ ＰＲＯＤＥＡＬＯＶＡ Ｊ， ＳＰＡＮＯＶＡ Ａ， ＲＩＴＴＩＣＨ Ｂ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ， ｒｅｐ－ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＰＤ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ［Ｊ］． Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００５， ５０： １５０－１５４．
收稿日期：２００６－０１－３０ 作者简介：邢福国（ １ ９ ７ ９ － ） ，男，博士研究生，主要从事分子发育生物方面的研究。
株菌鉴定到了菌株的水平。如果选择足够多的代谢酶为 靶标，据此设计足够多的 Ｐ Ｃ Ｒ 引物，并尽可能降低引 物的长度，也可能将细菌鉴定到菌株的水平。如果在 此研究的基础上，进一步采用多重巢氏 ＰＣＲ 等技术，可 能建立乳酸球菌菌株水平的快速鉴定技术。同时，这 对其他乳酸菌的分类鉴定也有一定的借鉴意义。
２．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｙｅａｓｔ ｉｓ Ａｒｃｈａｉｃ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｉｔ ｉｓ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｏｏｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｉｓ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｏｎ ｙｅａｓｔ ＤＮＡ ｉｓｄａｔｉｏｎ．
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ
［９］ ＢＬＡＩＯＴＴＡ Ｇ， ＰＥＰＥ Ｏ， ＭＡＵＲＩＥＬＬＯ Ｇ． １６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｒｖｉｅａｅ， Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ２５： ５２０－５２７．
［２］ ＭＡＳＡＲＵ Ｎ， ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ Ｍ， ＯＫＡＭＯＴＯ Ｔ． Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｂｏｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆＬ ａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ６８： ２２０９－２２１３．
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８０４Ｒ台式离心机 德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公 司；ｖｏｒｔｅｘ ｖ１ ｐｌｕｓ 振荡器 ＢｉｏＳａｎ 公司；恒温摇床 ＺＨＷＹ－１００Ｂ 上海智诚公司；凝胶成像仪 美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ 公司。 １．２ 酵母基因组的提取方法
接种酵母到 ２．５ｍｌ 酵母试管培养基中（ＹＰＤ 培养基）， ３０℃，培养 １６～１８ｈ；取 １．５ｍｌ 酵母培养液，室温下， １５００ × ｇ 离心 ５～１０ｍｉｎ 收集菌体；菌体用灭菌水洗 １ 次， １５００ × ｇ离心 ５ｍｉｎ；菌体用 ２００μｌ ＳＣＥＤ（１ｍｏｌ／Ｌ 山梨醇、 １０ｍｍｏｌ／Ｌ 柠檬酸钠、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ 二硫苏糖醇）溶液重悬，加入 ３ ０μｌ １ ０ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 溶菌酶 （Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）３７℃温浴 １ｈ；加入 １００μｌ ２％ＳＤＳ 混匀，－ ２０℃ 冰冻，然后室温震荡溶解，反复 ３ 次；向悬浮液中加 入１５０μｌ ５ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ（ｐＨ ８．９）轻轻混匀，然后１００００ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ；将上清转移到一新的 １．５ｍｌ 离心管中，加入 ２ 倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置 ５ｍｉｎ 后 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ；除去上清，将沉淀溶解在３００μｌ ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０） 中，加入 ６μｌ ＲＮａｓｅ （１０ｍｇ／ｍｌ），３７℃温浴 ３０ｍｉｎ；加入饱和酚和 氯仿各 １５０μｌ 充分混匀，然后 １００００ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ；转 移上清到新的１．５ｍｌ 离心管中，加入１／２体积的 ７．５ｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ａｃ（ｐＨ７．５）和等体积的异丙醇，－ ２０℃放置 ２０ｍｉｎ 后 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ；除去上清，加入 ３００μｌ ７０％ 乙 醇漂洗沉淀一次，１００００ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ；风干除去乙 醇，用 ２ ０μｌ Ｔ Ｅ 溶解酵母 Ｄ Ｎ Ａ。
※生物工程
食品科学
2007, Vol. 28, No. 03 211
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｙｅａｓｔ；ｔｏｔａｌ ＤＮＡ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ 中图分类号：Ｑ７８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０３－０２１０－０３
［１２］ ＳＡＭＡＲＺＩＪＡ Ｄ， ＳＩＫＯＲＡ Ｓ， ＲＥＤＺＥＰＯＶＩＣ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃ ｒｅｍｏｒｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｒｔｉｓａｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｓ， ２００２， １５７： １３－１７．
［８］ ＧＡＲＤＥ Ｓ， ＢＡＢＩＮ Ｍ， ＧＡＹＡ Ｐ． ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｃｍＡ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９９（５）： ５１５１－５１５３．
［３］ ＣＨＡＶＥＳ Ａ Ｃ Ｓ Ｄ， ＦＥＲＮＡＮＤＥＺ Ｍ， ＬＥＲＡＹＥＲ Ａ Ｌ Ｓ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ６８： ５６５６－５６６２．
［１３］ ＱＵＥＮＥＥ Ｐ， ＬＥＰＡＧＥ Ｅ， ＫＩＭ Ｗ Ｓ． Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｓ ａ ｔｏｏｌ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， ２００５， ２４８： １０１－１０９．
参考文献：
［１］ ＷＡＲＤ Ｌ Ｊ， ＢＲＯＷＮ Ｊ Ｃ， ＤＡＶＥＹ Ｇ Ｐ． Ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ ｃｒｅｍｏｒｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １９９８， １６６（１）： １５－２０．
１ 材料与方法
１．１ 材料和仪器 溶菌酶（分析纯） 美国Ｓｉｇｍａ公司；Ｔｒｉｓ饱和酚 北
京 鼎 国 公 司 ； 乙 醇 （ 分 析 纯 ） 青 岛 化 工 公 司 ； 异 丙 醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；氯仿（分析 纯） 国药集团化学试剂有限公司；ＳＤＳ（分析纯） 美国 Ｓｉｇｍａ 公司。
［７］ ＢＲＩＧＩＤＩ Ｐ， ＳＷＥＮＮＥＮ Ｅ， ＶＩＴＡＬＩ Ｂ． ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎ ｆｅｃｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｏｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｙｏｇｕｒｔ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００３， ８１： ２０３－２０９．
210 2007, Vol. 28, No. 03
食品科学
※生物工程
酵母基因组的提取
ห้องสมุดไป่ตู้
邢福国 １ ， ２，张培军 １ ，谭训刚 １ ，徐永立 １
（１．中国科学院海洋研究所，山东 青岛 ２６６０７１；２．中国科学院研究生院，北京 １０００４９）
摘 要：酵母是低等真核生物，被广泛应用于食品生产和基因工程。提取酵母基因组对于应用酵母进行实验研究 非常重要，本文摸索出了一套简单、经济、高效的酵母基因组的提取方法，为进行酵母研究提供方便。 关键词：酵母；基因组；提取
［４］ ＤＵＢＯＣ Ｐ， ＭＯＬＬＥＴ Ｂ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄａｉｒｙ ｉｎｄｕｓｔｒｙ［Ｊ］． Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ， ２００１（１１）： ７５９－７６８．
［５］ ＭＣＣＡＲＴＮＥＹ Ａ Ｌ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｕｔ ｆｌｏｒａ［Ｊ］． Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ， ２００２， ８８： ２９－３７．
［１０］ ＰＲＯＤＥＡＬＯＶＡ Ｊ， ＳＰＡＮＯＶＡ Ａ， ＲＩＴＴＩＣＨ Ｂ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ， ｒｅｐ－ＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＰＤ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｔｒａｉｎｓ ［Ｊ］． Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００５， ５０： １５０－１５４．
收稿日期：２００６－０１－３０ 作者简介：邢福国（ １ ９ ７ ９ － ） ，男，博士研究生，主要从事分子发育生物方面的研究。
株菌鉴定到了菌株的水平。如果选择足够多的代谢酶为 靶标，据此设计足够多的 Ｐ Ｃ Ｒ 引物，并尽可能降低引 物的长度，也可能将细菌鉴定到菌株的水平。如果在 此研究的基础上，进一步采用多重巢氏 ＰＣＲ 等技术，可 能建立乳酸球菌菌株水平的快速鉴定技术。同时，这 对其他乳酸菌的分类鉴定也有一定的借鉴意义。
２．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｙｅａｓｔ ｉｓ Ａｒｃｈａｉｃ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｉｔ ｉｓ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｏｏｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｉｓ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｏｎ ｙｅａｓｔ ＤＮＡ ｉｓｄａｔｉｏｎ．
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ