血涂片和骨髓片的制备和瑞氏染色

实验四血涂片的制备与染色【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。

【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。

用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。

细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。

【器材】1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。

2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm 宽度的推片。

3．吸耳球。

4．显微镜。

5．酒精灯或Bunsen灯。

6．采血针。

7．注射器和针头。

【试剂】1．瑞氏（Wright）染液（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。

将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。

再加15ml甘油密闭保存。

（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。

配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。

如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。

2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。

将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。

3．瑞-吉复合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。

血涂片的制备及染色摘要血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。

本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。

虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。

本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。

关键词：血涂片制备，染色前言血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。

虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。

本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室血细胞计数板的指导方针。

本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。

显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。

列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。

发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。

这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。

为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。

血涂片制备载玻片载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。

典型玻片为75×25mm，约有1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。

荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。

最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。

这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。

在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。

载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。

清洁液（洗液）重铬酸钾（工业品纯）300g浓硫酸（工业品纯）300ml自来水3000ml实际上重铬酸钾、硫酸和自来水之比为1：1:10。

先将重铬酸钾溶于水，如加热须待冷后，再缓慢加入浓硫酸，边加边搅。

不准将水倒入浓硫酸内！！！另外，清洁液只能用于玻璃仪器的清洗，不能浸泡金属器械。

血涂片的制备：1、载玻片及盖玻片泡酸时间大于24小时，一张一张放，保证每一张都浸湿2、冲洗，先用自来水冲净至没有颜色，再用流水冲洗一夜3、放在95%的酒精中浸泡过夜4、取出后用棉布擦干，涂片，并用甲醇固定，竖直干燥。

Wright染色法制作血涂片1、取涂好的血片，用玻璃笔划出染色区，以防染液滴落后溢流。

2、将涂片平放桌上或者架上，滴加Wright染液至恰好布满所划范围的血膜，混动使混匀，染色约3分钟。

Wright染液配法:Wright粉剂0.1g，加甲醇60毫升。

将Wright粉剂放在乳钵内，充分研磨，越细越好。

然后取甲醇逐步加入乳钵内，边加边研磨，直至染料全部溶解，置试剂瓶中密封，以后走后可用，以放置一个月后再用最佳。

3、加入等量磷酸盐缓冲液（pH6.8~7)，不断晃动，染色约12分钟，直接放与流水下冲洗。

4、染色后甩干或者直立晾干，用中性树胶或者合成树脂或香柏油封片，或不封片直接镜检。

时间：温度较低时约15分钟（染3分钟，加缓冲液不断晃动12分钟。

温度较高时，总时间约5分钟。

剂量：染液与缓冲液剂量之比为1:1如果染色不够，蒸馏水冲洗后，在按照原步骤重新染封片：干燥后的血涂片，浸入二甲苯中后在其干燥前，擦去蜡线，滴明胶与血涂片的一边（半滴至一滴），眼科镊捏住盖玻片正面在酒精灯上烘烤一下后反面贴于载玻片上。

结果：红细胞呈橘红色；中性粒细胞颗粒蓝紫色至紫红色；嗜酸性粒细胞鲜红色至橘红色；嗜碱性粒细胞颗粒深蓝紫色；淋巴细胞核深蓝紫色，胞质天蓝色；单核细胞核蓝紫色，胞质灰蓝色。

、注：①Wright染料对pH较敏感，因此用缓冲液稀释染液，可使染色作用稳定，便于识别和比较细胞的变化。

实验四血涂片的制备与染色【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。

【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。

用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。

细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。

【器材】1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。

2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm 宽度的推片。

3．吸耳球。

4．显微镜。

5．酒精灯或Bunsen灯。

6．采血针。

7．注射器和针头。

【试剂】1．瑞氏（Wright）染液（1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。

将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。

再加15ml甘油密闭保存。

（2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。

配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。

如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。

2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。

将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。

3．瑞-吉复合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。

骨髓涂片瑞氏染色步骤
骨髓涂片瑞氏染色步骤如下:
1. 采集骨髓涂片:通常使用新鲜骨髓或骨髓提取物制备涂片。

在采集过程中,需要使用一次性手套和消毒工具,确保不会对样本造成污染。

2. 处理骨髓涂片:将骨髓涂片放入含有酒精的消毒溶液中浸泡,以去除表面的细胞和血小板。

然后,将涂片放入含有单克隆抗体的溶液中浸泡,以识别不同的细胞类型和生物标记。

3. 标记细胞:使用标记抗体将骨髓涂片上的细胞类型进行分类。

常用的标记包括CD3、CD4、CD8、CD10、CD19、CD30、CD45、CD133、B220等。

在采集骨髓涂片之前,需要使用标记抗体进行预处理,以确保涂片上有足够的细胞类型。

4. 染色:将骨髓涂片与瑞氏染色液混合,并轻轻地涂抹在涂片上。

染色后,涂片会被染成红色或深红色,以显示不同的细胞类型。

常用的瑞氏染色液包括瑞氏试剂盒和瑞氏试剂管。

5. 分析细胞类型:将染色后的骨髓涂片放入显微镜下观察,以确定细胞类型。

可以使用光学显微镜或电子显微镜进行观察和分析。

骨髓涂片是一种常用的细胞学检测方法,可以用于诊断多种血液疾病和其他疾病。

通过使用瑞氏染色步骤,可以识别不同的细胞类型,帮助医生确定病情和制定治疗方案。

1、血涂片制备将一滴血液滴在干净的载玻片上，用另一张载玻片边缘与其接触，呈30°角拉回与血液接触。

当血液蔓延至接近玻片的宽度时，将玻片平稳快速地向前推出。

将玻片在空中轻轻会动，快速风干。

2、血涂片染色采用瑞氏染色法。

本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞特异性颗粒着色较好，但对核的着色略差。

瑞氏染料是由酸性染料伊红（使细胞的碱性成分染成红色，如血红蛋白和嗜酸性颗粒）和碱性染料亚甲蓝（使细胞的酸性成分染成蓝色，如白细胞）组成的复合染料。

（1）用蜡笔在血膜两头划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。

(2)用瑞氏染液3～5滴覆盖整个血膜，固定细胞0.5～1分钟。

(3)滴加等量或稍多的缓冲液（pH6.4～6.8的磷酸盐缓冲液，其作用是使染色环境维持在弱酸性，达到最佳的染色效果），用吸球将其与染液吸匀，或者摇动玻片染色5～10分钟。

(4)慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥后(或用滤纸吸干)，即可镜检。

3、染色效果正常情况：血膜外观呈淡粉红色或琥珀色。

显微镜下，成熟红细胞呈粉红色。

白细胞胞质中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。

附：瑞氏染液配制：瑞氏染料 830gm或1g甲醇（AR） 500ml或600ml1）先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。

2）再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。

3）存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

骨髓涂片检查方法及报告内容（1）骨髓涂片制作、染色方法1）制片骨髓涂片制作方法与血片制作方法基本相同，但因有骨髓小粒和脂肪滴，有核细胞较多，因此较血液黏稠，推片略难于血片，推片时角度要小一些，速度要慢一些，避免骨髓片过厚。

2）染色临床常用的染色方法主要有：①瑞氏(Wright)染色②吉姆萨(Giemsa)染色③Marshall提出的标准化的Romanowsky染色④R-G(Romanowsky- Giemsa)染色⑤wittekind1987年介绍的R-G染色（2）骨髓片检查的程序及方法1）检查步骤[骨髓涂片检查]①低倍镜Ⅰ.观察取材、涂片、染色是否满意等。

Ⅱ.判断有核细胞增生程度低倍镜下选择细胞分布均匀部位观察骨髓片有核细胞增生情况，根据骨髓片中有核细胞的密度或有核细胞与成熟红细胞的比例来估计有核细胞的增生程度。

骨髓有核细胞增生程度通常分为五级，如表2-1。

表2-1骨髓有核细胞增生程度五级估计标准增生程度成熟红细胞：有核细胞有核细胞均数（高倍镜视常见病例野）增生极度活跃1：1＞100各种白血病增生明显活跃10：150-100各种白血病、增生性贫血增生活跃20：120-50正常骨髓象、某些贫血增生减低50：15-10造血功能低下增生极度减低200：1<5再生障碍性贫血Ⅲ.观察全片巨核细胞的数量巨核细胞数量变化较大，如将骨髓膜标准化为×，则参考值为7-35个。

Ⅳ.观察骨髓片边缘和尾部有无体积较大的或成堆的特殊病理细胞。

②油镜分类计数200或500个有核细胞（不包括分裂型细胞和破碎细胞）。

按各细胞的种类、发育阶段分别记录，并计算出百分比。

同时仔细观察各系、各阶段细胞的形态是否正常。

[血涂片检查]分类记数100-200个白细胞，计算各类白细胞的百分率，描述红细胞形态，血小板数量和分布情况。

如见到幼红细胞按分类100个白细胞中幼红细胞的数量来报告，并说明其阶段性。

（3）骨髓报告1）结果计算计算出各系和各阶段细胞占有核细胞总数的百分数；再算出各阶段粒细胞百分数的总和与各阶段幼红细胞百分数之总和，将前者除以后者即得出粒：红比值（G:E）。

血片、骨髓片制备血片、骨髓片标本制备中，有直接检查法与许多细胞化学检查法，通过辨认细胞形态特征并结合临床资料，一般可做出正确诊断。

为了达到这一目的，首先应做好血涂片、骨髓涂片和端氏染色，这是成功的关键。

一、准备工作：（一）清洁玻片：玻片须边缘光滑，十分清洁干燥，不带有油质，新玻片要先浸在清洁液（重铬酸钾2份，硫酸3份，水25份）内，除去游离碱质（否则染色偏碱，不适于观察），用自来水冲洗，再浸在70％酒精内，用时取出，并在火焰高处烘干。

旧的玻片要先用肥皂水煮10余分钟后，再用温水冲洗干净。

边缘玻碎、玻面有划痕的不能再用。

因手上带有油渍，在取用玻片时只可用两手指挟住玻片的两边，不可触及玻面。

（二）推片：推片推端要光滑（常用凹玻片做推片）并将其中锐角用镊子掰掉lmm左右（既宽度较载片窄2~3mm），在油石上平磨光滑。

因异常细胞如瘤细胞等，体积大比重轻，只在涂片边缘尾端才易找到，如涂膜宽至边缘，容易漏诊。

二、制片方法：用推片蘸取骨髓液或血液少许（若看上去很浓，蘸量要少；如果稀薄，可多蘸些），置于载物玻片右端1／3处（右端空白处留贴标签），放直径1~2mm大小的血液或骨髓液一滴，使推片和此滴血液或骨髓液接触，当血液或骨髓液扩散成一均匀的粗线（亦可来回或左右移动推片，使之成为一粗线）。

然后使推片与载玻片成30~45°角（骨髓液较浓时，角度要小，推的速度要慢；骨髓液较稀时，角度应大，推速要快），自右向左，均匀地向前推，直至玻片的尾部，尾部应结束在载玻片左侧1／6处。

上述制作过程应尽快完成，否则骨髓液凝固，将影响标本质量。

三、注意事项：（一）玻片：玻片洁净，手指不能触及玻片面，将玻片一张一张地摆开，准备5张以上。

（二）推片：如置于载片上的血滴液或骨髓液滴较小，应推得较慢，且成＜30°角时涂片较薄；如血滴或骨髓滴较大，应推得较快，且成＞30°角时涂片较厚。

推时要注意用力均匀，动作不快不慢，不可复推。

临床经验基础血涂片知识点
血涂片是一种观察血液细胞的方法，制备厚薄适宜、分布均匀、染色良好的血涂片是血液学检查的重要基本技术之一。

以下是临床经验基础血涂片知识点：
1. 瑞氏染料：由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，溶于甲醇后重新解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

2. 血涂片的制作：取末捎血一滴置于玻片的一端，左手持载玻片，右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。

然后保持30-45度的夹角稳地向前移动，载片上保留下一薄层血膜。

3. 血细胞观察：通过显微镜观察血涂片中的红细胞、白细胞和血小板等血细胞的数量和形态，可以判断血液是否正常。

例如，观察白细胞的数量和形态可以判断是否存在感染；观察血小板数量和形态可以判断是否存在血小板减少或增多等异常情况。

4. 血型鉴定：通过观察血涂片中的红细胞上的抗原，可以确定ABO血型。

5. 细胞染色：为了更好地观察细胞内部结构、识别各种细胞及其异常变化，需要对血涂片进行染色。

常用瑞特染色法。

6. 仪器设备：Motic光学显微镜是常用的观察血涂片的仪器设备。

以上信息仅供参考，如果需要获取更准确的信息，建议咨询医生或相关专业人士。

血涂片及骨髓涂片的制片与读片Prepared on 24 November 2020血涂片及骨髓涂片的制作与读片潘志强2006-3-30实验准备一．器材：载玻片：每只动物一块盖玻片：每只动物一块滴管：4个橡皮吸头：4个中号镊子：4把大剪刀：4把眼科镊：4把玻璃棒：4根烧杯：1000 ml，2个量筒：100ml、500 ml、1000 ml各一蜡笔棕色小口瓶碾钵载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。

取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。

二．试剂：瑞氏染液240ml瑞氏染料粉剂纯甲醇（AR） 60ml将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。

新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。

染料存放越久，染色效果越好。

磷酸盐缓冲液1%KH2PO4 30ml1%Na2HPO4 20ml加蒸馏水至800 ml，调PH值到~，定容至1000ml。

甲醇鸡蛋清：蒸馏水与鸡蛋清按1/1的比例稀释。

中性树胶：如果中性树胶过于粘稠，可将中性树胶与二甲苯按7/3的比例稀释。

二甲苯实验步骤一．涂片（一）血液涂片的制作（1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。

（2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。

（3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。

（4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。

（5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。

（6）每只动物涂片一张。

（7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。