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探究农杆菌介导的外源基因转移农杆菌介导的外源基因转移是一种重要的分子生物学现象，它不仅在基础研究中具有广泛应用价值，还有着重要的应用前景。
本文将对农杆菌介导的外源基因转移进行探究，分析其原理、应用以及存在问题。
一、农杆菌介导的外源基因转移原理农杆菌通过将T-DNA等外源DNA导入感染植物细胞，实现了外源基因转移。
其具体原理是：农杆菌的生长过程中，会分泌外胞质蛋白将T-DNA等外源DNA导入目标细胞内部。
这一过程中，T-DNA与植物基因组的相应部分发生重组，产生一些与植物细胞特定的信号传导通路或调节元件有关的基因。
这种基因转移方式可以被应用于基因工程中，实现对植物基因组的特定调节或修饰。
二、应用前景农杆菌介导的外源基因转移在基础研究中具有广泛应用价值。
例如，它可以在植物基因组中“插入”新的基因，从而研究其在植物中的表达和功能。
同时，这种技术也被广泛应用于植物育种中。
通过将新基因导入植物中，可以增强其耐逆性、抵抗病害能力等。
此外，在医学研究中，农杆菌介导的外源基因转移也具有潜在的应用价值。
其可以被用于生产各种蛋白质，例如免疫球蛋白等。
三、存在问题农杆菌介导的外源基因转移虽然应用前景广阔，但同时也存在一些问题。
例如，农杆菌的感染程度并不均匀，导致基因在植物细胞中的表达程度也不一定一致。
此外，由于T-DNA的特异性较强，很难将外源基因导入到所有植物细胞中。
总之，农杆菌介导的外源基因转移是一种具有重要应用前景的基因工程技术。
通过对其原理、应用以及存在问题的探究，我们可以更好地理解这种技术，并为其未来的发展提供更加科学的指导。
一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。
它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。
其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。
农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。
T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。
第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。
1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160～240kB之间。
其中T-DNA大约在15kb-30kb。
Vir基因区在36kb 左右。
除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。
农杆菌介导的T-DNA转化法简介
农杆菌介导的T-DNA转化法是一种在植物遗传学中常用的技术，利用农杆菌的Ti质粒将特定的DNA片段（T-DNA）转移到植物基因组中，从而实现对植物基因的敲除或功能修改。
T-DNA的整合机制
T-DNA的整合过程通常是随机的，通过非同源末端连接（NHEJ）或微同源介导的末端连接（MMEJ）等DNA修复机制完成。
这种整合可以导致植物基因的表达失活或改变。
敲除植物基因的步骤
1.选择植物材料：选择易于农杆菌转化的植物品种。
2.构建转化载体：将目标基因序列插入T-DNA载体中。
3.农杆菌转化：将载体转化到农杆菌中。
4.植物转化：利用农杆菌感染植物细胞。
5.筛选转化植物：使用选择标记筛选转化的植物。
6.验证转化植物：通过分子生物学方法验证T-DNA整合。
7.表型分析：分析基因敲除的表型效果。
敲除基因的应用意义
敲除特定的植物基因可以帮助科学家研究基因的功能和调控网络，对于理解植物生长发育、病害防治等方面具有重要意义。
实验室操作的注意事项
在进行农杆菌介导的T-DNA转化实验时，需要注意选择合适的植物材料、构建高效的转化载体、严格的筛选过程以及准确的分子验证方法。
同时，确保遵循相关的生物安全规定和指南。
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌介导转化法的概述农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。
植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。
[1]目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。
由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
本文对农杆菌介导转化法进行综述。
1 关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。
原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。
ti质粒介导基因转移的过程TI质粒介导基因转移是一种常用的植物基因工程技术，主要应用于将外源基因导入植物细胞中。
以下是TI质粒介导基因转移的基本过程：1. 构建重组质粒：首先，需要构建一个包含目标基因的重组质粒。
这个质粒通常由几个重要部分组成：T-DNA区域、选择标记基因和表达载体。
T-DNA区域是质粒中用于转移基因的DNA片段，其中包含目标基因和相关调控序列。
选择标记基因用于筛选成功转化的植株，通常是与抗性或荧光等特征相关的基因。
表达载体则包含启动子、终止子等元件，用于确保目标基因在植物细胞中正确表达。
2. 农杆菌感染：接下来，将构建好的重组质粒导入农杆菌（常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens）。
农杆菌具有天然的基因转移能力，可以将质粒中的T-DNA区域转移到植物细胞中。
3. 植物组织处理：将农杆菌含有重组质粒的培养基与目标植物的组织（如叶片、幼苗等）接触，使农杆菌能够感染植物细胞。
通常会在含有适当激素和营养物质的培养基上进行处理，以促进植物细胞的再生和增殖。
4. 选择和筛选：经过一段时间的培养，将植物组织转移到含有选择标记基因所需的选择剂（如抗生素）的培养基上。
只有成功转化的细胞或组织才能在含有选择剂的培养基上存活和生长，从而实现对转化植株的筛选。
5. 植株再生：经过筛选后，成功转化的细胞或组织将进一步培养和培育，以实现植株的再生。
这可以通过体外培养或组织培养技术来实现。
6. 验证和鉴定：最后，对获得的转化植株进行验证和鉴定。
这包括通过PCR、Southern blotting 等分子生物学方法来确认目标基因的存在，并通过表型观察来确定转基因植株是否具有预期的性状和特征。
通过以上步骤，TI质粒介导基因转移可以实现外源基因的导入和表达，从而为植物基因工程研究和应用提供了重要的工具和方法。
基因转化的方法
基因转化是一种重要的生物技术手段，它可以用来改良作物、研究基因功能、生产药物等。
在基因转化中，常用的方法包括农杆菌介导转化、生物弹射法、基因枪法等。
下面将分别介绍这些方法的原理和步骤。
农杆菌介导转化是一种常用的植物基因转化方法。
其原理是利用农杆菌Ti质粒中的T-DNA片段，将外源基因导入植物细胞中，从而实现基因转化。
具体步骤包括，首先将外源基因插入到Ti质粒中的T-DNA片段中，然后将农杆菌与植物组织接种，使其感染植物细胞，最后通过植物再生技术培育出转基因植株。
生物弹射法是另一种常用的基因转化方法。
其原理是利用金属微粒或小颗粒带电，与外源DNA共沉淀后，利用生物弹射装置将DNA微粒射入植物细胞内，从而实现基因转化。
具体步骤包括，首先将外源DNA与金属微粒混合共沉淀，然后将混合物装入生物弹射装置，利用高压气体或爆炸装置将微粒射入植物细胞内，最后通过植物再生技术培育出转基因植株。
基因枪法是一种常用的动植物基因转化方法。
其原理是利用基
因枪将外源DNA微粒射入植物细胞或动物胚胎细胞中，从而实现基因转化。
具体步骤包括，首先将外源DNA微粒装载到金属微粒上，然后将微粒装入基因枪的微粒枪弹中，利用高压气体或爆炸装置将微粒射入植物细胞或动物胚胎细胞中，最后通过再生技术培育出转基因植株或转基因动物。
总的来说，基因转化的方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体需求选择合适的基因转化方法，从而实现基因工程的目的。
希望本文介绍的基因转化方法能够对相关领域的研究和应用提供一定的参考和帮助。
农杆菌介导转基因植物t-dna的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是指利用农杆菌介导技术将外源基因导入植物基因组中的过程。
农杆菌介导转基因技术是一种常用的植物遗传转化技术，通过该技术可以将外源基因导入到植物细胞中，并将其整合到植物基因组中，从而实现对植物性状的改良和优化。
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式主要包括以下几个步骤：
1. 农杆菌感染：首先需要将含有目标外源基因的质粒导入到农杆菌中，然后利用农杆菌的特殊途径将质粒中的T-DNA片段转移到植物细胞中。
2. T-DNA整合：一旦T-DNA片段进入到植物细胞中，它会与植物基因组中的某个位置发生重组，从而将外源基因整合到植物基因组中。
这个过程是随机的，T-DNA片段可以整合到植物基因组的不同位置。
3. 外源基因表达：一旦T-DNA片段整合到植物基因组中，外
源基因就可以在植物细胞中得到表达，从而产生目标蛋白质或RNA。
4. 遗传稳定性：经过一系列的培养和筛选，可以获得稳定遗传的转基因植物株系，这些植物株系可以传递给下一代，从而实现外源基因在植物种群中的稳定传递和表达。
农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式是一种高效、可靠
的转基因技术，它已经被广泛应用于多种重要农作物的遗传改良和品种选育中。
通过这种技术，可以实现对植物抗病、抗虫、耐逆性等重要性状的改良，为农业生产提供了强有力的技术支持。
同时，随着分子生物学和生物技术的不断发展，农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式也在不断完善和优化，为农
作物遗传改良和新品种选育提供了更加强大的技术平台。
HEREDITAS (Beijing) 2011年12月, 33(12): 1327―1334 ISSN 0253-9772 综 述收稿日期: 2011−03−30; 修回日期: 2011−07−25基金项目:国家科技重大专项(编号：2009CB118400)和国家自然科学基金项目(编号：30971795, 31071433)资助作者简介:杨琳, 硕士研究生, 专业方向：生化与分子生物学。
E-mail: myyanglin1986@通讯作者:李晚忱, 博士, 教授, 研究方向：玉米遗传育种与生物技术。
E-mail: aumdyms@网络出版时间: 2011-10-18 8:50:47URL: /kcms/detail/11.1913.R.20111018.0850.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.01327农杆菌介导转基因植物T-DNA 的整合方式杨琳, 付凤玲, 李晚忱四川农业大学玉米所, 成都 611130摘要: 农杆菌介导的遗传转化已被广泛应用于植物转基因研究。
作为外源基因的载体, 农杆菌T-DNA 片段在植物基因组中的整合方式, 不仅影响外源基因的整合效率及稳定性, 还会影响外源基因的表达特性。
文章就农杆菌介导的T-DNA 整合的两种主要模式、规律及相关研究手段进行综述, 为农杆菌介导的转基因及T-DNA 插入突变等相关研究提供借鉴。
关键词: 农杆菌; T-DNA; 侧翼序列; 整合; 转基因T-DNA integration patterns in transgenic plants mediated by Agrobacterium tumefaciensYANG Lin, FU Feng-Ling, LI Wan-ChenMaize Research Institute , Sichuan Agricultural University , Chengdu 611130, ChinaAbstract: The genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens has been widely applied to research of transgenic plants. As the vector of the exotic genes, the integration patterns of T-DNA fragments affects not only transfor-mation efficiency and stability, but also expression properties of the transgenes. This review summaries the two major pat-terns and the rules of T-DNA integration in Agrobacterim -mediated transformation, rules of T-DNA mediated by Agrobac-terium tumefaciens , as well as research tools for flanking sequence amplification. It is attempted to provide references for researches on transformation and T-DNA integration mutation mediated by Agrobacterium tumefaciens .Keywords: Agrobacterium tumefaciens ; transfer DNA; flanking sequence; integration; transgene目前有关植物转基因的方法主要分为两大类, 一类是无转化载体引导的DNA 的直接转化, 另一类是农杆菌介导的转化, 其中后者由于操作简单、转化效率高、插入片段稳定性好、转基因拷贝数低而成为转基因策略中的首选方法[1,2]。
农杆菌细胞中含有基因组DNA 和质粒DNA, 依农杆菌的不同, 质粒分别有Ti 质粒和Ri 质粒, 其上都有一段T-DNA 。
农杆菌细胞侵染植物伤口后, 可将T-D N A 插入到植 物基因组中, 从而实现外源基因向植物细胞的转移与整合, 最后通过植物细胞和植物组织培养可1328 HEREDITAS(Beijing)2011第33卷再生出转基因植株[2~4]。
T-DNA通过异常重组实现整合进入植物基因组中, 它常伴随宿主细胞基因组重排[5]。
这种基因组的重排包括植物基因组整合位点的删除和重复, T-DNA序列的删除和重复, 以及染色体上的易位和倒位[4~7]。
染色体重排包括易位和倒位, 它们在T-DNA整合的转基因植物中表现出相同的特征。
Nacry等[6]研究发现, T-DNA整合的拟南芥发生染色体易位, 断点即是T-DNA整合的位点。
Caceres等[7]研究表明, 染色体倒位的位置多发生在转座子和逆转座子中。
由于对染色重排的研究较少, 其机制还不完善。
转基因植物出现的染色体重排与T-DNA整合是否有直接的联系还有待进一步的研究[2]。
转基因作物的遗传稳定性及其品质决定了转基因作物的应用前景。
农杆菌介导的T-DNA转化规律及转化模型的了解, 不仅有助于外源基因表达及宿主基因表达的影响因素, 同时对研究基因功能, 转基因作物的应用均具有重要的意义[8,9]。
1 T-DNA整合模式及规律T-DNA整合进入植物基因组, 会对宿主细胞的基因组造成改变, 这种变化无论是对外源的T-DNA 的表达还是植物基因的表达都会产生影响。
同时, T-DNA整合进入植物基因组的规律与稳定性将直接影响到转基因作物的品质。
目前, 虽然利用农杆菌介导的T-DNA转化技术已在多种禾谷类作物中获得成功, 但较为完善的转化机制模型并未建立。
对T-DNA整合植物基因组规律及植物转基因的整合机制的了解, 对研究外源基因以及整合位点的宿主基因的功能, 以及转基因作物在实际生产中的应用提供基础[8, 9]。
目前许多研究者通过对T-DNA整合位点的研究以及T-DNA结构特点研究建立外源基因在宿主中的整合与重排机制。
针对于农杆菌介导的T-DNA 整合宿主基因组的机制主要分为两类, 主要分歧在于对VirD2 蛋白在整个机制中的作用以及左右两端作用机制是否相同[10~14]。
1.1 T-DNA整合模式T-DNA整合模型的两种模型, 分别是“单链缺口修复模型”(Single-stranded gap repair, SSGR)和“双链断裂修复模型”(Double-stranded breaking repair, DSBR)。
在“SSGR模型”中(图1), 单链T-DNA的3′端有一段核苷酸序列与植物DNA同源, 被取代的植物DNA链的一条链被核苷酸内切酶消化, 如单链T-DNA有悬垂的3′端(C图三角形处)也将被核苷酸外切酶或核酸内切酶消化, 接着T-DNA被5′端(附着在VirD2蛋白上)结合到互补靶向链的微同源区域, 通过T-DNA与植物DNA链的复性使VirD2上的磷酸酪氨酸键暴露在植物DNA下的3′羟基端, 同时以复性的单链T-DNA的3′端作为引物来复制DNA, 复制从植物DNA的缺刻按5′端到3′端方向延伸, 导致这段植物DNA的缺失, 接着位于T-DNA的5′端的磷酸酪氨酸键被靶向DNA的磷酸二酯键取代, 从而使T-DNA共价整合到植物染色体中[10,15~17,18]。
该模型表明在T-DNA的整合过程中, 两端的作用机制是不同的。
左边界和宿主基因组的预整合位点结合(pre-insertion site), 在整合过程中有缺失, 并且与靶向位点处有一小段同源序列(5~7 bp)。
而右边界整合过程比较保守, 与靶向位点没有同源序列或图1 T-DNA整合“单链缺口修复模型”植物基因组的部分序列双链解开, 单链T-DNA的3′端有一段核苷酸序列与植物DNA同源, 被取代的植物DNA链的一条链被核苷酸内切酶消化, 单链T-DNA如果有悬垂的3′端(C图三角形处)也将被核苷酸外切酶或核酸内切酶消化。
T-DNA被5′端结合到互补靶向链, 依箭头方向复制延伸, T-DNA便共价整合到植物染色体中。
第12期杨琳等: 农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式 1329者只有单碱基同源序列。
这个模型强调了VirD2蛋白的作用, 同时T-DNA的整合是通过复性实现的。
然而, 一些研究表明, VirD2蛋白不具连接酶的活性[11,12]。
Salomon和Puchta [19]对转基因烟草的研究, 提出了T-DNA整合机制是通过“双链断裂修复机制”完成的, 与ViD2无关[5]。
Kumar和Fladung 通过对转基因山杨的研究[14], 完善了以基因组的双链断裂修复为基础的整合模型(图2)。
该模型首先是植物靶DNA产生双链断裂, 游离出的3′端捕获出双链T-DNA形成的D环, 找到与其同源的小段DNA后开始修复合成, 新合成的DNA序列与植物基因组另一端游离的3′端有一小段同源的序列或没有同源序列而直接连接到平末端, 通过单链复性使余下的单链缺口被修复。
双链断裂修复模型表明T-DNA整合过程中, 左右边界序列都有部分缺失, 由T-DNA的左边界复制形成的填充DNA就插入到了T-DNA的右侧与基因组序列之间。
模型很好地解释了T-DNA的整合过程出现的缺失及填充DNA(filler DNA)的形成。
但对于许多研究所报道的多拷贝单位点整合等复杂的整合方式, 及DNA直接转化中的整合情况都不能很好地解释。
近期, Tzfira等[8]和Zhu等[3]对串联多联体的整合形式提出了“DSB整合模型”。
他们认为, 串联的T-DNA在整合进入植物基因组的过程中, T-DNA两末端对宿主植物的预整合位点不同, 导致染色体倒位。
“DSB整合模型”也认为宿主染色体发生了双链的断裂, 但其整合方式比“DSBR模型”复杂。
这些机制分别可以解释研究过程中的一些现象, 但不能适应所有的整合情况, 仍需要完善或提出新的机制加以阐述。
图2 T-DNA整合“双链断裂修复模型”植物DNA产生双链断裂, 当植物基因组游离的3′端捕获到T-DNA上的小段同源序列后开始修复合成。
新合成的DNA序列与植物基因组另一端游离的3′端有一小段同源的序列或没有同源序列而直接连接到平末端, 通过单链退火使余下的单链缺口被修复, T-DNA就整合进入植物基因组中。
