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结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
小鼠外周血单个核细胞分离、纯化徐太哲;李丽;王长山【摘要】目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验.方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率.结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85％,细胞获得率最高可达80％以上,活细胞百分率在92％以上.结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2016(039)004【总页数】3页(P10-11,13)【关键词】小鼠;Ficoll密度梯度离心;PBMC【作者】徐太哲;李丽;王长山【作者单位】佳木斯市红十字医院,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】R446.11+3外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。
研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll-hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离[1]。
离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。
PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCR等后续试验结果。
实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。
1.1 材料与分组BALB/c小鼠18只，5～6月龄，体重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。
T-SPOT.TB实验操作流程样本要求：1、肝素抗凝采血管采集全血样本（无需空腹）2、血量要求：①一般患者5-8ml②免疫力低下患者8-10ml③2岁以下儿童2-3ml3、室温（18-25℃）保存与运输，不得冷冻与冷藏4、近期有输血或做过PET-CT的患者，建议两周后再送检5、运输过程中防止颠簸，避免样本溶血，溶血样本不能进行检测6、送检时间：①无延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，8小时内完成细胞分离②有延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，32小时内完成细胞分离准备工作1、配套试剂无菌确认：1)RPMI-1640培养基2)AIM-V培养基3)淋巴细胞分离液正常为清澈、透明、无漏液（出现浑浊，有异物，漏液情况的，应停止使用）2、设备准备：1)使用消毒液擦拭生物安全柜并紫外灭菌30min以上2)确认培养箱运行在37℃、5％CO₂浓度条件，并确保水盘中有足够的水，防止培养过程中干板3)使用消毒液擦拭所需移液器，确保移液器表面及腔体无菌3、耗材准备：1)无菌15ml锥底离心管（3-4支/人份）2)无菌吸管（2-3支/人份）3)无菌加样枪头（10µl、100µl、1ml若干）4)无菌1.5ml离心管（1-2支/人份）5)无菌50ml离心管（1-2支）（用于实验中分装1640培养基，降低污染风险）6)实验中会用到的其他耗材及工具等4、加延长试剂（T-Cell Xtend）（在实验开始前，已超过8小时的样本需加延长试剂）1)按25µl/ml的量加入延长试剂（5ml样本需加入125µl延长试剂）2)盖上管盖，轻轻颠倒混匀8-10次（充分混匀并避免溶血）3)室温(18-25°C)静置10-25 min后开始实验实验操作流程及注意事项第一天（要求全程在II级生物安全柜中操作）一、PBMCs（外周血单个核细胞）提取1、将全血样本转移至15ml离心管中，加1640培养基稀释至10ml（实验中1640培养基需用无菌50ml离心管分装使用，防污染）2、在另一15ml离心管中加入3-4ml淋巴细胞分离液3、将稀释好的血液样本缓慢加入到分离液上层（缓慢加入，不要破坏分离液液面）4、使用18℃，1000g条件离心22min（建议使用缓慢降速档，以获取更好的分离效果）5、分离后，使用无菌吸管将分离得到的PBMCs层吸至另一无菌15ml离心管中（不能吸到底层的血细胞）二、细胞洗涤：1、将收集得到的PBMCs细胞悬液加1640培养基至10ml，颠倒混匀2、使用18℃，600g条件离心7min3、弃上清，使用移液器将沉淀细胞吹打混匀，加1640培养基至10ml，颠倒混匀（细胞吹打需使用移液器充分吹打混匀，才能达到细胞洗涤目的）4、使用18℃，350g条件离心7min5、弃上清（上清液需要尽量弃彻底）6、加入500µl的AIM-V培养基，使用移液器充分吹打混匀（实验中AIM-V培养基需用无菌15ml离心管分装使用，防污染）三、细胞计数细胞计数仪计数：吸取小于100μl的细胞悬液至1.5ml离心管，上机计数，记录“淋巴细胞+单核细胞和值”（如上样量需要大于100μl，可用1640培养基稀释1倍，再上机计数，计数结果相应乘以2）显微镜计数：1、先加入40µl 1640培养基至1.5ml离心管底部，再加入10µl细胞悬液充分混匀，进行5倍稀释2、取5倍稀释后的细胞悬液10µl充池血球计数板，计数四个白细胞计数区域之一（四个区域的任一个）的白细胞数，记录计数结果计数区域示例图四、加样（取相应样本数的板条，编号并标注各抗原孔位置）板条示例图1、加抗原1)所有对应样本的空白对照孔中（N）加入50µl AIM-V培养基2)所有对应样本的抗原A孔中加入50µl抗原A3)所有对应样本的抗原B孔中加入50µl抗原B4)所有对应样本的阳性质控对照孔中（P）加入50µl阳性质控品2、加样（不同的计数方法，参照其对应的加样表）细胞计数仪计数参照“附件一：细胞计数仪计数，加样表”，在对应编号的板孔中加入相应的细胞悬液量及AIM-V培养基的量（既保证每个板孔中有25万个PBMCs，又保证150µl的总体系，防止培养干板）（加样顺序为N到P，悬空加，防止阳性质控品污染其他板孔）显微镜计数参照“附件二：显微镜计数，加样表”，在对应编号的板孔中加入相应的细胞悬液量及AIM-V培养基的量（既保证每个板孔中有25万个PBMCs，又保证150µl的总体系，防止培养干板）（加样顺序为N到P，悬空加，防止阳性质控品污染其他板孔）五、过夜培养：将加样完成的培养板盖好后，放入37℃、5%CO2浓度培养箱中培养16-20h（要求培养箱中有足够的湿度，避免干板，请确保培养箱水盘中有足够的水）第二天(洗板、显色、结果判读)一、配制酶标二抗工作液（须当天新鲜配制）1、取（n+1）×200µl的1×PBS至无菌离心管中（n表示样本数）（1×P BS要求：1、不能含有表面活性剂 2、PH值严格要求在7.0-7.5之间），以下1×P BS要求相同）2、取（n+1）µl酶标二抗原液至上一步的1×PBS中，并充分混匀二、第一次洗板（洗去细胞及非特异结合）：从培养箱取出培养板，弃细胞液，用1×PBS洗板四次每次每孔加入200µl的1×P BS，放置30秒，倒弃，使用滤纸拍干三、加酶标二抗孵育：每孔加入50µl新鲜配制的酶标二抗工作液，在2-8℃条件下孵育1h。
ASC与Caspase-1在PBC患者外周血中的表达研究樊佳;赵二川;叶震璇;李红梅;任智晶;张华【摘要】目的探讨ASC与Caspase-1在原发性胆汁性肝硬化(PBC)发病过程中的影响.方法采用实时荧光定量PCR、Western blot、焦磷酸测序及ELISA等方法分别检测30例 PBC患者及健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)中Caspase-1与ASC的mRNA和蛋白的相对表达情况,以及ASC启动子区甲基化状况和血浆中Caspase-1和IL-18的表达水平.结果 PBC组患者PBMC中Caspase-1、ASC mRNA和蛋白表达明显高于对照组(P<0.05).ASC启动子区域Island 1(IS1)各位点甲基化率明显低于对照组(P<0.05),Island 2(IS2)各位点甲基化率小于背景值,未发生甲基化.PBC组血浆中Caspase-1与IL-18的水平明显高于对照组(P<0.05).ASC mRNA与Caspase-1 mRNA的表达呈明显正相关(P<0.05);ASC启动子区域IS1的第1、2、4和5位点的甲基化率与ASC mRNA的表达均呈负相关(P<0.05),第3、6位点甲基化率则与其表达无相关性(P>0.05);血浆中Caspase-1与IL-18水平呈明显正相关(P<0.05).结论 ASC和Caspase-1参与了PBC的免疫炎性反应.%Objective To explore the influence of apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment do-main(ASC)and Caspase-1 on the pathogenesis of primary biliary cirrhosis(PBC).Methods The real-time PCR,Western blot,py-rophosphate sequencing and ELISA were adopted to respectively detect the relative expressions of mRNA and protein of peripheral blood mononuclear cells(PBMS)Caspase-1 and ASC as well as the methylation status of ASC promoter region and plasma Caspase-1 and IL-18 expression levels in 30 cases of PBC and healthy controls.Results The mRNA and protein expressions of PBMC Caspase-1 and ASC in the PBCgroup were significantly higher than those in the controlgroup(P<0.05).The methylation rate of ASC promoter Island1(ISI)was significantly lower than that of the control group(P<0.05),which of Island 2(IS2)was smaller than the background value and had no methylation occurrence.The levels of plasma Caspase-1 and IL-18 in the PBC group were sig-nificantly higher than those in the control group(P<0.05).The ASC mRNA in the PBC group was significantly correlated with the Caspase-1 mRNA expression(P<0.05);the methylation rates at loci 1,2,4,5 of ASC promoter region CpG island were nega-tively correlated with ASC mRNA expression(P< 0.05),and which at loci 3,6 had no correlation with their expressions(P>0.05);plasma Caspase-1 and IL-18 levels showed the obviously positive correlation.Conclusion ASC and Caspase-1 are involved in the immune inflammatory response in PBC.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)008【总页数】5页(P1044-1048)【关键词】肝硬化,胆汁性;半胱氨酸蛋白酶类;ASC;焦磷酸测序【作者】樊佳;赵二川;叶震璇;李红梅;任智晶;张华【作者单位】贵州医科大学临检教研室,贵阳550004;贵州省人民医院检验科,贵阳550002;贵州省人民医院检验科,贵阳550002;贵州省人民医院检验科,贵阳550002;贵州省人民医院检验科,贵阳550002;贵州省人民医院检验科,贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R446.6原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种渐进性发展的慢性自身免疫性肝脏疾病，以肝脏汇管区淋巴细胞浸润、胆管上皮细胞特异性损伤及血清中出现高滴度抗线粒体抗体为特征，其病因及发病机制目前尚不完全清楚，可能与遗传易感性及环境等因素有关[1-2]。
PBMC 细胞的精确计数和活性分析一、 PBMC 细胞计数的现状 1. 目前， 绝大多数的科研工作者仍在使用血球计数板在 显微镜下进行手工计数 PBMCs； 2. 但是显微镜下由于白细胞和红细胞大小非常接近， 不 能完全区分白细胞和红细胞； 3. 通过红细胞的双凹形形态鉴别红细胞， 需要经验丰富 的操作者，且不停地调焦来鉴别；可想而知要把每个红 细胞鉴别出来，要耗费多长的时间，需要多强的工作量。
PBMC 样本的差异性大 由于个体的差异（如正常人和病人）和人工分离提取的差异，红细胞和血小板污染的程度差异性非 常大，因此我们经常看到分离后的 PBMC 样本千差万别，这也大大增加了在同一条件下，简单快速 准确计数 PBMC 的难度和检测 PBMC 活性的难度。
二、 PBMC 精确计数或活力分析的重要性 PBMC（外周血单个核细胞）是免疫学功能研究中最常用的细胞模型，如细胞增殖、细胞毒性、细 胞因子分泌等。
如在癌症免疫治疗领域中，需从病人全血中分离出 PBMC，分离的 PBMC 进一步扩增或进行不同的 功能检测。
激活扩增后的细胞再回输到病人体内进行细胞治疗。
在整个流程中，从分离到检测，到 培养，到回输等过程，细胞浓度和细胞活力都是必须监测的参数。
密度梯度分离液是从外周血、骨髓，及脐血分离单个核细胞最常用的方法。
但是不可避免的，分离 后的细胞中，会有残存的红细胞及血小板混合在单个核细胞中。
残存的红细胞和血小板的多少，与 个体的差异，以及分离的效果相关；但是不管分离的技术多高超，经验多丰富，都不可避免会存在 红细胞和血小板的污染。
PBMC 实验的特征 1. 随着时间的延长，细胞质量下降； 2. 临床试验相关的样品量很大； 3. 细胞样品不纯，分离之路依赖病人样本和操作者 如何精确、快速、简便计数 PBMC 以及精确分析 PBMC 活力，是免疫学研究以及免疫治疗领域至关 重要的步骤。
1. 使用血球计数板在显微镜下进行手工计数 PBMC，即耗时耗人力，更不能达到精确计数的目的。
红细胞残留的PBMC精确计数和活性分析一、 PBMC精确计数和活性分析的重要性外周血单个核细胞（PBMC）在免疫学、传染病、肿瘤学、干细胞移植、恶性血液肿瘤以及疫苗开发等领域被广泛的研究，尤其是在免疫学领域，PBMC细胞被用来监测在不同患者之间的免疫功能，其监测浓度、活力、增值、细胞因子的功能，对于临床试验和细胞医学研究都是是至关重要的。
PBMC通常从分离于全血或者采集于病人的脐带血，这个过程就需要使用淋巴细胞分离液从血浆，血小板，和红细胞（RBC）中分离PBMC。
分离之后，冷冻保存之前或者各种免疫分析都需要进行常规的活性和浓度测验来验证样品的质量。
其中一个重要的问题就是PBMC细胞分离中红细胞的污染，PBMC样品中红细胞的污染会导致测量浓度和活性的误差，这就需要通过进一步的实验来分析这些细胞，要解决这个问题，可以用RBC溶解来消除潜在的RBC污染导致的问题。
二、 消除红细胞导致的计数误差的方法1、新鲜的人类PBMC样品残留RBC的鉴定用Cellometer Vision细胞计数仪明场图像计数15个分离的新鲜白细胞样品，独特的光学系统使得红细胞的双凹面可视化，因此PBMC和RBC被视觉化然后图像计数。
因此PBMC和RBC可以被视觉识别，然后根据图像计数。
下图显示的是明场计数的PBMC样品，红色圈圈出双凹面的红细胞，蓝色圈圈出PBMCVISION CBA调焦，红细胞双凹面结构明场图像荧光染料染PBMC确认，红箭头为双凹的红细胞，绿箭头为PBMC红色圈圈出红细胞，蓝色圈圈出PBMCRBC的污染程度用公式计算：污染率%=RBC计数/总计数×100%结果显示4个样品高度污染（超过30%），6个样品中度污染（介于10%-30%），4个样品低轻度污染（低于10%）。
2、AO/PI双染活/死细胞进行自动计数AO和PI是荧光核酸染料，检测细胞的活性。
AO是一种细胞膜透过性染料，染总细胞，发绿色荧光;，PI不具有细胞膜通透性，染死细胞，发橙/红色荧光。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能知足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用愈来愈显的重要非常。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手腕包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方式观看细胞因子蛋白表达及mRNA表达能够识别Th1和Th2细胞，此方式可取得较强的细胞内信号，但此方式工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有专门大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行普遍推行。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的显现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的时期。
下面要紧对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
初期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆">克隆证明了不同细胞因子的合成，如T）与H1（IL－2，IFN－TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆">克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭露。
近来，Jung与Picker采纳了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin （BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方式使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激进程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方式可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方式证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
Peripheral Blood Mononuclear Cells（PBMCs）是一种白细胞群体，包括淋巴细胞（T细胞、B 细胞、自然杀伤细胞等）和单核细胞（单核巨噬细胞、树突状细胞等）。
PBMC细胞计数偏低可能与多种因素有关，以下是一些可能的原因：
疾病状态：患有一些免疫相关疾病、感染病毒（如HIV、流感等）或其他慢性疾病可能导致PBMC计数下降。
放射线或化疗治疗：放射线治疗或化疗可能对血液系统产生负面影响，导致PBMC计数减少。
药物：使用某些药物（如免疫抑制剂、抗生素、抗癌药物等）可能导致PBMC计数下降。
自身免疫疾病：一些自身免疫疾病，如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，可能对免疫系统产生负面影响。
营养不良：营养不良、缺乏某些营养素（如维生素、微量元素等）也可能影响免疫系统功能，从而导致PBMC计数下降。
骨髓问题：由于骨髓问题（如骨髓炎、骨髓纤维化等），造血功能可能受到影响，从而影响PBMC的产生。
年龄：年龄因素可能导致PBMC计数发生变化，老年人通常可能表现出较低的PBMC计数。
应激和炎症：长期或慢性的应激状态、炎症反应也可能对PBMC计数产生影响。
如果发现PBMC计数偏低，建议进行详细的医学检查，包括血液检测、免疫学检测等，以确定具体的原因，并根据诊断结果采取相应的治疗措施。
治疗方案将根据潜在原因的特性而有所不同。
因此，如果存在偏低的情况，建议咨询专业医生以获取更详细的诊断和治疗建议。
PBMC细胞的精确计数和活性分析一、PBMC细胞计数的现状1. 目前，绝大多数的科研工作者仍在使用血球计数板在显微镜下进行手工计数PBMCs；2. 但是显微镜下由于白细胞和红细胞大小非常接近，不能完全区分白细胞和红细胞；3. 通过红细胞的双凹形形态鉴别红细胞，需要经验丰富的操作者，且不停地调焦来鉴别；可想而知要把每个红细胞鉴别出来，要耗费多长的时间，需要多强的工作量。
PBMC样本的差异性大由于个体的差异（如正常人和病人）和人工分离提取的差异，红细胞和血小板污染的程度差异性非常大，因此我们经常看到分离后的PBMC样本千差万别（见下图），这也大大增加了在同一条件下，简单快速准确计数PBMC的难度和检测PBMC活性的难度。
二、PBMC精确计数或活力分析的重要性PBMC（外周血单个核细胞）是免疫学功能研究中最常用的细胞模型，如细胞增殖、细胞毒性、细胞因子分泌等。
如在癌症免疫治疗领域中，需从病人全血中分离出PBMC，分离的PBMC进一步扩增或进行不同的功能检测。
激活扩增后的细胞再回输到病人体内进行细胞治疗。
在整个流程中，从分离到检测，到培养，到回输等过程，细胞浓度和细胞活力都是必须监测的参数。
密度梯度分离液是从外周血、骨髓，及脐血分离单个核细胞最常用的方法。
但是不可避免的，分离后的细胞中，会有残存的红细胞及血小板混合在单个核细胞中。
残存的红细胞和血小板的多少，与个体的差异，以及分离的效果相关；但是不管分离的技术多高超，经验多丰富，都不可避免会存在红细胞和血小板的污染。
PBMC实验的特征1.随着时间的延长，细胞质量下降；2.临床试验相关的样品量很大；3.细胞样品不纯，分离之路依赖病人样本和操作者如何精确、快速、简便计数PBMC以及精确分析PBMC活力，是免疫学研究以及免疫治疗领域至关重要的步骤。
1.使用血球计数板在显微镜下进行手工计数PBMC，即耗时耗人力，更不能达到精确计数的目的。
2.通过明场的常规细胞计数仪同样不能区分红细胞，不能达到精确计数PBMC和精确活力分析的目的。
3.迫切需要快速、简便、精确计数PBMC的工具替代人工计数。
Nexcelom公司走在了市场领先的位置，在常规明场的细胞计数仪基础上，开发出了双荧光细胞活力分析仪，可通过AOPI染料进行PBMC的快速精确计数和活力分析。
参考文献1. Preliminary Report: Evaluation of Storage Conditions and Cryococktails during Peripheral BloodMononuclear Cell Cryopreservation", L.M. Cosentino, W. Corwin, J.M Baust, N.Diaz-Mayoral, H.Cooley, W.Shao, R. Van Buskirk, and J.G Baust, Cell Preservation Technology, Volume 5 Number 4, 20072. "Viability and Functional Activity of Cryopreserved Mononuclear Cells", A. Weinberg, L. Zhang, D. Brown, A.Brice, B.Polsky, M. S. Hirsch, S. Owens, and K. Lamb Clincal and Diagnostic Laboratory Immunology, July, 2000, P714-7163. "Cell loss and recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of postthaw and postwash samples",V. Laroche, D. H. McKenna, G. Moroff, T. Schierman, D. Kadidlo, and J. McCullough, Transfusion, Vol., 45, Dec. 2005.4. "Viability and Recovery of Peripheral Blood Mononuclear Cells Cryopreserved for up to 12 Years in aMulticenter Study", C. A. Kleeberger, R. H. Lyles, J. B. Margolick, C. R. Rinaldo, J. P. Phair, and J. V. Giorgi, Clinccal and Diagnostic laboratory Immunology, Vol. 6, No. 1, Jan. 1999.三、如何精确计数PBMC和活力分析检测通过AOPI染料进行双荧光计数和活力分析，是可以排除红细胞、血小板、细胞碎片等污染的精确计数方法。
AO（吖啶橙）和PI（碘化丙啶）是可对DNA染色的细胞核染色试剂。
其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。
活死单个核细胞可呈现荧光信号。
而成熟的红细胞及血小板，因为没有细胞核，不能被AO/PI染色，因此可以完全被排除在外不被计数。
通过AOPI染料进行双荧光计数和活力分析，可以精确计数分离后的PBMC以及活力分析，亦可进行全血中的PBMC。
分离液后样本PBMC计数&活性分析举例全血样本PBMC计数细胞及活性分析举例明场图像显示RBC/血小板污染明场图像根本无法计数双荧光活力分析仪结果报告输出双荧光活力分析仪结果报告输出四、Cellometer细胞计数和活力分析仪器型号选择1.双荧光计数和活力分析是PBMC计数的最佳选择方法。
三款仪器型号可选：AUTO2000/K2/ VISION CBA，可精确、快速、简便进行PBMC计数和活力分析。
AUTO2000双荧光细胞活力分析仪K2双荧光细胞分析仪VISION CBA细胞功能分析系统触屏操控电脑操控电脑操控，高配置，可分析凋亡&细胞周期等2.明场的自动细胞计数仪进行PBMC计数，可通过台盼蓝排斥法进行PBMC的活力检测。
虽然也能达到自动、快速的目的，但是仍无法有效的排除红细胞的干扰，达到精确计数的目的。
台盼蓝排斥法检测细胞死活，是通过台盼蓝这个细胞活性染料，其不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。
是最常用的检测细胞活率的方法。
但是台盼蓝排斥法并不能精确计数活死细胞，原因是细胞膜通透性不一样，进入细胞内的染料差异也很大，所以经常会出现很难判定是死细胞还是活细胞。
如果对PBMC计数的准确性要求不是很高，但是需要快速、自动计数，而且对实验的一致性和重复性的要求高，可选择以下三款计数仪：AUTO1000/MINI/AUTO T4。
MINI自动细胞计数仪AUTO1000一体式细胞计数仪AUTO T4自动细胞计数仪电脑操控，小巧美观，性价比高一体化设计，触屏操控经典款，符合GLP/GMP参考文献1. Chan, L.L., Wilkinson, A.R., Paradis, B.D. and Lai, N. (2012b) Rapid Image-based Cytometry for Comparisonof Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence 22, 1301-1311.2. Almeida, C.-A.M., Roberts, S.G., Laird, R., McKinnon, E., Ahmed, I., Pfafferott, K., Turley, J., Keane, N.M.,Lucas, A., Rushton, B., Chopra, A., Mallal, S. and John, M. (2009) Automation of the ELISpot assay forhigh-throughput detection of antigen-specific T-cell responses. Journal of Immunological Methods 344, 1-5.3. Constantino, B.T. and Cogionis, B. (2000) Nucleated RBCs - Significance in the Peripheral Blood Film.Laboratory Medicine 31, 223-229.4. Laroche, V., McKenna, D.H., Moroff, G., Schierman, T., Kadidlo, D. and McCullough, J. (2005) Cell loss andrecovery in umbilical cord blood processing: a comparison of postthaw and postwash samples. Transfusion 45, 1909-1916.5. Sigfusson, A. and Souhami, R. 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