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综述与专治乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展张金宝1,乌云塔娜2(1.内蒙古扎兰屯农牧学校,内蒙呼伦贝尔162650;2.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗畜牧局动物疫控中心,内蒙古呼伦贝尔162650)摘要:乳酸菌以其遗传工程可行并操作简单,在建立和研究乳酸菌食品级高效表达载体系统方面具有十分重要的实际意义。
本文对乳酸菌食品级高效表达载体系统的最近研究及其在外源基因表达方面的应用概况进行初步总结。
指出食品级乳酸菌工程及其表达产物可直接用于食品工业、医药和保健品等领域,是具有巨大应用前景的技术。
关键词:乳酸菌(LAB);食品级;表达载体系统中图分类号:T S201.6文献标识码:A文章编号:1004-6704(2008)06-0042-03The Food Grade Inducible Over ProductionExpression System of Lactic Acid BacteriaZH ANG Jin-Bao,WU Yun-tana(1.Zalantun F armets and Sc hools in I nner M ong oli,Zalan tun,I nner M ong li162650;2.X in baery ou qi ise ase Cintrol Ceter,Zanlantun,162650)Abstract:T he g enetic pro ject of the L actic A cid Bacteria(LA B)is simple o per ated。
T hat already w idely used in to ex press many other sour ces g ene.Study the Fo od-Gr ade Inducible Over-P roduct ion Ex pression System-of L actic Acid Bacteria hav e v ery impo rtant significance.In this paper,T here are preliminary co nclusio n the research o f t he Fo od-Gr ade Inducible O-v er-P roduct ion Expressio n Sy stem-o f Lactic Acid Bacter ia at r ecently and it's used in to ex press other g ene aspects.Key words:lactic acid bacter ia;fo od-gr ade;over-production;ex pression system乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一群革兰氏阳性厌氧细菌,能发酵碳水化合物(如葡萄糖),主要代谢产物是乳酸的各类细菌的统称。
乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定谷贵章;宋达峰;顾青【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2006(16)6【摘要】目的：旨在构建一个将抗原靶向于乳酸乳球菌细胞表面的表达系统。
方法：运用PCR技术从金黄色葡萄球菌基因组中克隆出蛋白A（SPA）C-末端544个碱基对的锚定域序列（Spax）。
通过酶切、连接将Spax构建入分泌型质粒pAMJ399形成携有整合外源基因位点BglⅡ的pAMJ400质粒。
将报告蛋白一绿色荧光蛋白的基因（Gfp）插入载体pAMJ400的整合位点产生模式质粒pAMJ401并电转化其于乳酸乳球菌MG1363。
绘制转化子MGI363（pAMJ401）生长曲线确认诱导期。
调节pH值（6．0-6．5）诱导转化子并在荧光显微镜下观察杂合蛋白（GFP：SPAX）的表达情况。
结果：在395nm的蓝色激发光下，诱导后的细菌发出较明亮的绿色荧光，而未诱导的细菌几乎不产生荧光。
结论：成功地构建了乳酸乳球菌表面展示表达系统，此系统可以作为口服活菌疫菌研究的可行性操作平台。
【总页数】5页(P17-21)【关键词】乳酸乳球菌;表达系统;展示表达【作者】谷贵章;宋达峰;顾青【作者单位】浙江工商大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.构建及鉴定表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌 [J], 向荣;林艳;李晓曦;张欣;巩思嘉;赵子建3.乳酸乳球菌食品级表面表达系统建立和报告基因检测 [J], 庄重;季莉;徐莹莹;李珊珊;季玉红;段义农4.乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立 [J], 王长远;许凤;沈冰蕾;于长青;姚笛5.乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
文章编号:1002-2694(2008)03-0224-05乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达孙强正,熊衍文,叶长芸,徐建国摘 要:目的 构建乳酸乳球菌(L a ctococcus lactis ,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)。
方法 PCR 扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pS H91中,构建食品级分泌性表达载体p SQZ ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌Nuc A 成熟肽的编码序列nucA 到pSQZ 中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MB P71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA ;采用TB 2D 法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA 活性。
结果 PCR 扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pS H91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA 基因片段克隆入载体p SQZ 并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA 。
在TB 2D 平板上,L l actis MB P71/p SQZ 2nucA 克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ 2nucA 上清和菌体在18kDa 位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。
结论 成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA 在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。
关键词:乳酸乳球菌;食品级载体;分泌性表达;报告蛋白 中图分类号:R155.5 文献标识码:A Constr uct ion of a f ood 2gr ade secr et ion expr ession vectoran d the expression of r epor ter pr otein in Lact ococcus l actisSUN Qia ng 2zheng ,XION G Yan 2we n ,YE Chang 2yun ,XU Jia n 2guo(S tate Key L abora tor y f or i nf ectious dise ase prevention an d cont rol ,N a tiona l I nstitute f or Communica ble D isease Controla nd Pr evention ,Chinese Center f or D isease Cont rol a nd P revention ,Bei jing 102206,Chi na)AB S T RAC T :To const ruct a food 2gra de secretion e xpre ssion vector and it s use in the exp ression of repo rter protein nucle 2ase (Nuc A),a f ragment ,Usp45,containing the coding sequence of promoter ,ribosomal binding site ,secretion signal and the cod 2ing seque nce for 11pre 2amino acids was a mplif ied by PCR using t he ge nomic DNA of ctis M G 1363,and t hen inser te d into t he f ood 2gra de vecto r pSH91,t hus to constr uct a secretion exp ression vector pSQZ.In addition ,the coding sequence of NucA (nucA)was also amplified f rom St ap hyloco ccus a ur eus chromoso me and inser ted into vector p SQ Z under the control wit h pro 2mote r usp45to constr uct a recombina nt pla smid pSQZ 2nuc A.Nuclea se plate activ ity and zymogram assa ys we re to be used to detect the NucA activity in the secretion expression of ctis.It was demonstrated tha t the secretion expressio n vector sys 2tem ctis MB P71/pSQZ 2nuc A was successively const ructed thro ugh t he processe s mentioned a bove and the qua ntity of Nu 2cA sec reted into c ultural super natants wa s gr ea te r tha t t hat in bacterial lysates.Because all the fr agments used to co nstr uct the vector pSQZ we re obtained f rom food 2grade bacteria ,the vector pSQZ can be regarded as a food 2gra de secretion e xpre ssio n vec 2tor.These data can be used a s the foundation fo r the f urther st udy on t he secretion expression of t he protective antigen in t he o 2ral vaccine. KE Y W O RDS :L actoco ccus lactis ;Food 2gra de vector ;Secre tio n expr ession ;Repor te r protein 通讯作者徐建国,x j @ 作者单位中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 6 乳酸菌(l act ic aci d bacteri a ,L AB )是一类可发酵糖产生乳酸的细菌总称,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌等二十几个属,广泛用于食品工业,用来生产和保存乳制品及其他食品,被公认为是安全的食品级微生物(generall y regarded a s safe ,GRAS)。
王帅，邓木兰，梁志成，等. 基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建[J]. 食品工业科技，2024，45（9）：124−130. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149WANG Shuai, DENG Mulan, LIANG Zhicheng, et al. Construction of a Food-grade Expression Vector Based on pyrF Gene in Lactococcus lactis [J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(9): 124−130. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149· 生物工程 ·基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建王 帅1，邓木兰1, +，梁志成2，周泓宇1，何少媚1，张 智3，穆云萍1，李芳红1, *，赵子建1,*（1.广东工业大学生物医药研究院，广东广州 510006；2.华南理工大学医学院，广东广州 510006；3.深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060）摘 要：基于pyrF 筛选标记和来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ，L. lactis ）的基因组DNA 为表达元件，构建L. lactis 食品级表达载体，用于食品和药用多肽的表达和生产。
首先，利用NZ3900 pyrF 基因列构建同源重组突变盒，构建NZ3900 ΔpyrF 突变株；然后，分别以来源于L. lactis 的repA 和repC 基因为复制元件、pyrF 基因为筛选标记、P 32和P 8为启动子、以及T usp 45和T pepN 为终止子，构建食品级表达质粒pLD ；最后以绿色荧光蛋白ZsGreen 为报告基因，验证ZsGreen 在NZ3900 ΔpyrF 突变株的表达及pLD-ZsG 的遗传稳定性。
乳酸菌表达系统的初步构建及应用的开题报告一、选题背景乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，在日常生活中被广泛应用于食品、保健品等领域。
乳酸菌在发酵过程中能够产生多种有益物质，如乳酸、酸化物质、营养物质等，具有较高的应用价值。
与此同时，乳酸菌还具有强大的免疫调节能力，可以调节人体免疫系统，提高人体免疫力。
因此，乳酸菌的应用领域日益扩大，对乳酸菌的深入研究和开发具有重要意义。
目前，乳酸菌的表达系统较为单一且表达效率低下。
为了提高乳酸菌的表达效率，构建一套高效的乳酸菌表达系统势在必行。
因此，本文拟从构建乳酸菌表达系统出发，进一步开展乳酸菌相关的研究。
二、研究内容1. 构建乳酸菌表达系统的基本框架本文将采用基因重组技术，构建乳酸菌表达系统的基本框架。
首先，设计合适的载体，包括酶切位点、启动子、终止子、选择标记等。
然后，将所需表达的基因克隆进载体，进行转化和筛选，最终确定表达成功的菌株。
2. 优化乳酸菌表达系统的表达效率目前乳酸菌表达系统的表达效率普遍较低，因此本文将进一步优化表达系统的表达效率，提高表达产物的产量和纯度。
具体的方法包括优化菌株、优化启动子和调整发酵条件等。
3. 应用乳酸菌表达系统本文将以乳酸菌表达系统为平台，进一步开展相关的研究和应用，如乳酸菌发酵产物的筛选和分析、乳酸菌与免疫系统的相互作用等。
三、研究意义本文的研究将有助于构建一套高效的乳酸菌表达系统，提高表达效率和纯度，为乳酸菌相关研究和应用打下基础。
同时，本文的研究将有助于深入研究乳酸菌在食品、保健品、药品等领域的应用，并为相关产品的研发提供技术支持。
在乳酸菌的开发和应用方面具有一定的实际意义和应用价值。
文章编号:1002-2694(2008)03-0224-05乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达孙强正,熊衍文,叶长芸,徐建国摘 要:目的 构建乳酸乳球菌(L actococcus lactis ,L lactis )食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA )。
方法 PCR 扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQZ ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA 成熟肽的编码序列nuc A 到pSQZ 中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/p SQZ 2nuc A ;采用TB 2D 法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA 活性。
结果 PCR 扩增得到us p 45基因片段,酶切、连接到载体pSH91中构建了食品级表达载体p SQZ;将扩增的nuc A 基因片段克隆入载体p SQZ 并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MBP71/pSQZ 2nuc A 。
在TB 2D 平板上,L lactis MBP71/p SQZ 2nuc A 克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/p SQZ 2nuc A 上清和菌体在18kDa 位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。
结论 成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA 在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。
关键词:乳酸乳球菌;食品级载体;分泌性表达;报告蛋白 中图分类号:R155.5 文献标识码:A Construction of a food 2grade secretion expression vectorand the expression of reporter protein in L actococcus l actisSUN Qiang 2zheng ,XION G Yan 2wen ,YE Chang 2yun ,XU Jian 2guo(S tate Key L aboratory f or inf ectious disease p revention and cont rol ,N ational I nstitute f or Comm unicable Disease Cont roland Prevention ,Chinese Center f or Disease Cont rol and Prevention ,B ei j ing 102206,China )A B S T RA C T :To construct a food 2grade secretion expression vector and its use in the expression of reporter protein nucle 2ase (NucA ),a f ragment ,Usp45,containing the coding sequence of promoter ,ribosomal binding site ,secretion signal and the cod 2ing sequence for 11pre 2amino acids was amplified by PCR using the genomic DNA of ctis M G1363,and then inserted into the food 2grade vector p SH91,thus to construct a secretion expression vector pSQZ.In addition ,the coding sequence of NucA (nucA )was also amplified f rom S tap hy lococcus aureus chromosome and inserted into vector p SQZ under the control with pro 2moter usp45to construct a recombinant plasmid p SQZ 2nucA.Nuclease plate activity and zymogram assays were to be used to detect the NucA activity in the secretion expression of ctis .It was demonstrated that the secretion expression vector sys 2tem ctis MBP71/pSQZ 2nucA was successively constructed through the processes mentioned above and the quantity of Nu 2cA secreted into cultural supernatants was greater that that in bacterial lysates.Because all the f ragments used to construct the vector pSQZ were obtained from food 2grade bacteria ,the vector pSQZ can be regarded as a food 2grade secretion expression vec 2tor.These data can be used as the foundation for the further study on the secretion expression of the protective antigen in the o 2ral vaccine. KE Y WOR DS :L actococcus lactis ;Food 2grade vector ;Secretion expression ;Reporter protein 通讯作者:徐建国,Email :xujg @ 作者单位:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206 乳酸菌(l actic aci d bacteri a ,L AB )是一类可发酵糖产生乳酸的细菌总称,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌等二十几个属,广泛用于食品工业,用来生产和保存乳制品及其他食品,被公认为是安全的食品级微生物(generally regarded as safe ,GRAS )。
以乳酸菌的模式菌乳酸乳球菌(L l actis )作为异源蛋白和酶的输送载体,成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点。
近年来,乳酸乳球菌的分子生物学研究取得了重大进展,其基因转化、克隆、筛选和突变技术已经建立〔123〕,某些菌株的全基因序列测定已经完成〔4〕,这为乳酸乳球菌表达系统的构建奠定了基础,一些乳酸乳球菌基因表达系统已经构建,用来表达抗原蛋白、细胞因子和生物酶等〔526〕。
但是,传统的乳酸乳球菌表达系统大多以抗生素抗性作为筛选标志,存在抗性基因横向转移的可能;另外,系统中还含有来源于病原微生物或非安全微生物DNA片段,具有潜在的危害,限制了其在食品及医药工业中的应用。
以来源于食品级微生物的DNA片段构建的食品级表达系统因其安全引起人们的重视。
乳酸乳球菌食品级表达系统必须具备以下基本条件:1、选择标志必须是食品级的;2、表达载体中的启动子、核糖体结合位点、终止子和分泌信号等功能性DNA片段必须来自食品级微生物;3、宿主菌的遗传特性清楚且稳定。
乳酸乳球菌表达的外源蛋白在细胞的定位有胞内、胞壁结合和分泌等形式。
分泌性表达具有诸多优点,如能及时将合成的外源蛋白输送到胞外,避免了被胞内蛋白酶降解;表达蛋白能够正确折叠,保持良好的生物学活性;同时,分泌性表达的蛋白(抗原或酶)可以直接与底物或肠道黏膜的免疫系统作用,无需下游的蛋白纯化操作。
为了实现分泌性表达,通常在表达目的蛋白的C端或N端融合一分泌信号肽,引导目的蛋白释放到胞外。
目前,在乳酸乳球菌表达系统中,乳酸乳球菌未知分泌蛋白(U sp45)的分泌信号肽编码序列常用于构建分泌表达载体,分泌性表达外源蛋白〔628〕。
本文以安全级微生物乳酸乳球菌MBP71△t hy A〔9〕作为宿主菌,在以t hy A基因作为选择标记的食品级质粒p SH91〔10〕中,克隆U sp45的启动子、核糖体结合位点、分泌信号肽和部分成熟肽的编码序列,构建了分泌性表达载体,实现报告蛋白Nu2 cA的分泌性表达。
1 材料与方法1.1 菌株、质粒、培养基和生长条件 E.coli X51 (L E392,Δt hy A)、金黄色葡萄球菌为本室保存;L. l actis M G1363由J an K ok教授惠赠;L.l actis MB P71(CHCC373,Δt hy A)由Martin B.Pedersen 博士惠赠;克隆载体pMD182T、感受态细胞 E.coli D H5а购自大连Ta KaRa公司;质粒p SH91由本室构建〔10〕。
E.coli X51、E.coli D H5а常规培养用LB培养基,37℃振荡培养;乳酸乳球菌常规培养在GM17培养基(M17培养基;Difco,0.5%葡萄糖),30℃静止培养;选择培养基CB T和改良SA培养基的配制见文献〔10〕;TB2D琼脂的配制见文献〔11〕;氨苄青霉素在大肠杆菌中的使用浓度为150μg/mL。
1.2 主要试剂及材料 限制性内切酶H i n dⅢ、X baⅠ、Taq DNA聚合酶购自华美公司;T4DNA 连接酶由美国Promeg公司提供;质粒抽提试剂盒为上海生物工程公司产品;DNA回收纯化试剂盒为Q IA GEN公司产品;鲑鱼精DNA购自SIGMA公司;其它化学试剂均为分析纯。
1.3 us p45片段的扩增 根据GenBank公布的L.l actis M G1363us p45基因序列(GenBank NC 009004)设计引物usp45U5’2CG A A GC T T GT G T T T T GT A A T CA T AAA GA23’(H i n dⅢ)和usp45L5’2C G T C T A GA C GCA TCT T GT T TA GCA A TA TC T GA G23(X baⅠ),以L.l actis M G1363染色体为模板,扩增us p45片段序列,包括us p45的启动子(-35、-10)、核糖体结合位点(rbs)、信号肽序列(S Pus p45)及U sp45成熟肽前11个氨基酸编码序列。
