构建食品级的重组乳酸乳球菌表达纳豆激酶

乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定谷贵章;宋达峰;顾青【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2006(16)6【摘要】目的：旨在构建一个将抗原靶向于乳酸乳球菌细胞表面的表达系统。

方法：运用PCR技术从金黄色葡萄球菌基因组中克隆出蛋白A（SPA）C-末端544个碱基对的锚定域序列（Spax）。

通过酶切、连接将Spax构建入分泌型质粒pAMJ399形成携有整合外源基因位点BglⅡ的pAMJ400质粒。

将报告蛋白一绿色荧光蛋白的基因（Gfp）插入载体pAMJ400的整合位点产生模式质粒pAMJ401并电转化其于乳酸乳球菌MG1363。

绘制转化子MGI363（pAMJ401）生长曲线确认诱导期。

调节pH值（6．0-6．5）诱导转化子并在荧光显微镜下观察杂合蛋白（GFP：SPAX）的表达情况。

结果：在395nm的蓝色激发光下，诱导后的细菌发出较明亮的绿色荧光，而未诱导的细菌几乎不产生荧光。

结论：成功地构建了乳酸乳球菌表面展示表达系统，此系统可以作为口服活菌疫菌研究的可行性操作平台。

【总页数】5页(P17-21)【关键词】乳酸乳球菌;表达系统;展示表达【作者】谷贵章;宋达峰;顾青【作者单位】浙江工商大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.构建及鉴定表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌 [J], 向荣;林艳;李晓曦;张欣;巩思嘉;赵子建3.乳酸乳球菌食品级表面表达系统建立和报告基因检测 [J], 庄重;季莉;徐莹莹;李珊珊;季玉红;段义农4.乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立 [J], 王长远;许凤;沈冰蕾;于长青;姚笛5.乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建及纳豆激酶基因的克隆的中期报告本报告旨在介绍基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建以及纳豆激酶基因的克隆的中期研究进展。

在本阶段的研究中，我们主要完成了以下内容：构建thyA基因敲除的乳酸乳球菌株、构建达系统、克隆纳豆激酶基因等。

一、构建thyA基因敲除的乳酸乳球菌株为了实现对thyA基因的敲除，我们采用了单交换子式重组技术。

首先，设计了thyA基因的上下游引物，并利用PCR扩增出目标片段。

然后，将扩增片段与质粒进行连接并转化到相应宿主菌中。

接下来，通过重组活性选择，筛选出了含有敲除thyA基因的乳酸乳球菌株。

通过PCR和测序验证，确认乳酸乳球菌thyA基因已成功敲除。

二、构建达系统为了实现纳豆激酶基因的高效表达，我们构建了基于thyA基因的乳酸乳球菌达系统。

首先，将thyA基因编码序列与表达载体进行连接，得到重组质粒。

然后，通过电穿孔法将重组质粒导入thyA基因敲除的乳酸乳球菌株中。

经过适当培养和筛选，成功获得了表达纳豆激酶基因的乳酸乳球菌株。

三、纳豆激酶基因的克隆为了克隆纳豆激酶基因，我们首先设计了基于已知序列的引物，并利用PCR扩增得到目标片段。

然后，将扩增片段与克隆载体进行连接，并转化到大肠杆菌中。

通过筛选和测序，成功获得了含有纳豆激酶基因的重组质粒。

进一步将重组质粒导入乳酸乳球菌中，得到能够高效表达纳豆激酶的乳酸乳球菌株。

四、中期研究进展在本阶段的研究中，我们成功构建了thyA基因敲除的乳酸乳球菌株，并建立了能够高效表达纳豆激酶基因的达系统。

同时，通过克隆获得了纳豆激酶基因的重组质粒并导入乳酸乳球菌中。

这些成果为后续的研究提供了坚实的基础。

总结：本中期报告介绍了基于thyA基因的乳酸乳球菌的达系统的构建以及纳豆激酶基因的克隆的中期研究进展。

通过构建thyA基因敲除的乳酸乳球菌株和建立达系统，我们成功实现了对纳豆激酶基因的高效表达。

这些研究结果为进一步的研究提供了重要的基础和方向。

文章编号:1002-2694(2008)03-0224-05乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达孙强正,熊衍文,叶长芸,徐建国摘　要:目的　构建乳酸乳球菌(L a ctococcus lactis ,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)。

方法　PCR 扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pS H91中,构建食品级分泌性表达载体p SQZ ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌Nuc A 成熟肽的编码序列nucA 到pSQZ 中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MB P71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA ;采用TB 2D 法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA 活性。

结果　PCR 扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pS H91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA 基因片段克隆入载体p SQZ 并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA 。

在TB 2D 平板上,L l actis MB P71/p SQZ 2nucA 克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ 2nucA 上清和菌体在18kDa 位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。

结论　成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA 在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。

关键词:乳酸乳球菌;食品级载体;分泌性表达;报告蛋白 中图分类号:R155.5　文献标识码:A Constr uct ion of a f ood 2gr ade secr et ion expr ession vectoran d the expression of r epor ter pr otein in Lact ococcus l actisSUN Qia ng 2zheng ,XION G Yan 2we n ,YE Chang 2yun ,XU Jia n 2guo(S tate Key L abora tor y f or i nf ectious dise ase prevention an d cont rol ,N a tiona l I nstitute f or Communica ble D isease Controla nd Pr evention ,Chinese Center f or D isease Cont rol a nd P revention ,Bei jing 102206,Chi na)AB S T RAC T :To const ruct a food 2gra de secretion e xpre ssion vector and it s use in the exp ression of repo rter protein nucle 2ase (Nuc A),a f ragment ,Usp45,containing the coding sequence of promoter ,ribosomal binding site ,secretion signal and the cod 2ing seque nce for 11pre 2amino acids was a mplif ied by PCR using t he ge nomic DNA of ctis M G 1363,and t hen inser te d into t he f ood 2gra de vecto r pSH91,t hus to constr uct a secretion exp ression vector pSQZ.In addition ,the coding sequence of NucA (nucA)was also amplified f rom St ap hyloco ccus a ur eus chromoso me and inser ted into vector p SQ Z under the control wit h pro 2mote r usp45to constr uct a recombina nt pla smid pSQZ 2nuc A.Nuclea se plate activ ity and zymogram assa ys we re to be used to detect the NucA activity in the secretion expression of ctis.It was demonstrated tha t the secretion expressio n vector sys 2tem ctis MB P71/pSQZ 2nuc A was successively const ructed thro ugh t he processe s mentioned a bove and the qua ntity of Nu 2cA sec reted into c ultural super natants wa s gr ea te r tha t t hat in bacterial lysates.Because all the fr agments used to co nstr uct the vector pSQZ we re obtained f rom food 2grade bacteria ,the vector pSQZ can be regarded as a food 2gra de secretion e xpre ssio n vec 2tor.These data can be used a s the foundation fo r the f urther st udy on t he secretion expression of t he protective antigen in t he o 2ral vaccine. KE Y W O RDS :L actoco ccus lactis ;Food 2gra de vector ;Secre tio n expr ession ;Repor te r protein 通讯作者徐建国,x j @ 作者单位中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京　6 乳酸菌(l act ic aci d bacteri a ,L AB )是一类可发酵糖产生乳酸的细菌总称,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌等二十几个属,广泛用于食品工业,用来生产和保存乳制品及其他食品,被公认为是安全的食品级微生物(generall y regarded a s safe ,GRAS)。

王帅，邓木兰，梁志成，等. 基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建[J]. 食品工业科技，2024，45（9）：124−130. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149WANG Shuai, DENG Mulan, LIANG Zhicheng, et al. Construction of a Food-grade Expression Vector Based on pyrF Gene in Lactococcus lactis [J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(9): 124−130. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149· 生物工程 ·基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建王　帅1，邓木兰1, +，梁志成2，周泓宇1，何少媚1，张　智3，穆云萍1，李芳红1, *，赵子建1,*（1.广东工业大学生物医药研究院，广东广州 510006；2.华南理工大学医学院，广东广州 510006；3.深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060）摘　要：基于pyrF 筛选标记和来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ，L. lactis ）的基因组DNA 为表达元件，构建L. lactis 食品级表达载体，用于食品和药用多肽的表达和生产。

首先，利用NZ3900 pyrF 基因列构建同源重组突变盒，构建NZ3900 ΔpyrF 突变株；然后，分别以来源于L. lactis 的repA 和repC 基因为复制元件、pyrF 基因为筛选标记、P 32和P 8为启动子、以及T usp 45和T pepN 为终止子，构建食品级表达质粒pLD ；最后以绿色荧光蛋白ZsGreen 为报告基因，验证ZsGreen 在NZ3900 ΔpyrF 突变株的表达及pLD-ZsG 的遗传稳定性。

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2007(47)4【摘要】以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H.首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-pepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48.然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H.利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot 分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应.【总页数】6页(P604-609)【作者】徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【作者单位】食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;中国科学院微生物研究所,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q93【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建 [J], 郭建军;袁林;曾静;魏国汶;杨一兵3.乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国4.食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国5.重组植物甜蛋白马宾灵的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统的构建 [J], 顾文亮;夏启玉;姚晶;胡新文;符少萍;郭建春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专利名称：一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：乔建军,薛二淑,吴昊,财音青格乐,宋倩倩,田开仁,支宁
申请号：CN201910091383.0
申请日：20190130
公开号：CN109652436A
公开日：
20190419
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种重组乳酸乳球菌菌株及其制备方法和应用，通过过表达murF基因得到重组乳酸乳球菌菌株。

构建菌株的方法：将乳酸乳球菌菌株的基因murF连接到质粒载体上，获得重组质粒；将重组质粒电转到乳酸乳球菌中，选取阳性转化子，获得重组菌株。

重组乳酸乳球菌菌株可提高菌株的耐酸性和乳酸链球菌素(Nisin)产量。

将原始菌株和过表达murF的菌株在发酵培养基中发酵12h，培养到8h时Nisin产量达到最大，过表达murF的菌株比原始菌株Nisin产量提高1.1～1.5倍，酸应激存活率提高1.1～1.7倍。

本发明的重组菌株对产物Nisin和菌株抗逆性有明显的影响。

其中Nisin 是一种安全无毒的食品防腐剂。

申请人：天津大学
地址：300350 天津市津南区海河教育园雅观路135号天津大学北洋园校区
国籍：CN
代理机构：天津市北洋有限责任专利代理事务所
代理人：琪琛
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纳豆激酶基因工程菌的构建及高密度发酵血栓引起的发病率和死亡率的比重越来越高,溶栓剂是治疗的最有效药物,但当前临床使用的溶栓剂都存在一些缺点,溶栓剂仍需要不断被开发和改进,尤其是预防性的食源性的溶栓剂很有必要。

纳豆激酶(nattokinase,NK)最早来自日本传统食品纳豆中,是由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,由aprN基因编码。

作为新型溶栓剂的代表,NK无免疫原性,不仅溶栓效果显著且安全无毒,正成为一种具有开发和利用价值的功能性食品。

生产NK的传统方式为固态发酵,尽管产量较高,但NK分离纯化步骤繁琐、酶活损失严重;采用基因工程菌液体发酵又可能存在产生包涵体、酶活性低的问题。

为提高NK的产量,本研究主要内容如下:(1)利用PCR技术扩增B.subtilis natto的aprN基因,并依据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,添加六个组氨酸片段便于纯化,构建了重组表达质粒pHT01-aprN1。

经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其序列的正确性。

通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprN1导入B.subtilis 168,利用氯霉素抗性筛选获得B.subtilis 168/pHT01-aprN1工程菌。

(2)探究IPTG和2,6-吡啶二羧酸用量、诱导温度、培养基浓度和接种量对酶活的影响,经摇瓶培养,采用四肽底物法检测最高酶活为289 U/mL(RSD%=1.1),酶活表达稳定性良好,是野生菌的3.9倍。

用镍柱纯化发酵上清液,经SDS-PAGE和Western-Blot验证得到电泳纯NK。

(3)为实现工业化生产,进行补料发酵实验,酶活达到4521.78IU/mL(RSD%=1.2),进一步优化补料方案,酶活达7778.5 IU/mL(RSD%=1.1)。

发酵液经硫酸铵沉淀的酶活回收率为89.02%。