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乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

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乳酸菌食品级基因表达系统

乳酸菌食品级基因表达系统

［ ］ 它由 "7CH,A+ 等 > 以此构建了一个乳酸菌食品级载体 &ST4，
乳酸乳 球 菌 一 个 质 粒 的 最 小 复 制 子、 乳球菌的赭石突变 （UCQ6A） 抑制基因 $/3( 及一段人工合成的含有 44 个限制酶 切点的多克隆位点组成。载体大小约 ?HK。当与嘌呤生物合 成途径中的基因发生赭石突变的宿主联合使用时， $/3( 便可 用作选择性标记。依照同样的策略， 用琥珀突变 （ -FKA6） 抑 制基因 $/3> 构建了可抑制嘧啶营养缺陷的一个食品级载体 &ST?33 。无义突变抑制基因较之其它食品级标记有许多 优点。它使用灵活， 可在多种培养基上进行选择； 其基因产 物是 @<-， 而不是蛋白质， 因此不会有酶活性或抑菌作用。 但 D@<- 抑制基因可能会导致多效效应， 这是它不利的因素。 ?@A 细菌素抗性或免疫性标记 ， 在乳酸乳球菌中发现有一些菌株不产乳链菌肽 （ <7J7E）
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营养缺陷型标记 这一类选择性标记是建立在 D@<- 抑制基因基础上的。
通过双交换使 含质粒的乳酸乳球菌 NI3$&7 的 染 色 体 上， 产生 F9C Q 表型。当将克隆有 ,+04 基因的质 ,+04 基因失活， 粒导入 ,+04 缺陷株时就恢复了 F9C R 表型。因为在乳糖中生 长需要乳糖操纵子编码的完整酶系， 其中包括由 ,+04 编码 的可溶性载体酶 ! GF9C 。因此， ,+04 基因就起选择性标记的 作用。编码 ,+04 的质粒可稳定地存在于这个乳酸乳球菌培 养物中。 乳杆菌中有少数株系可利用 L/木糖作为碳源， 而且与

乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展

乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展

综述与专治乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展张金宝1,乌云塔娜2(1.内蒙古扎兰屯农牧学校,内蒙呼伦贝尔162650;2.呼伦贝尔市新巴尔虎右旗畜牧局动物疫控中心,内蒙古呼伦贝尔162650)摘要:乳酸菌以其遗传工程可行并操作简单,在建立和研究乳酸菌食品级高效表达载体系统方面具有十分重要的实际意义。

本文对乳酸菌食品级高效表达载体系统的最近研究及其在外源基因表达方面的应用概况进行初步总结。

指出食品级乳酸菌工程及其表达产物可直接用于食品工业、医药和保健品等领域,是具有巨大应用前景的技术。

关键词:乳酸菌(LAB);食品级;表达载体系统中图分类号:T S201.6文献标识码:A文章编号:1004-6704(2008)06-0042-03The Food Grade Inducible Over ProductionExpression System of Lactic Acid BacteriaZH ANG Jin-Bao,WU Yun-tana(1.Zalantun F armets and Sc hools in I nner M ong oli,Zalan tun,I nner M ong li162650;2.X in baery ou qi ise ase Cintrol Ceter,Zanlantun,162650)Abstract:T he g enetic pro ject of the L actic A cid Bacteria(LA B)is simple o per ated。

T hat already w idely used in to ex press many other sour ces g ene.Study the Fo od-Gr ade Inducible Over-P roduct ion Ex pression System-of L actic Acid Bacteria hav e v ery impo rtant significance.In this paper,T here are preliminary co nclusio n the research o f t he Fo od-Gr ade Inducible O-v er-P roduct ion Expressio n Sy stem-o f Lactic Acid Bacter ia at r ecently and it's used in to ex press other g ene aspects.Key words:lactic acid bacter ia;fo od-gr ade;over-production;ex pression system乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一群革兰氏阳性厌氧细菌,能发酵碳水化合物(如葡萄糖),主要代谢产物是乳酸的各类细菌的统称。

乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定

乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定

乳酸乳球菌表面展示表达系统的构建及其鉴定谷贵章;宋达峰;顾青【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2006(16)6【摘要】目的：旨在构建一个将抗原靶向于乳酸乳球菌细胞表面的表达系统。

方法：运用PCR技术从金黄色葡萄球菌基因组中克隆出蛋白A（SPA）C-末端544个碱基对的锚定域序列（Spax）。

通过酶切、连接将Spax构建入分泌型质粒pAMJ399形成携有整合外源基因位点BglⅡ的pAMJ400质粒。

将报告蛋白一绿色荧光蛋白的基因（Gfp）插入载体pAMJ400的整合位点产生模式质粒pAMJ401并电转化其于乳酸乳球菌MG1363。

绘制转化子MGI363（pAMJ401）生长曲线确认诱导期。

调节pH值（6．0-6．5）诱导转化子并在荧光显微镜下观察杂合蛋白（GFP：SPAX）的表达情况。

结果：在395nm的蓝色激发光下，诱导后的细菌发出较明亮的绿色荧光，而未诱导的细菌几乎不产生荧光。

结论：成功地构建了乳酸乳球菌表面展示表达系统，此系统可以作为口服活菌疫菌研究的可行性操作平台。

【总页数】5页(P17-21)【关键词】乳酸乳球菌;表达系统;展示表达【作者】谷贵章;宋达峰;顾青【作者单位】浙江工商大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.构建及鉴定表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌 [J], 向荣;林艳;李晓曦;张欣;巩思嘉;赵子建3.乳酸乳球菌食品级表面表达系统建立和报告基因检测 [J], 庄重;季莉;徐莹莹;李珊珊;季玉红;段义农4.乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立 [J], 王长远;许凤;沈冰蕾;于长青;姚笛5.乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展

基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展

基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展刘琼^*2，陈宏亮2 ,姜延龙2 ,王春凤2收稿日期：2018—05—03基金项目：国家十三五重点研发计划项目(2017YFD0501000)； 国家自然科学基金项目(31602092，31272552，31272541 )；吉林省科技发展计划项目(20160519011JH,20170204034NY,20180201040NY)(吉林省教育厅科技研究项目(2016120)(吉林工程技术师范学院校级科 研项目(2016)作者简介:刘琼(1980 -)，女，实验师，博士，研究方向为动物微生态与黏膜免疫学，E-mail ： liuqiong@jlenu. edu. cn通讯作者：王春凤,E-mail ：wangchunfeng@ jlau. edu. cn[35] 李海燕，方肇勤，梁尚华.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗肿瘤中的应用[J ].中国中医基础医学杂 志，2000, 6(1) ：27—29.[36] 姚明，杨建平，王丽娜，等.腹水传代与体外培养Walker 256癌细胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性[J ].中华医学杂志，2008, 88(13) ：880-884.[37] 王红卫，卓忠雄，赵树文，等.大鼠Walker-256皮下移植瘤模型的建立及其超声评价* J ] •临床超声医学杂志，2007, 9(2) ：68—71.[38] Mandio R , Diinne A A , Eikelkamp N , et al. Expression of MMP 一3, MMP 一 13 , TIMP -2 and TIMP -3 in the VX2 carcinoma of the New Zealand white rabbit [ J +. Anticancer Research , 2002, 22(6A )：3 281.[39] Jiu AH , Xu H X , Liu W J , ei al Anti-tumor effect ot Rhapontic-um uniUorum in H22-bearing mica [ J +. chin J Exp Tradit MedForm (中国实验方剂学杂志),2011,17(5) ：165—167.[40] 赵方，胡明道，陈鹏.小鼠肝癌原位移植模型的建立及其研(1.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052 ； 2.吉林农业大学动物科学技术学院 吉林省动物微生态制剂工程研究中心 教育部动物生产和产品质量安全重点实验室，吉林长春130118中图分类号：Q78文献标志码:A乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的兼性厌氧菌总称，包括乳球菌、乳杆菌、链球菌、片球菌和双歧杆菌等，美国食品和药品监督管理局 (FDA )将许多乳酸菌定义为“食品级”微生物，极少 数如化脓性链球菌，肺炎链球菌是致病菌。

乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达

乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达

文章编号:1002-2694(2008)03-0224-05乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达孙强正,熊衍文,叶长芸,徐建国摘　要:目的　构建乳酸乳球菌(L a ctococcus lactis ,L lactis)食品级分泌表达载体,表达报告蛋白核酸内切酶(NucA)。

方法　PCR 扩增乳酸乳球菌未知分泌蛋白(Usp45)编码基因的启动子、核糖体结合位点、分泌信号和成熟肽前11个氨基酸编码序列,克隆到载体pS H91中,构建食品级分泌性表达载体p SQZ ;克隆报告蛋白金黄色葡萄球菌Nuc A 成熟肽的编码序列nucA 到pSQZ 中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MB P71,构建乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA ;采用TB 2D 法和酶谱法检测乳酸乳球菌分泌性表达的NucA 活性。

结果　PCR 扩增得到usp45基因片段,酶切、连接到载体pS H91中构建了食品级表达载体pSQZ;将扩增的nucA 基因片段克隆入载体p SQZ 并转化乳酸乳球菌,得到乳酸乳球菌分泌性表达系统L lactis MB P71/pSQZ 2nucA 。

在TB 2D 平板上,L l actis MB P71/p SQZ 2nucA 克隆子周围出现橙色光晕;在酶谱检测中,L lactis MBP71/pSQZ 2nucA 上清和菌体在18kDa 位置均有橙色条带,但上清条带亮度和宽度大于菌体。

结论　成功构建了乳酸乳球菌食品级分泌表达系统,实现了报告蛋白NucA 在乳酸乳球菌中分泌性表达,为进一步保护性抗原的分泌性表达研究奠定了基础。

关键词:乳酸乳球菌;食品级载体;分泌性表达;报告蛋白 中图分类号:R155.5　文献标识码:A Constr uct ion of a f ood 2gr ade secr et ion expr ession vectoran d the expression of r epor ter pr otein in Lact ococcus l actisSUN Qia ng 2zheng ,XION G Yan 2we n ,YE Chang 2yun ,XU Jia n 2guo(S tate Key L abora tor y f or i nf ectious dise ase prevention an d cont rol ,N a tiona l I nstitute f or Communica ble D isease Controla nd Pr evention ,Chinese Center f or D isease Cont rol a nd P revention ,Bei jing 102206,Chi na)AB S T RAC T :To const ruct a food 2gra de secretion e xpre ssion vector and it s use in the exp ression of repo rter protein nucle 2ase (Nuc A),a f ragment ,Usp45,containing the coding sequence of promoter ,ribosomal binding site ,secretion signal and the cod 2ing seque nce for 11pre 2amino acids was a mplif ied by PCR using t he ge nomic DNA of ctis M G 1363,and t hen inser te d into t he f ood 2gra de vecto r pSH91,t hus to constr uct a secretion exp ression vector pSQZ.In addition ,the coding sequence of NucA (nucA)was also amplified f rom St ap hyloco ccus a ur eus chromoso me and inser ted into vector p SQ Z under the control wit h pro 2mote r usp45to constr uct a recombina nt pla smid pSQZ 2nuc A.Nuclea se plate activ ity and zymogram assa ys we re to be used to detect the NucA activity in the secretion expression of ctis.It was demonstrated tha t the secretion expressio n vector sys 2tem ctis MB P71/pSQZ 2nuc A was successively const ructed thro ugh t he processe s mentioned a bove and the qua ntity of Nu 2cA sec reted into c ultural super natants wa s gr ea te r tha t t hat in bacterial lysates.Because all the fr agments used to co nstr uct the vector pSQZ we re obtained f rom food 2grade bacteria ,the vector pSQZ can be regarded as a food 2gra de secretion e xpre ssio n vec 2tor.These data can be used a s the foundation fo r the f urther st udy on t he secretion expression of t he protective antigen in t he o 2ral vaccine. KE Y W O RDS :L actoco ccus lactis ;Food 2gra de vector ;Secre tio n expr ession ;Repor te r protein 通讯作者徐建国,x j @ 作者单位中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京　6 乳酸菌(l act ic aci d bacteri a ,L AB )是一类可发酵糖产生乳酸的细菌总称,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌等二十几个属,广泛用于食品工业,用来生产和保存乳制品及其他食品,被公认为是安全的食品级微生物(generall y regarded a s safe ,GRAS)。

重组乳酸乳球菌表达外源蛋白的研究进展

重组乳酸乳球菌表达外源蛋白的研究进展
载 体 ，Ｇ ｕ ｃ ｈ ｔ ｅ等构 建 了 第 二个 组 成 型 表 达 载体 ｐ ＭＧ３ ６ ｅ ， 该 载 体 是 目前 应 用 较 多 的 一 个 典 型 组 成 型 表 达 载 体 。 ｐ ＭＧ ３ ６ ｅ载体 包括 Ｐ ３ ２强 启动 子 、红霉 素 和氯 霉 素抗 性 基 因 、ｐ ｒ ｔ ｐ转录 终止 子 以及 ｐ ＷＶ ０ １复 制子 【 ３ ＿ 。ｐ ＭＧ ３ ６ ｅ载 体 也 能在 大肠杆 菌 、枯 草杆 菌和乳 酸杆 菌 中复制 ，将 大肠 杆
细菌生 长与 外源基 因高效 表达 分开 。针对 此 问题发 展起 一
１ Ｌ ． １ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ表 达 系 统
１ ． １ Ｌ ． １ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ组成 型 表达 系统 组 成型表 达 载体 一般 由启
系列 适合 Ｌ ． １ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ的诱 导表 达 系统 ，通过 对 诱 导 物或 诱 导
第３ ６卷 第 ３ 期
２ ０ １ ４ 年 ３月
中 国 预
防 兽
医 学 报
Ｖｏ １ ． ３ ６ ． ＮＯ ． ３
Ｍａ Ｔ ． ２０１ ４
Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
Ｌ ． １ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ大 部分 启 动 子 是 随机 从基 因 组文 库 中分 离 出 来 ， 并 带 有 氯 霉 素抗 性 的报 告 基 因 ｃ ａ ｔ ． ８ ６ 。 目前 己分 离 Ｐ ２ １ 、 Ｐ ２ ３ 、Ｐ ３ ２ 、Ｐ ４ ４和 Ｐ ５ ９等组 成型 启动 子 ，根据 氯霉 素 乙酰
进 营养 物质 吸收及 增强 免疫 力等功 能 ，对维持 机体 健康 具 有 重要 作用 。近年 来乳 酸菌 基因工 程取 得重 大进展 ，乳酸 菌 作为 一种 新 型宿 主 菌用 来表 达 外源 蛋 白已在生 物 医药 、 食 品工 业和 畜牧兽 医等 领域 备受关 构 建 了 Ｌ ． １ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ 第一 个 组成 型 表 达

基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

王帅，邓木兰，梁志成，等. 基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建[J]. 食品工业科技，2024，45（9）：124−130. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149WANG Shuai, DENG Mulan, LIANG Zhicheng, et al. Construction of a Food-grade Expression Vector Based on pyrF Gene in Lactococcus lactis [J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(9): 124−130. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060149· 生物工程 ·基于pyrF 的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建王　帅1，邓木兰1, +，梁志成2，周泓宇1，何少媚1，张　智3，穆云萍1，李芳红1, *，赵子建1,*（1.广东工业大学生物医药研究院，广东广州 510006；2.华南理工大学医学院，广东广州 510006；3.深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060）摘　要：基于pyrF 筛选标记和来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ，L. lactis ）的基因组DNA 为表达元件，构建L. lactis 食品级表达载体，用于食品和药用多肽的表达和生产。

首先，利用NZ3900 pyrF 基因列构建同源重组突变盒，构建NZ3900 ΔpyrF 突变株；然后，分别以来源于L. lactis 的repA 和repC 基因为复制元件、pyrF 基因为筛选标记、P 32和P 8为启动子、以及T usp 45和T pepN 为终止子，构建食品级表达质粒pLD ；最后以绿色荧光蛋白ZsGreen 为报告基因，验证ZsGreen 在NZ3900 ΔpyrF 突变株的表达及pLD-ZsG 的遗传稳定性。

乳酸乳球菌表达系统的研究进展_王永刚

在医药卫生领域乳酸乳球菌主要作为疫苗递呈的 活载体表达目的蛋白 。 李鹏成等人 以 ［15］ 乳酸乳球菌肽 聚 糖 锚 钩 蛋 白 （Protein anchor， PA） 为 研 究 对 象 ， 构 建 原 核 表 达 载 体 并 进 行 表 达 ， 获 得 PA 融 合 蛋 白 ， 为 该蛋白多克隆抗体制备及与目的抗原的融合表达等相 关研究奠定了基础。 龚芳红等人 成 ［16］ 功构建了表达 H. pylori HspA 的 重 组 乳 酸 乳 球 菌 MG1363， 为 进 一 步 口 服疫苗的相关研究奠定了基础 。 李轶 杰等人 对 ［17］ 基因 修饰乳酸乳球菌作为药物发送载体系统治疗黑色素 瘤进行了初步探索， 发现静脉发送携带治疗性分子 的乳酸乳球菌能靶向实体肿瘤组织定殖并抑制肿瘤 的生长。
图 1 NICE 系统蛋白表达示意图
2 乳酸乳球菌表达系统的应用
乳酸乳球菌是肠道内的常见菌种， 其作为一种食 品级的安全微生物已越来越受到科研工作者的青睐。 目前对乳酸乳球菌应用最多的是食品工业和医药行 业。 2.1 L. lactis 表达系统应用于食品工业
目前， 构建乳酸菌乳球菌食品级载体-受体系统， 寻找一些在乳酸乳球菌中的克隆和表达中有价值的基 因已成为乳酸菌分子遗传学研究的趋势并在食品研究 和生产领域具有重大意义。 乳酸菌食品级高效表达系 统 （NICE） 是 现 阶 段 应 用 最 广 的 高 效 诱 导 表 达 系 统 ， 由 于 NICE 系 统 的 诱 导 剂 、 宿 主 菌 和 载 体 都 是 安 全 的 食品级的， 其应用前景相当广阔。 如若在该系统中加 入诱导物乳链菌肽后诱导率可达 1 000 倍以上 。 ［12-13］ 因 此， 在可控蛋白的生产中该系统是首选表达系统， 同 时在生产表达时该系统具有良好的安全性， 所以可用

“食品级”乳酸菌表达载体系统的研究进展

世 纪末就 已经 公布 了乳 酸乳 球 菌（ ｌ ｔ）的基 因组 序 列 ， Ｌ＿ｃ ｓ ａｉ
目前 ，多数外源基 因的 克隆与表 达 ，主要 采用 大肠杆
菌 。然 而 ，由于大 肠杆 菌能够 引起 人类 和动物发 生不 同程 度的腹 泻 ，导致机 体损伤 ，所 以其表达产物 需要经 过复杂
整 合 到一 株 敲 除质粒 的 Ｌ１ｃ ｓ ５ ７ ． ｔ ａ ｉ ＭＧ ２６的染 色体 上 ，并
通过 双交 换使 ｌｃ ａＦ基 因 失活 ，结 果 该菌 株不 能 利用 乳糖
（ ａ‘ Ｌ ｃ 。然 后再将克 隆有 ｌｃ ） ａＦ基因 的质 粒转到上 述菌株 中 ，
的分离纯 化才能达 到食 品医药标 准 。与之 相比 ，乳酸菌作
随 即也展开 了对其 他乳 酸菌基 因组 序列 的研究 【，旨在 通 ７ ］ 过揭 示乳酸菌 遗传背景 的基础 上 ，为相 关方面 的研究提供 更新 的理论依 据和操作 平 台。国内外 的学者业 已从疫苗研 究及 应用和体 外发酵工 程的可持 续发展 角度 出发 ，构建 了
为选择 压力的乳酸 菌表达 载体 ｐ ２ｔ ，Ｔ ｋｌ Ｗ４ ５ｔ ａａ ａ等构 建 的
以乳 糖合 成酶 为 选择 压 力乳 酸菌 表 达 载体 ｐ Ｅ ６ ０ｓ 。 Ｌ Ｂ ０ ｔ等 ］
Ｄ 木 糖和蔗糖 选择标 记 。 ，
１１１ 乳糖 选 择标 记 ：ＭａＣ ｒ ｃ ．． ｃ ｏｍｉ ｋ等将 完整 乳糖 操 纵子
“ 品级 ＂乳酸 茵表 达载体 系统 的研 究进展 食
郝凤 奇 ，杨 桂 连 ，叶 丽 萍 ，王春 凤
（ 吉林农业 大学 动物 科技学 院动物 微生态 学研 究室 ，吉林 长 春 １０ ） ３ １８ １
中图 分 类 号 ：Ｑ９ ９１ ８ ３ ．１

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达


表 1 合成的引物序列及限制性酶切位点
Primer PA1 P2 PV1 PV2 PO1 PO2 PO3 PO4
Table 1 Primer sequence and size
Sequence (5′→3′)
Enzyme site
GCCTCTAGAATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAAT
47 卷 4 期 2007 年 8 月 4 日
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
47 (4) : 604～609 4 August 2007
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
徐 波1 ,曹郁生1 3 ,陈 燕1 ,郭兴华1 ,2
(1食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德联合研究院 南昌 330047) (2中国科学院微生物研究所 北京 100080)
Xba Ⅰ
TAATCTAGAGCTAGCTTGATTGTTCTATCGAAAGCGAAATCA Nhe Ⅰ
AGCCATGGAACCGAACTTAATGGGAGG
Nco Ⅰ
GAAGCTAGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGA
Nhe Ⅰ
ATCGCCATGGGTTGTCATCGGCTCGCTGGTTGC
当aaga基因克隆到其他不能发表达原理以载体praf800pnz8048和pve5524prna48和细胞壁锚定诱导表达载体prnv48用于prnv48均为e型复制的翻译融合型载体分别含有的工作中构建了铜绿假单胞菌oprfoprh的融合外合基因克隆入prna48和prnv48中对诱导方法当l1actisnz9000prna48oprfh和l1actisnz9000prnv48oprfh培养至对数期时分别加入10ngml和1ngml诱导剂nisin使细菌的生长与的代谢负荷位于nisa启动子下游的oprfh基因被激活转录表达出所需的oprfh融合蛋白
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47 卷 4 期 2007 年 8 月 4 日
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
47 (4) : 604～609 4 August 2007
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
徐 波1 ,曹郁生1 3 ,陈 燕1 ,郭兴华1 ,2
(1食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德联合研究院 南昌 330047) (2中国科学院微生物研究所 北京 100080)
Xba Ⅰ
TAATCTAGAGCTAGCTTGATTGTTCTATCGAAAGCGAAATCA Nhe Ⅰ
AGCCATGGAACCGAACTTAATGGGAGG
Nco Ⅰ
GAAGCTAGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGA
Nhe Ⅰ
ATCGCCATGGGTTGTCATCGGCTCGCTGGTTGC
Nco Ⅰ
ATCGAAGCTTTCGGTGCTGGCGTTGGTG
Hind Ⅲ
ATCGGTCGACGTTGTCATCGGCTCGCTGGTTGC
Sal Ⅰ
ATCGGATATCTCGGTGCTGGCGTTGGTG
EcoR Ⅴ
113 食品级表达载体的构建和 OprFΠH的诱导表达 分子生物学的常规操作参照文献[ 13 ]及有关产
品的说明书进行 。 以 pNZ8048 为 模 板 用 引 物 PA1 和 PA2 扩 增
PnisA2MCS2TpepN ,回收 、纯化 PCR 产物 , Xba Ⅰ酶切后 , 与用 Xba Ⅰ酶切并去磷酸化的 pRAF800 载体连接 , 转化入 L . lactis NZ9000[14] ,由于 pRAF800 含有食品 级选择标记 α2aga ,因此可根据发酵蜜二糖的特征 筛选重组子[9] ,经克隆子鉴定 ,得到的乳酸菌食品级 细胞 内 诱 导 表 达 载 体 命 名 为 pRNA48 。然 后 以 pVE5524 为 模 板 , 用 引 物 PV1 和 PV2 扩 增 S PUsp452 nucA2CWAM62t1t2 ,回收 、纯化 PCR 产物 , Nco Ⅰ和 Nhe Ⅰ酶切后 ,与用 Nco Ⅰ和 Nhe Ⅰ酶切的载体 pRNA48 连接 ,电转化法转入 L . lactis NZ9000 中 ,经食品级 标记筛选和克隆子鉴定 ,获得的乳酸菌细胞壁锚定 诱导表达载体命名为 pRNV48 。以 p GEX2OprFΠH 为 模板 ,用引物 PO1 和 PO2 、PO3 和 PO4 扩增出 OprFΠ H 基因 ,分别克隆入载体 pRNA48 和 pRNV48 中 ,用 电转化法将重组载体转入 L . lactis NZ9000 中 ,经筛 选和克隆子鉴定 ,获得重组载体 pRNA482OprFΠH 和 pRNV482OprFΠH。
乳酸菌食品级高效表达系统 NICE (the nisin2 controlled expression ,NICE) 系统是一个乳酸菌中应用 广 、可控性强的表达系统 ,它是在乳链菌肽 ( nisin) 诱导下由 nisA 启动子控制目的基因表达的 ,含 nisR 和 nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统 。 该系统在加入诱导物2乳链菌肽后其诱导效率可达 1000 倍以上 。由于 NICE 系统的诱导剂 、宿主菌和 载体都是食品级的 ,具有良好的安全性 ,因此该系统
由于 pNZ8048 含有 nisA 启动子 、多克隆位点和 终止子的基因片段 PnisA2MCS2TpepN [11] ,pVE5524 含有 信号肽 Usp45 、报告基因 nucA 、细胞壁锚锭子 M6 和 终止子的基因片段 S PUsp452nucA2CWAM62t1t2[12] ,根据 已报道的 PnisA2MCS2TpepN 、S PUsp45 2nucA2CWAM6 2t1 t2 和 OprFΠH[8] 基因序列 ,设计相应的上游和下游引物 , 分别引入酶切位点 (用下划线标出) ,见表 1 。引物 均由上海生物工程技术服务有限公司合成 。PCR 扩 增[11] 反应结束后 ,取 PCR 产物作琼脂糖凝胶电泳进 行分析 。
表 1 合成的引物序列及限制性酶切位点
Primer PA1 P2 PV1 PV2 PO1 PO2 PO3 PO4
Table 1 Primer sequence and size site
GCCTCTAGAATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAAT
徐 波等 : 乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达. Π微生物学报 (2007) 47 (4)
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试剂盒购自 Promega 公司 ;质粒提取试剂盒 、DNA 回 收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司 ;蜜二糖 、 乳链球菌肽 ( nisin) 、完全福氏佐剂及不完全福氏佐 剂均为 Sigma 公司产品 ,其余常用试剂均为国产或 进口分析纯 。2400PCR 扩增仪 ( PE 公司) ; FR200 凝 胶成像仪 ( 上海复日公司) ; 3K18 台式冷冻离心机 (Sigma 公司) ;紫外分光光度计 ( Pharmacia Biotech 公 司) ;电转化仪 (Bio2Rad 公司) 。 11112 菌株、质粒和培养基 : ①质粒 pNZ8048 、乳酸 乳球菌 NZ9000 ( L . lactis NZ9000) 由荷兰 NIZO Food Research 惠赠 ; 质粒 pRAF800 由加拿大 Laval 大学 Moineau 博士惠赠 ;质粒 pVE5524 由法国 INRA 中心 J . C. Piard 博士惠赠 ;质粒 p GEM2OprFΠH 为本实验室 构 建 。 ② 铜 绿 假 单 胞 菌 菌 株 ( Pseudomonas aeruginosa ) CMCC10104 、CMCC10120 、CMCC10122 、 CMCC10125 购自中国药品生物制品检定所 。 ③培养 基 : GEL1 液体培养基 ( EL1 培养基[9] 中含 015 %葡萄 糖) ; GM17 液体培养基 (M17[10] 培养基中含 015 %葡 萄糖) ; SMM17MC 培养基 (M17 中含 015molΠL 蔗糖 , 20mmolΠL MgCl2 ,2mmolΠL CaCl2 和 015 % Melibiose) ; Mel2EL1 培养基 ( EL1 中含 40mgΠL 溴甲酚紫和 0. 5 % Melibiose) 。 11113 实验动物 :日本大耳白兔 (购自江西劳动卫 生职业病研究所实验动物中心) 。 112 引物设计和 PCR 扩增
摘 要 :以 α2aga 基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统 ,并用 这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因 OprFΠH。首先以 pRAF800 和 pNZ8048 构建了含有 α2aga 、 PnisA2MCS2TpepN 和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体 pRNA48 ,再以 pRNA48 和 pVE5524 为出发载体 构建了含有 α2aga 、PnisA2S PUsp452nucA2CWAM62t1t2 和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体 pRNV48 。然后 以食品级载体 pRNA48 和 pRNV48 为基础 ,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的 表达质粒 pRNA482OprFΠH 和 pRNV482OprFΠH。利用 nisin 进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达 ,通过 SDS2PAGE 和 Western blot 分析 ,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的 916 %和细胞壁锚定蛋白的 918 % ,表达产物具有免疫 原性 ,可与含 OprFΠH 的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应 。 关键词 : 乳酸乳球菌 ; 食品级载体 ; 诱导表达系统 ; 融合外膜蛋白 中图分类号 :Q786 ;Q93 文献标识码 :A 文章编号 :000126209 (2007) 0420604206
是可控制的蛋白质生产的理想的系统 ,其应用前景 十分广阔[5 ,6] 。
铜绿假单胞菌 ( Pseudomonas aeruginosa) 是一种 重要的常见的条件致病菌 ,是医院内感染的主要病 原 。铜 绿 假 单 胞 菌 的 外 膜 蛋 白 ( outer membrane protein ,Oprs) 在物质的跨膜转输中起着重要的作用 , 也是重要的抗原成分 ,近年来有许多利用外膜蛋白 组分如 OprF ,OprI 或其融合蛋白制备疫苗的研究 , 并在应用中取得了可信的结果 。在以前的工作中 , 本实验室构建了铜绿假单胞菌 OprFΠH 融合基因和 表达质粒 p GEX2OprFΠH , 用 E1 coli 成功地表达了 OprFΠH ,并对重组融合蛋白的免疫原性以及免疫保 护性进行了初步研究[7 ,8] 。本研究中以 α2aga 基因 为食品级选择标记 ,构建乳酸乳球菌食品级高效诱 导细胞内表达和细胞锚定表达系统 ,利用该系统对 铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因 OprFΠH 进行了表 达 ,并对表达蛋白的免疫原性进行了初步研究 。
1 材料和方法
111 材料 11111 主要试剂和仪器 : DNA 限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 ; T4 DNA 连接酶 、CIAP、PCR 产物纯化
基金项目 :江西省自然科学基金 (0330044) 3 通讯作者 。Tel : 86279128327754 ; Fax : 86279128333708 ; E2mail : yyssccc @hotmail . com 作者简介 :徐 波 (1970 - ) ,男 ,江西南昌人 ,博士 ,研究方向为食品生物技术 。E2mail : xubo583 @sohu. com 收稿日期 :2006212229 ;接受日期 :2007203222 ;修回日期 :2007205224
乳酸菌 (lactic acid bacteria ,LAB) 广泛存在于自 然界 ,是人和动物正常菌群的主要成员 ,因其重要的 生理功能和公认的安全性 ,在医药和食品工业中有 着广泛的应用 。随着分子生物学的发展 ,乳酸菌的 功能和应用得到进一步开拓 。乳酸菌的分子修饰和 改造需要适于食品和医药要求的遗传元件 ,包括载 体 、选择标记和信号序列等 。这意味着用于构建重 组子的所有基因成分应当来自安全的微生物 ,由于 食 品 用 的 乳 酸 菌 、酵 母 等 一 般 认 为 是 安 全 的 (generally regarded as safe , GRAS) [1～4] ,因而受到广泛 地注意 。研究与开发乳酸菌食品级载体2受体系统 , 探索重要基因在乳酸菌中的克隆表达已成为乳酸菌 分子生物学研究的热点 ,这对于食品与发酵工业将 是一个创新和推动 。