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食品级表达系统研究进展食品级表达系统被定义为一套包括宿主和表达载体在内的安全的、完整的表达系统，这个表达系统所涉及到的材料和技术，包括菌株(必须来自食品级微生物GRAS)、DNA、转化和表达所使用的材料、选择标记和培养、表达条件等都必须是对环境、对人体无任何毒副作用的、可以被食品工业接受和认可的[1-3]。
自从这个定义被提出后，近年来关于食品级基因工程表达系统的研究日益增多，其中研究的最多的是食品级乳酸菌表达系统。
乳酸菌是食品微生物的重要成员，是一类对人和动物健康有益的细菌，属于GRAS微生物。
最近十多年来，乳酸菌表达系统的研究取得长足进步。
其中食品级表达系统更是重要的研究热点。
食品级表达系统是一种不依靠传统抗生素标记选择的表达系统，这类表达系统具有以下三个特点：（1）载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段，传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定功能性抗生素抗性的基因，虽然为遗传操作时保持一定的选择压力，对载体的选择作用是有效的，但将抗生素抗性基因投放到环境或人和动物体内，由于抗性因子的转移，将可能引起生物安全性问题，因此，带有抗性基因的表达系统是不能在食品中应用。
（2）表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物，如乳酸菌及其他已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株；（3）诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤等可被人食用的物质。
目前主要作为基因工程菌的有乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。
大量的克隆和表达载体被研究开发来改善基因工程乳酸菌的性能，这些基因工程乳酸菌在奶制品和食品发酵等方面有非常大的应用前景。
然而，抗生素标记的存在使得这些基因工程乳酸菌有潜在的不安全性，因此近几年来发展了许多食品级乳酸菌表达系统，目前主要有4种方法构建食品级乳酸菌表达系统。
第一种方法是采用非抗生素抗性选择标记来构建食品级乳酸菌表达系统。
应用于乳酸菌的非抗生素抗性选择标记包括显性选择标记和营养缺陷型标记。
制备酵母菌表面展示载体材料的操作步骤酵母菌表面展示载体材料的制备操作步骤酵母菌表面展示是一种常用的蛋白质表达系统，可用于研究蛋白质功能、相互作用以及疫苗开发等。
制备酵母菌表面展示载体材料是实现这一系统的关键步骤之一。
下面，我将为您详细介绍制备酵母菌表面展示载体材料的操作步骤。
步骤1：选择合适的酵母菌表面展示载体针对不同的研究目的，我们可以选择不同的酵母菌表面展示载体。
常用的载体包括pYD1、pCTCON2、pYSG416和pYSG430等。
在选择载体时，需要考虑载体的复制起始子、选择性标记、载体大小和目标蛋白的表达效率等因素。
步骤2：获得酵母菌表面展示载体材料可以通过购买或者与其他研究人员交换来获得所需的酵母菌表面展示载体材料。
确保所获得的材料是经过验证和纯化的，以确保后续实验的可靠性和重复性。
步骤3：构建酵母菌表面展示载体将获得的酵母菌表面展示载体材料转化到酵母菌细胞中。
常用的转化方法有化学法和电转化法。
可以根据实验室的具体情况选择适合的转化方法。
转化后，通过选择性培养基筛选得到转化的阳性菌落。
步骤4：酵母菌表面展示载体的验证通过PCR或者其他方法验证阳性菌落中是否存在所需的酵母菌表面展示载体。
PCR是一种常用的验证方法，可以利用载体上的特异引物进行扩增，得到预期大小的片段。
步骤5：培养酵母菌表面展示载体阳性菌落选取验证通过的阳性菌落进行扩大培养。
在选择培养基中加入适当的选择性标记物（如抗生素），以确保只有带有酵母菌表面展示载体的菌落能够生长。
步骤6：表达目标蛋白通过添加诱导剂（如甲基邬磷酸钠，MeOH）或者调整培养条件（如温度、pH）来诱导酵母菌表达目标蛋白。
在培养一定时间后，可以通过离心将菌体收集。
步骤7：定量目标蛋白的产量可以通过Western blotting、ELISA、流式细胞术等方法来定量表达的目标蛋白的产量。
这些方法可以根据实验室的具体设备和需求选择合适的方法来进行定量。
步骤8：检测酵母菌表面展示的目标蛋白使用特异性抗体或适应性免疫方法，如流式细胞术、荧光显微镜等，来检测酵母菌表面展示的目标蛋白。
绿色荧光蛋白酿酒酵母表达系统的建立祁浩;刘新利【摘要】利用质粒YEplac112为骨架,在其多克隆位点HindIII和EcoRI之间插入水母绿色荧光蛋白（ GFP ）开放阅读框上下游约1 kb 左右的DNA序列,得到YEplac112－CT质粒,在其多克隆位点 PstI和 BamHI 之间插入750bp左右的GFP DNA序列,构建表达质粒YEplac112－C－GFP－T,以酿酒酵母W303为宿主,通过报告基因GFP验证了所构建的表达载体具有便捷筛选及良好的表达效果。
【期刊名称】《齐鲁工业大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2016(030)003【总页数】4页(P24-27)【关键词】绿色荧光蛋白 GFP 质粒表达【作者】祁浩;刘新利【作者单位】齐鲁工业大学生物工程学院,山东济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q89酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种常规酵母，与毕赤酵母（pichia pastoris）及粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）等一样，被美国FDA界定为“一般认为安全的”（GRAS）微生物范畴；作为细胞工厂，较容易地被行业内及公众广泛接受［1-3］。
因其在异源蛋白质表达方面表现出良好的翻译后折叠、修饰及分泌等性能，酿酒酵母已经被开发为医药蛋白的表达宿主；到目前，提供了数十种重组蛋白、多肽类药物［4-5］。
医药蛋白的开发或是合成生物学研究，首要问题是寻找检测目的蛋白是否表达及其表达量的直观简单方法。
宿主与筛选标记的配合使用，仍然是一个外源基因进入宿主得到预期表达必不可少的步骤［6-7］。
在酵母家族中，绿色荧光蛋白的应用非常经典，绿色荧光蛋白是46年前从多管水母体内发现的，它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光［8-9］。
由于其稳定的结构和光物理性质，又易于在细胞内表达，近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领域［10］。
酵母菌表面展示的构建与转化酵母菌表面展示技术是一种将外源蛋白质表达于酵母菌表面，并利用这些表面展示的蛋白质进行功能研究、抗原呈递等应用的方法。
本文将介绍酵母菌表面展示的构建与转化方法。
一、酵母菌表面展示的构建方法1. 表面展示蛋白质的选择选择合适的表面展示蛋白质对于构建酵母菌表面展示系统非常重要。
常用的表面展示蛋白质包括α-酮酸脱羧酶（Aga1p）、记忆多聚体【GP】、酵母菌细胞壁蛋白质【Dub】和细菌β-内酰胺酶【TEM-1】等。
选择蛋白质应考虑其结构特性、易于表达、稳定性等因素。
2. 融合蛋白质的构建将目标蛋白质的编码序列与表面展示蛋白质的编码序列融合，构建融合蛋白质的基因。
融合蛋白质通常包括信号肽（用于导入蛋白质到内质网）和表面展示蛋白质的结构域。
选择适当的连接方式可以实现蛋白质在酵母菌表面的展示。
3. 转座子的构建将融合蛋白质的基因插入到适当的转座子中，以便将其导入到酵母菌的染色体中。
常用的转座子包括pCTCON2、pCTCON3和pCTCON5，它们在酵母菌表面展示领域应用广泛。
4. 转座子的转化将构建好的转座子导入到酵母菌中，实现融合蛋白质的表面展示。
常用的转化方法有化学法、电转化法和纳米粒子介导的转化法等。
其中，化学法是最常用的方法，通过聚合物或离子等辅助转化。
二、酵母菌表面展示的转化方法1. 化学法化学法是酵母菌表面展示的常用转化方法。
首先，将构建好的转座子与酵母菌一起暴露在聚乙二醇或锂乙酸等化学试剂中，破坏酵母菌细胞壁，使转座子能够进入细胞。
然后，通过热冲击或电击等方法使转座子插入到酵母菌染色体的特定位置，实现表面展示蛋白质的转化。
2. 电转化法电转化法是利用电场作用将转座子导入到酵母菌细胞内的方法。
首先，将构建好的转座子与酵母菌细胞混合，使其形成一个混合溶液。
然后，通过电极产生电场，将转座子导入到酵母菌细胞内。
电转化法具有高效、简单的优点，广泛应用于酵母菌表面展示的转化。
3. 纳米粒子介导的转化法纳米粒子介导的转化法是一种利用纳米粒子作为载体将转座子导入到酵母菌细胞内的方法。
酵母表达体系构建酵母表达体系是一种常用的基因表达系统，可以用于生产重组蛋白质、疫苗、抗体等生物制品。
构建酵母表达体系需要选择合适的酵母菌种、载体、目的基因以及必要的宿主细胞，并通过基因克隆、转化、筛选等一系列步骤实现。
本文将详细介绍酵母表达体系的构建过程。
一、选择酵母菌种和载体1．酵母菌种选择：根据需要表达的蛋白质的种类和性质，选择适合的酵母菌种。
常用的酵母菌种有Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、Pichia pastoris（毕赤酵母）等。
2．载体选择：载体是携带目的基因进入宿主细胞的必要元件，常用的载体包括质粒、整合型载体和噬菌体载体等。
在构建酵母表达体系时，应根据目的基因的性质和表达量要求选择合适的载体。
二、目的基因的克隆和鉴定1．基因克隆：将目的基因插入到载体中，形成重组DNA分子。
可以通过PCR、基因文库等方法获取目的基因，也可以从基因组或cDNA文库中筛选出目的基因。
2．转化宿主细胞：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，常用的方法包括电穿孔法、转化法等。
3．阳性克隆筛选：通过菌落PCR或 southern 杂交等方法筛选出含有目的基因的阳性克隆。
4．序列分析：对阳性克隆进行序列分析，确保目的基因正确插入载体中，并且没有发生任何突变。
三、构建酵母表达体系1．质粒制备：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行纯化和鉴定。
2．转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，常用的方法包括电穿孔法、热激法等。
3．筛选阳性克隆：通过 southern 杂交等方法筛选出含有重组质粒的阳性克隆。
4．鉴定表达产物：对阳性克隆进行蛋白质表达水平检测，常用的方法包括 western 杂交、ELISA等。
同时对表达产物进行生物活性检测，以评估表达产物的质量和功能。
5．优化表达条件：通过对培养条件（如温度、pH值、营养物质浓度等）进行优化，提高目的基因的表达水平和产量。
6．生产与纯化：在优化条件下进行大规模培养和表达，并对表达产物进行纯化和加工，以满足实际应用需求。
酵母菌表面展示的操作步骤酵母菌表面展示的操作步骤：酵母菌表面展示技术是一种基因工程技术，用于在酵母菌表面显示外源蛋白。
这项技术具有广泛的应用前景，可以用于疫苗研发、抗原表位筛选、酶工程等领域。
以下是酵母菌表面展示的一般操作步骤：1. 制备酵母菌工作库：首先，选择适合表面展示的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae或Pichia pastoris等。
然后，将目标蛋白的编码序列与酵母菌表面展示载体进行连接，得到重组质粒。
将重组质粒导入酵母菌细胞中，经过适当的培养和筛选，得到酵母菌工作库。
2. 构建表面展示的载体：将目标蛋白的编码序列与表面展示载体连接，通常采用DNA重组技术，将目标蛋白编码序列与表面展示载体的启动子、终止子以及分泌信号序列等序列连接起来。
确保连接正确无误后，得到表面展示载体。
3. 将表面展示载体转化入酵母细胞：将表面展示载体导入酵母细胞，可以采用化学法转化或者电击法转化。
在转化过程中，需要添加适当的选择性培养基，筛选转化成功的酵母菌克隆。
4. 诱导表面展示蛋白的表达：将转化成功的酵母菌接种至培养基中，培养一定时间，使酵母菌开始生长。
在适当的时间点，添加诱导剂，如酒石酸或甘油等，刺激酵母菌产生表面展示蛋白。
5. 检测表面展示蛋白的表达：采用免疫学检测方法，如免疫印迹、免疫荧光等，检测表面展示蛋白的表达情况。
可以使用特异性抗体来识别表面展示蛋白，并观察其在酵母菌表面的分布情况。
6. 验证表面展示蛋白的功能：针对表面展示蛋白的功能特性，进行相应的活性鉴定实验。
例如，对于展示的酶类蛋白，可以进行酶活测定；对于展示的抗原蛋白，可以进行抗原性测试。
总结：酵母菌表面展示技术是一种重要的基因工程技术，通过将外源蛋白表面展示在酵母菌细胞上，实现了对蛋白的高效表达和功能验证。
通过以上的操作步骤，可以成功制备出表面展示蛋白的酵母菌工作库，并通过免疫学检测和功能验证来验证表面展示蛋白的表达和功能。
食品级酿酒酵母高效分泌/展示表达系统构建基因工程酵母菌在食品工业中的应用逐渐普遍,但重组菌抗生素抗性标记的存在对食品安全具有潜在隐患。
此外,较低的生产成本、简单方便的下游操作技术和高水平的表达量等是工业大规模生产重组蛋白必须具备的特点。
针对这些问题,本课题根据半乳糖-葡萄糖对GAL基因家族诱导-抑制效应以及GAL4p对GAL基因的调控机制,采用同源重组技术分步敲除了工业多倍体酿酒酵母MS-1染色体上的GAL1基因,并将GAL4基因整合到GALl基因位点,构建了不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115.DPG65和GQ21。
同时,选用α-半乳糖苷酶作为食品级选择标记、β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为报告基因构建了在GALl启动子和MFαl信号肽控制指导下的食品级分泌表达载体YGMPA-PM:并以α-凝集素C-端320个氨基酸为锚定序列,构建了能够展示表达p-1,3-1,4-葡聚糖酶的食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将构建的载体和不同GAL基因型的重组酵母相结合,得到了适合工业化生产的食品级高效分泌表达系统和食品级高效展示表达系统。
主要研究结果如下：扩增了GAL4结构基因全长序列,并构建了包含GAL4基因+KanMX表达盒的模板质粒PMD18-TGK.通过同源重组以GAL4+KanMX表达盒替换了工业三倍体酵母MS-1的三个等位的GALl基因中的一个,得到具有双GAL4的重组酵母。
以KanMX为敲除框架,敲除了MS-l染色体上的一个GALl基因。
利用LFH原理,设计了另外两套基因敲除框架KanMX+GALls和GALlt+KanMX,依次敲除了双GAL4重组菌株染色体上剩余的两个GALl等位基因。
考虑到重组菌株应用的安全性,利用Cre/loxP系统切除了构建重组酿酒酵母菌株时使用的KanMX抗性表达盒,并通过传代使Zeocin抗性质粒pSH47/ZEO丢失,得到不同GAL 基因型的重组酵母SGl、DG115.DPG65和GQ21。
其中,重组菌株GQ21染色体上三个GALl基因全部缺失,且其中一个GALl基因位点被整合了一个GAL4基因拷贝。
对不同GAL基因型的重组酵母SG1、DG115、DPG65和GQ21在含有不同碳源的培养基中的生长、发酵性能以及抗性和遗传稳定性进行了测试。
结果表明,重组酵母的GAL基因型在传代过程中保持稳定,没有发生回复突变且抗性基因已经被彻底删除。
GALl基因的缺失对重组菌株对葡萄糖的利用有轻微地影响。
不同的培养方式影响重组酵母对半乳糖的利用。
在YPG培养基中,GALl基因敲除对酵母利用半乳糖的影响并不明显,MS-1.SGl.DG115在20 h内将培养基中的半乳糖全部消耗完毕,DPG65则在26 h内将半乳糖利用完毕。
在YPGL培养基中,MS-1、SG1.DG115和DPG65利用完半乳糖的时间分别为20 h、44 h、44 h和68 h。
在两种培养模式中,GQ21培养基中的半乳糖浓度一直维持不变,表明GALl基因确实已经被完全敲除。
GALl基因的敲除和GAL4基因拷贝的增加没有改变重组菌株的热致死温度。
重组菌株和对照菌株的热致死温度仍然是54℃。
构建了PGKl启动子控制下的α-半乳糖营酶表达单元,并将此表达单元克隆到多拷贝质粒YEPlacl 81上构建了食品级克隆载体YPM.YPM转化酵母后得到的重组子可以在以蜜二糖为唯碳源的培养基中生长,并能在涂有X-α-gal的培养上显蓝色,表明α-半乳糖苷酶已经被有效表达。
重组酵母/YPM在YPD培养基和MSD培养基中表达的a-半乳糖苷酶酶活最高为104 U/m1和41.72 U/ml；对照菌株安琪酵母表达的α-半乳糖苷酶存在蜜二糖／葡萄糖诱导-抑制效应,在YPD培养基和MSD培养基中的最高酶活为29.79 U/ml和266.38U/mI。
在MSD培养基中,安琪酵母12h进入对数生长期,32 h进入稳定期；重组酵母YPM在68 h后才开始快速生长,164 h后进入稳定期。
两者在YPD培养基中的生长性能一致,8 h进入对数生长期,32 h达到稳定期。
扩增了GALl启动子、MFal信号肽以及ADHl终止子基因序列,以p-1,3-1,4-葡聚糖酶为报告基因在克隆载体YPM的基础上构建了食品级分泌表达载体YGMPA-PM.以α-半乳糖苷酶为筛选标记,将载体YGMPA-PM转入所构建的重组酵母菌株SG1、DG115、DPG65和GQ21以及MS-1,在蜜二糖平板(MSD)挑选出了转化子。
测定不同GAL基因型酵母中p-1,3-1,4-葡聚糖酶的表达水平。
结果表明,SG1、DG115、DPG65和GQ21的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最高酶活分别为1523.48 U/ml、2480.43 U/ml、3161.53 U/ml和3991.00 U/ml,为MS-1 (846.37U/ml)的1.8倍、2.93倍、3.73和4.72倍,说明酵母染色体上GALI基因的敲除和GAL4基因拷贝的增加确实有利于提高外源蛋白表达的水平。
重组分泌表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0。
50℃保温2 h后p-1,3-1,4-葡聚糖酶残留酶活为51.90%；60℃保温2 h后的活力下降为初始酶活的20.14%。
在pH4-6的范围内于4℃放置24 h,酶活仍能保持80%以上。
扩增了编码α-凝集素C-末端320个氨基酸的基因序列并在载体YGMPA-PM 的基础上构建了食品级展示表达载体YGMPNA-PM.将其与不同GAL基因型的重组酵母相结合构建了食品级展示表达系统。
此展示表达系统将p-1,3-1,4-葡聚糖酶成功展示表达在酿酒酵母细胞表面。
通过平板鉴定和酶活测定确证了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的正确定位。
SG1、DG115、DPG65和GQ21展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最高酶活分别为84.98
U/ml、118 U/ml、161.55 U/ml和201.87 U/ml,分别为MS-1 (45.10 U/ml)的1.88倍、2.62倍、3.56倍和4.48倍。
展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生改变。
最适温度变为60℃,热稳定性也被增强。
50℃保温3 h对酶活几乎没有影响；60℃保温1 h残留酶活为初始酶活的129.2%,60℃保温3 h后的酶活为初始酶活的64.6%。
70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%,3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。
展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH4-7的范围内稳定性较好。
