对人乳铁蛋白基因的克隆及基因序列多态性分析

基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。

本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。

一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。

基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。

基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。

1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。

限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。

DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。

DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。

2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。

RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。

PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。

原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。

真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。

乳铁蛋白肽的抑菌活性及其基因工程制备巴特;丁卓平;刘承初【摘要】乳铁蛋白肽是乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶裂解,从N端释放的具有两亲性的阳离子多肽,具有广谱抗菌活性.目前,乳铁蛋白肽主要是通过水解乳铁蛋白来获得,无法大规模生产,基因工程技术将是大规模生产乳铁蛋白的最佳途径.文中对乳铁蛋白肽的抑菌活性及其转基因生产技术(包括表达系统的选择与比较,基因工程菌发酵液中乳铁蛋白肽的分离和纯化等)进行了简要的综述.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)007【总页数】8页(P114-121)【关键词】乳铁蛋白肽;抗菌肽;基因工程【作者】巴特;丁卓平;刘承初【作者单位】上海海洋大学食品学院,上海,201306;上海海洋大学食品学院,上海,201306;上海海洋大学食品学院,上海,201306【正文语种】中文乳铁蛋白(lactoferrin)是一种非血红素铁结合糖蛋白，与血清转铁蛋白、卵转铁蛋白和黑素转铁蛋白一样属于转铁蛋白科，由哺乳动物黏膜上皮细胞分泌，分子质量约为80 ku[1-2］。

乳铁蛋白约含690个氨基酸，不同种类的乳铁蛋白氨基酸序列具有非常高的同源性，其二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成，其中人和牛乳铁蛋白二级结构中α-螺旋多于β-折叠[2］，并在二级结构的基础上折叠成两个对称的具有相似结构的球状叶(N-叶和C-叶)，两叶氨基酸序列具有40%的同源性，同时各具有一个铁离子结合位点[3-4］。

乳铁蛋白的诸多生理功能均与其可逆鳌合Fe3+和能通过特殊的受体连接到细胞表面的特性有关[4-5］，其生理功能主要有广谱抗菌、抗过敏、参与免疫调节和抗炎症作用、促进细胞生长、抗血小板凝集、抑制半胱氨酸蛋白酶等[6-9］。

乳铁蛋白主要分布于多种哺乳动物(除大鼠、兔和狗外)的白细胞和多种组织外分泌液中，如乳汁、泪液、胆汁、黏膜液、唾液等，其中乳汁中含量最为丰富，其含量仅次于酪蛋白，其中人乳中含量约为1.0～3.2 mg/mL，猪、豚鼠、小鼠和马乳中含量约为0.2～2.0 mg/mL，牛乳、山羊乳中约0.02～0.2 mg/mL。

免疫遗传学基因多态性与免疫反应关系研究免疫遗传学是对人类免疫系统基因与其表达的遗传因素进行研究的学科。

其中，基因多态性是指同一基因在不同个体中存在不同的等位基因或基因型。

这些基因多态性对于人类免疫系统的功能、免疫疾病的易感性等具有重要意义。

本文将探讨免疫遗传学基因多态性与免疫反应关系的研究。

1. 免疫遗传学基因多态性在人类免疫系统中，有许多基因存在多态性，如人类白细胞抗原（HLA）基因、细胞因子基因、T细胞受体（TCR）基因等。

这些基因的多态性对于免疫反应的效力、免疫疾病的易感性、免疫排斥反应等具有重要意义。

以HLA基因为例，HLA基因位于人类染色体的短臂上。

它在人类免疫系统中具有重要的识别作用，参与了抗原呈递和免疫应答的过程。

对于不同种类抗原的处理，不同的HLA分子有不同的作用。

因此，HLA基因的多态性对于人类免疫系统的功能具有重要影响。

在临床上，HLA基因多态性的研究已经被广泛应用于器官移植、疫苗设计等方面。

2. 免疫反应与基因多态性的关系免疫反应是生物体对于感染、致癌细胞等外界因素的应答反应。

在抗原刺激下，免疫系统中的免疫细胞会释放细胞因子、调节细胞增殖、分化等，最终形成一种综合的免疫反应。

这种免疫反应的强度、速度等有很大程度上的差异。

基因多态性是其中一种可能的原因。

例如，HLA基因的多态性对于病毒感染的易感性具有影响。

许多病毒必须依赖宿主的免疫系统来进行复制、扩散等。

而HLA分子参与了抗原的呈递过程，它的多态性会影响到病毒抗原呈递的效率。

因此，HLA基因多态性与病毒感染的易感性具有相关性。

同时，HLA基因多态性还和免疫系统的自身免疫功能密切相关，其多态性与自身免疫疾病的易感性也存在相关性。

另外，基因多态性还可以影响到免疫抗原的适应性。

在免疫应答中，免疫细胞需要对抗原进行特异性识别，并产生相应的免疫反应。

然而，在人群中，同一抗原的识别效率会有所不同。

这是因为不同人的基因多态性和其相应的抗原识别效率有关系。

1、生物信息学广义：生命科学中的信息科学。

生物体系和过程中信息的存贮、传递和表达；细胞、组织、器官的生理、病理、药理过程的中各种生物信息。

狭义：生物分子信息的获取、存贮、分析和利用。

2、基因：有遗传效应的DNA片断,是控制生物性状的基本遗传单位。

3、中心法则是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。

也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。

这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。

4、一级数据库数据库中的数据直接来源于实验获得的原始数据，只经过简单的归类整理和注释5、基因芯片基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量cDNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。

二、选择题（每小题2分,共20分）1、BLAST教案所程序中，哪个方法是不存在的（D）A：BLASTP B：BLASTN C：BLASTX D:BLASTQ2、下列哪个软件不是常用来观察蛋白质结构视图的（D）A：AVS B：Chimera C:MICE D:HMM3、下列哪个不是点突变的类型(A)A:染色体畸变B：错义突变C：无义突变D：移码突变4、基因突变的效应不包括：（C）A：有利突变B：中性突变C：移码突变D：遗传多态现象5、人类基因组的结构特点不包括：（A）A：基因进化B：基因数目C：基因重复序列D：基因组复制6、世界上三大数据库不包括：（B）A:NCBI B:BLAST C:UCSC D:Ensembl7、常用序列比对方法错误的是：（C）A：编辑距离B：点阵描图C：局部比对D：记分模式8、下列哪个不是蛋白质结构模型（D）A：同源性模型B：折叠识别C：ab initio折叠D：MoLScript结构9、下列哪个选项不是微阵列实验设计的内容（A）A：贝叶斯网络法B：对照组的选择C：重复样本的使用D：随机化原则10、构建序列进化树的一般步骤不包括：（A）A：建立DNA文库B：建立数据模型C：建立取代模型D：建立进化树三、填空题（每空2分,共20分）1、数据格式的建立、数据的准确性和质量控制、方便的数据搜寻方式以及数据的及时更新是数据库建立和维护中的重要问题。

31.对进行胚胎移植的优点叙述错误的是( )A.充分发挥雌性优良个体的繁殖能力B.大大缩短了供体本身的繁殖周期C.经移植可得到多个后代D.胚胎移植可以提取药物2.下列能正确表示高等动物胚胎发育顺序的是( )A.受精卵→ 卵裂→囊胚→ 原肠胚→ 组织器官的分化B.卵→ 卵裂→ 原肠胚→组织器官分化C.受精卵→囊胚→ 原肠胚→幼体D.受精卵→ 桑椹胚→囊胚→ 原肠胚→组织器官的分化3.判断卵子是否受精的标志是( )A. 当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到一个极体时B. 当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到二个极体时C. 当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到三个极体时D. 当卵黄膜和透明带的间隙中极体消失时4.胚胎干细胞的特点是( )A.在形态上，表现为体积大，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性B.在形态上，表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上具有发育的全能性C.在形态上，表现为体积小，细胞核小，核仁不明显；在功能上不具有发育的全能性D.在形态上，表现为体积大，细胞核小，核仁明显；在功能上具有发育的全能性5.下列不是精子、卵子发生的区别的是( )A.初级精母细胞、卵母细胞的形成时间B.M Ⅰ和MⅡ的时间连续性C.成熟生殖细胞是否经过变形D.成熟生殖细胞中染色体的数量6.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是( )A.受孕母畜体内的早期胚胎能够移植B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态C.超数排卵技术要使用一定的激素D.试管婴儿的受精及胚胎发育过程在试管内完成7.杜泊羊具有生长快、肉质好等优点，科研工作者通过胚胎工程快速繁殖杜泊羊的流程如下图所示。

下列问题叙述不正确的是：( )A.获取杜泊羊的卵母细胞时，可对供体母羊注射促性腺激素，使其排出更多的卵子B.为保持精子与卵母细胞活性，采集到卵母细胞与精子后马上进行体外受精C.体外培养受精卵时，合成培养基中通常需提供CO2 以维持pH 值D.在胚胎移植前要对接受胚胎的当地普通绵羊进行同期发情处理8.下列关于胚胎移植的叙述不正确的是( )A.胚胎移植属于无性繁殖，大大缩短了供体本身的繁殖周期B.可以充分发挥雌性优良个体的繁殖能力C.供体的主要职能变为只产生具有优良遗传特性的胚胎D.胚胎移植时“冲卵”是指把胚胎从子宫冲洗出来9.模型是人们为了某种特定目的而对认识的对象所做的一种简化的概括性描述。

人基因多态性分析一、实验目的1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。

2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。

二、实验原理基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。

人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。

原理是通过PCR扩增获得目的基因。

若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。

若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。

应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。

三、器材与试剂1. 器材⑴离心机。

⑵DNA扩增仪。

⑶电泳仪。

⑷水平电泳槽。

⑸紫外检测仪。

⑹移液器。

2. 试剂⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。

⑵琼脂糖。

⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。

⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。

遗传学知识：基因多态性的分析基因多态性的分析基因多态性指的是同一物种中基因序列的变异。

这种基因变异的存在能够导致个体在性状、健康状况、药物代谢等方面出现差异。

分析基因多态性是研究人类基因组的重要手段之一。

本文将从基因多态性的定义、应用、评估等方面进行阐述。

一、基因多态性的定义基因多态性是指基因序列中存在的可变性。

现有研究表明，基因组中约有1%的序列存在变异。

基因多态性的具体表现形式包括单核苷酸多态性（SNP）、串联重复序列（VNTR）等。

基因多态性的存在能够对生物学过程产生影响，如个体的健康状况、药物代谢等。

二、基因多态性的应用基因多态性的存在对个体特征的表现产生影响。

目前，许多研究开展了基因多态性和疾病之间的关联分析，以探究特定基因型与疾病的发生发展之间的关联。

例如，糖尿病、高血压等疾病就与特定基因型有着密切的联系。

另外，基因多态性在个体化用药方面也有广泛的应用。

现有研究表明，基因多态性能够影响药物的代谢和吸收，从而导致个体在药理治疗中出现不同的反应。

因此，在药物治疗中，针对个体基因多态性进行评估和应用，能够提高药物治疗效果和降低不适应症的发生率。

三、基因多态性评估目前，基因多态性的评估主要有两种方式：基于PCR的单纯性分析和基于芯片的多基因分型分析。

基于PCR的单纯性分析是最常见的基因多态性评估方式。

该技术采用特定引物进行扩增，得到基因对应位点的DNA序列，进而对基因型进行分析。

该技术具有操作简单、针对单一基因位点、成本低等特点。

基于芯片的多基因分型分析可以同时评估多个基因位点的多态性。

该技术采用芯片上固定的探针来检测基因多态性，具有高通量、高灵敏度等特点。

但该技术由于成本和技术难度较高，目前仅在特定研究领域得以应用。

四、总结基因多态性评估能够在疾病诊断、药物个体化治疗等方面发挥重要作用。

目前，基于PCR和芯片的技术已成为基因多态性评估的主要手段。

基因多态性是人类基因组研究的重要内容之一，未来随着技术的发展和深入研究，其应用领域和价值将不断扩大和深化。