在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。

取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。

直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。

2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。

（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

终止子：转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类，这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解，显著延长mRNA的寿命，由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率极高，宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译，因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子，只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4：常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的，为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量，表达条件和白不表达时：
2
如果重组蛋白不表达（包含体和可溶蛋白都没有），首先检查cDNA和质粒是否正确，蛋白对宿主菌是否有很大毒性，然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见，通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白，即使在更换了宿主、载体后可以表达，表达量也不会很高，如果需要大规模生产，最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签：融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠，提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响，但又是纯化所必须的，就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法：化学裂解，如溴化氰（CNBr）、羟胺（NH2OH）等，能够简单有效地去除标签，但反应条件苛刻（羟胺需要在pH9.0下反应），特异性较差，而且会引入不必要的修饰，除包含体蛋白的处理外已经很少使用了；酶解，如PPase等，其底物一般是一段比较长的肽链，特异性强，是目前比较常用的方法，缺点是酶切反应需要较长的时间，也增加了蛋白纯化的步骤，使纯化变得繁琐；IMPACT质粒，该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子（intein），intein具有可诱导的自切割活性，使用IMPACT质粒表达的重组蛋白，只需要改变缓冲液的pH和温度，即可切掉融合标签。

目的基因在大‎肠杆菌中的诱‎导表达一般程序如下‎：获得目的基因‎－准备表达载体‎－将目的基因插‎入表达载体中‎（测序验证）－转化表达宿主‎菌－诱导靶蛋白的‎表达－表达蛋白的分‎析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于‎100ml ddH2O 中‎,0.22μm滤膜‎抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方‎法获得目的基‎因：以含目的基因‎的克隆质粒为‎模板，按基因序列设‎计一对引物（在上游和下游‎引物分别引入‎不同的酶切位‎点，本实验中为B‎a mHⅠ和Hiind‎Ⅲ），PCR循环获‎得所需基因片‎段。

PCR反应体‎系为：模板（含R基因的重‎组质粒）1μl上游引物PR‎11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer‎（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补‎至100μlPCR反应条‎件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40se‎c、72℃延伸1min‎，30个循环；最后72℃延伸8min‎。

2、构建重组表达‎载体（1）载体酶切：将表达质粒p‎R SETA用‎限制性内切酶‎（同引物的酶切‎位点）进行双酶切，酶切产物行琼‎脂糖电泳后，用凝胶回收K‎i t或冻融法‎回收载体大片‎段。

（2）R基因PCR‎产物双酶切后‎回收，在T4 DNA连接酶‎作用下连接入‎载体。

连接反应体系‎为：pRSETA‎1μlR基因片段3μlT4 DNA连接酶‎（5U/μl）1μl5×buffer‎2μlddH2O补‎至10μl3、获得含重组表‎达质粒的表达‎菌种（1）将连接产物转‎化大肠杆菌D‎H5α，根据重组载体‎的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量‎抽提质粒，双酶切初步鉴‎定。

（2）测序验证目的‎基因的插入方‎向及阅读框架‎均正确,进入下步操作‎。

大肠杆菌重组蛋白表达流程大肠杆菌重组蛋白表达流程主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达载体：通常选择含有启动子、转录终止子、选择标记和适当的表达调控元件的表达载体。

启动子用于驱动基因转录，转录终止子用于确定转录产物的结束位置，选择标记有助于筛选含有目的基因的转化子，而表达调控元件可以调节基因的表达水平。

2. 构建表达载体：将目的基因插入表达载体中，构建成重组表达载体。

在此过程中，需要考虑目的基因的orientation（方向）、阅读框（ORF）以及表达调控元件的活性等因素。

3. 转化大肠杆菌：将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌中。

转化方法有多种，如化学法（如CaCl2法）、电转化、热激转化等。

转化后，大肠杆菌吸收了外源DNA，成为重组菌株。

4. 筛选重组菌株：在含有选择性抗生素的培养基上培养转化后的菌落，筛选出含有目的基因的重组菌株。

此外，可以通过鉴定菌落的形态、颜色等特征进行初步筛选。

5. 诱导表达：将筛选出的重组菌株接种到含有诱导剂（如IPTG）的培养基中，诱导目的基因的表达。

诱导剂IPTG可以与表达载体中的启动子结合，增强基因转录和翻译的效率。

6. 收集和纯化重组蛋白：诱导表达后，菌体中会含有目的蛋白。

可以通过离心、破碎细胞、柱层析等方法分离和纯化重组蛋白。

常用的纯化标签有His标签、GST标签等，这些标签可以帮助分离和纯化目的蛋白。

7. 蛋白活性检测和应用：对纯化的重组蛋白进行活性检测，如酶活测定、蛋白互作实验等。

确认蛋白活性后，可应用于生物学研究、药物研发等领域。

需要注意的是，大肠杆菌重组蛋白表达过程中可能会遇到表达量低、蛋白包涵体等问题。

为了解决这些问题，可以尝试优化表达载体、改变诱导条件、使用融合标签等策略。

重组蛋白工艺流程
重组蛋白工艺流程：
目标基因的扩增。

首先，需要设计引物，这些引物应避开目标蛋白的跨膜区和二级结构，如选择N端或C端的序列。

这些引物的设计结合了目标蛋白的结构信息和基因信息，并通过第三方公司合成。

插入克隆载体。

利用PCR技术，根据目标蛋白的特异表达组织，使用设计的引物进行PCR扩增，然后进行酶切和连接，将目的片段与载体结合。

亚克隆到表达载体中。

将连接好的目的片段转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，并进行挑菌验证，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳来确认目的片段是否成功插入载体。

蛋白表达。

在特定的条件下，如诱导剂的存在，将重组载体转化到宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或杆状病毒-昆虫细胞系统，进行蛋白的表达。

蛋白的鉴定和纯化。

通过SDS-PAGE和western blot或荧光等方法进行蛋白的鉴定，由于载体中通常包含标签（如His标签），可以使用特定的纯化方法，如镍柱纯化，来分离和纯化重组蛋白。

质量检测和保存。

纯化后的蛋白会进行冻干处理，并进行常规的蛋白质实验验证其分子量和纯度，纯度通常需要超过95%。

通过测试后，蛋白会被储存。

大肠杆菌表达方法一．表达鉴定1、将鉴定好的质粒转化DE3(BL21),涂卡那板。

1、挑取含重组质粒的菌体单斑3-5个克隆至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养，保存甘油菌。

500ul菌加500ul 40%甘油。

2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将100ul菌加入到含5mlLB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。

3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。

4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加100ul Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。

5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加100ul 1×SDS-Loading buffer，电泳鉴定。

二．小规模蛋白表达、纯化、复性1、取鉴定好的甘油菌10ul接种至2ml LB（含kana50μg/ml）中37℃过夜培养2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200ml LB（含kana50μg/ml）培养基的培养管中，37℃震荡培养至OD600 ≌0.6-0.8（大约需3hr）。

3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养5hr。

4、取菌体，离心12000g×2min收获沉淀，加5ml Bugbuster protein extraction reagent 重悬后在振荡器上振荡20min。

5、4度12000rpm 离心20min，弃上清，沉淀加10ml 包涵体洗涤液(10×：200 mM Tris-HCl, pH7.5, 100 mM EDTA, 10% Triton X-100)，涡旋1min 充分重悬，12000rpm 离心15min，弃上清。

重组蛋白的表达1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）时期，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面阻碍到下游的分离纯化，因此在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的阻碍，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。

目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著阻碍下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依靠于所选择的表达系统。

选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间能够幸免破裂细胞的步骤，同时由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对集合的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的阻碍，关于其中的有些缺点能够通过一定的方法进行克服和幸免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能爱护目标蛋白不被降解（96）。

表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破裂表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的开释周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离爱护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的阻碍，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一样具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。

第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。

将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图 1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生 的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的 转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入
lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖 )，阻遏 蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效 表达，表达蛋白可经SDS-PAGE检测。
——带有pBR322的大肠菌素E1 (colEl)复制区。从而赋予宿 主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列 在多克隆位点插入，置于天然T7 RNA聚合酶启动子(φ10启 动子)或所谓的T7 lac启动子的控制之下，后者是带有lac操 纵子( larO)序列的天然T7 RNA聚合酶启动子的衍生体。lac 阻抑物的结合能阻断转录起始。
五．注意事项
• 1．含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培 养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导 表达。 • 2．表达菌生长至OD600值0.6左右为诱导适合条件， 避免菌生长过浓。 • 3．配制SDS胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中， 并待其充分凝固后使用。
思考题
1．原核表达目的蛋白的基本原理是什么？ 2．SDS-PAGE电泳的原理是什么？
SDS-PAGE分离蛋白原理
• 组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而 带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性 质及溶液的pH值和离子强度。 • 聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速 剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下， 聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的 作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁 移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少 和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将 不同的蛋白质进行分离。

原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

第一天1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。

调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。

分装成15瓶（每瓶200ml）。

2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200µlAMP（1:1000）、60µl菌液。

37℃过夜。

第二天1、扩大培养（超净台）4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200µlAMP，摇床培养1小时左右。

2、诱导（超净台）加40µlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。

25℃摇床培养4小时。

3、离心获取菌体4℃，8000rpm离心25分钟。

注意配平。

4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF）。

将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。

离心收集上清液。

600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。

探头浸没于菌液中，不可伸入过长。

注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。

5、抽滤（双层滤纸)洗胶（GST）。

将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。

第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20µl，留电泳。

2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。

3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20µl，留电泳。

用洗脱液调零，测OD280。

（OD值达到1.5为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。

利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。

本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。

一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。

选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。

2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。

3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。

可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。

4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。

通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。

二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。

这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。

2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。

通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。

3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。

通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。

4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。

将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。

5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。

通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。

重组质粒在大肠杆菌中的表达1. 仪器耗材紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml 三角烧瓶、移液枪、枪头。

2. 试剂及配制（1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。

（3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。

（4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。

3. 实验步骤（1）构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。

（2）挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。

（3）把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。

（4）37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。

（5）取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。

（6）诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。

大肠杆菌重组蛋白的提取制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!大肠杆菌重组蛋白的提取与制备流程详解大肠杆菌因其快速生长和易于遗传操作的特性，常被用作表达和生产重组蛋白的理想宿主。

大肠杆菌重组蛋白n端糖化
大肠杆菌重组蛋白n端糖化是指在大肠杆菌中，通过基因工程技术将外源蛋白基因导入到宿主菌中，并在宿主菌内进行表达，使其N端发生糖基化修饰的过程。

大肠杆菌重组蛋白n端糖化的方法主要包括以下步骤：
1. 构建敲除大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp基因的大肠杆菌菌株。

2. 引入外源N-糖基化机制到所构建的大肠杆菌中。

3. 构建质周腔中表达目的蛋白的载体。

4. 自动诱导方式表达目的蛋白。

通过大肠杆菌重组蛋白n端糖化的方法，可以实现利用大肠杆菌N-糖基化修饰目的蛋白并实现N-糖基化蛋白分泌到胞外。

该方法降低了外源基因表达产物在质周腔过度积累所造成的代谢负荷，提高了N-糖基化目的蛋白总产量；无需破碎细菌而从培养基中直接分离纯化N-糖基化蛋白，简化了分离纯化步骤，易于大规模工业化生产。