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鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
实验九病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
1 2 3 11 12
稀释倍数212223 (211)
1
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。
三、实验报告内容
1、病毒鸡胚培养的注意事项。
2、鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效
价测定结果含义与意义。
2。
鸡胚培养前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。
牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。
鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
基本原理鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
器材牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。
孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种1）绒毛尿囊膜接种（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。
通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。
本文将介绍几种常见的病毒培养方法。
一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。
病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。
这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。
通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。
二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。
在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。
通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。
三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。
科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。
通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。
然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。
四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。
通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。
这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。
然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。
总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。
不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。
一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。
鸡胚原代细胞培养实验材料9～10日龄鸡胚;Hank"s液50mL;0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL 内含犊牛血清1mL;双抗0．2mL;pH7．2;O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL;手术剪;镊子;灭菌的培养皿;50mL三角瓶;滴管若干;链霉素小空瓶若干加入细胞悬液培养用;高压灭菌塞子若干;培养盘;蛋座;95％酒精;水浴锅..实验内容及操作程序1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素;使其含量为青霉素100IU/mL;链霉素100μg/mL;用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4;将胰蛋白酶调整pH7．6玫瑰红色..置37℃水浴锅中预热备用..2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上;用碘酊消毒气室;以镊子击破卵壳并弃之;撕破卵膜揭之;继撕破绒尿膜、羊膜;取出胚胎于灭菌平皿中..剪去头部、翅爪及内脏;用Hank"s液简称H液洗去体表血液;移人灭菌三角瓶中;用灭菌剪刀剪碎鸡胚;使成为约1mm3大小的碎块;加5mL H液轻摇;静止1～2min;使其组织块下沉..吸去上层悬液;依同法再洗2次;至上悬液不混浊为止;吸干H液留组织.. 3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶;按组织块量约3～5倍加入三角瓶中;1个鸡胚约需5mL胰酶;三角瓶上加塞;以免CO2挥发及污染..37℃水浴约20min左右;每隔5min轻轻摇动1次;由于胰酶作用;使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离;待液体变混而稍稠;此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时;则需中止消化;如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长;如果消化不够;则细胞不易分散..4．洗涤取出三角瓶后静置1min;让组织块下沉后;吸去胰酶液;用10mL Hank"s 液反复轻洗3次;以洗去胰酶;吸干上清液;留组织块..5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液;以粗口吸管反复吹吸数次;使细胞分散;此时可见营养液混浊即为细胞悬液..静置1min;使未冲散的组织块下沉后;小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中;此液细胞数约50万～70万/mL..如需大量细胞;可继续加营养液冲打;一个鸡胚约可做100mL细胞悬液..6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL加入0．1％结晶紫一柠檬酸0.1mol/L溶液2mL;置室温或37℃温箱中5～10min;充分振动混合后;用毛细管吸取滴人血细胞计数板内;在显微镜下计数..计数方法按白细胞计数法;计算四角大格内完整细胞的总数..如3～5个聚集在一起;则按1个计算;然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数..细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数例如：4大格的细胞总数为284个;而稀释倍数为50．5mL染色液;则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3．5×104个..7．稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准;将细胞悬液用营养液稀释之.. 计数时;可见到大部分细胞完整分散;3～5个细胞成堆;且细胞碎片很少;说明消化适度；如分散细胞少;则消化不够；如细胞碎片多;则消化过度..活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴;细胞悬液1滴;混合计数;活细胞不着色;死细胞呈蓝色..8．分装培养分装于链霉素瓶中;每瓶约1mL;瓶口橡皮塞要塞紧..不合适者弃去;以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱..将细胞瓶横卧于培养盘中;于瓶上面划一直线;以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置..瓶上注明组别、日期;置37℃温箱培养;4h后细胞即可贴附于瓶壁;24～36h生长成单层细胞;此时可吸去培养液;更换维持液;并接种病毒..附：细胞培养所需的常用培养基与试剂1．Hank’s液配制原液甲NaCl 8gKCl 2gMgSO4·7H20 2gMgCl2·6H20 2g2．8％CaCl2 100mL双蒸水加至1 000mL先将固体成分加于800mL双蒸水中;加温到50～60℃加速溶解;再加入CaCl2溶液;最后加双蒸水补足到1 000mL..加氯仿2mL;摇匀后于4℃贮存..原液乙Na2HPO4·2H20 1.2gKH2PO4·2H20 1.2g葡萄糖20g0．4％酚红lOOmL双蒸水加：1 000mL将上列各物混合后使其溶解;加氯仿2mL;摇匀后于4℃贮存..Hank"s工作液原液甲1份原液乙1份双蒸水18份工作液分装100mL;或500mL盐水瓶中;115~C灭菌10min;使用前以7％NaHCO3调节pH至0 7．2～7．6..2．0．4％酚红溶液配制酚红0.4g0．1％NaOH溶液11.28mL将酚红置于研钵中;加磨边缓缓加NaOH溶液;直到所有颗粒完全溶解;置于至lOOmL量杯中;最后加双蒸水至lOOmL;摇匀后;保存于4℃冰箱内备用.. 3. 0.5％乳蛋白水解物溶液配制乳蛋白水解物5gHank"s液l 000mL将乳蛋白水解物放入1 000mL Hank"s液中;待完全溶解后;摇匀分装于lOOmL 的盐水瓶中;每瓶95mL;115℃lOmin灭菌;4℃贮存备用..4．营养液生长液配制O．5％乳蛋白水解物95mL犊牛血清5mL青霉素、链霉素lmL将上述溶液混合后;以7％NaHCO3适量调节pH到7.2～7.4..维持液按上述方法;加犊牛血清2.5mL即成..5．MEM培养液MEM培养基一袋;加1 000mL双蒸水;过滤除菌或高压灭菌;分装于100ml盐水瓶中;每瓶90ml;用前以7％NaHC03调pH到7.2～7.4;并加10％犊牛血清..6．双抗配制青霉素100万IU链霉素1gHank"s液100mL将青、链霉素溶解于：100mL Hank"s溶液中;此为双抗溶液;无菌操作;分装小瓶;每瓶：lmL;内含有青霉素IIU;链霉素10000μg;低温冻结保存..使用时每100mL营养液中加双抗lmL;即每mL营养液中含青霉素100IU;链霉素100gμg..7. 7％NaHCO3溶液配制NaHCO3 7g双蒸水100mL将NaHC03溶于双蒸水中;置水浴锅中加热溶解;115℃10min灭菌后;无菌操作分装小瓶;每瓶lmL;4℃保存..8. 0.25％胰蛋白酶配制胰蛋白0.25gHang’s液100mL将胰蛋白酶溶于Hank"s液中;待完全溶解后;用0.2μm滤膜过滤;检验无菌后才能使用..无菌分装小瓶;每瓶5mL;低温冻结保存..使用时;以7％NaHC03调节pH到7.6-7.8。
鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
鸡胚培养病毒的鸡胚培养, 提纯, 鉴定1. 鸡胚的选择和孵化选SPF鸡胚, ⼊孵前0.1%新洁尔灭消毒表⾯. 在温度37.5-38℃, 湿度40%-57%通风良好的条件下孵育. 孵育过程中每天翻蛋两次, 要求蛋的⾓度要达到前俯后仰45°.在孵育的第五天照蛋, 去除⽆精蛋和死胚蛋, 第九⽇起每天照蛋2次, 去除死胚蛋.2. 病毒的接种病毒的浓度, 由病毒原始浓度, 将其稀释⾄效价为1:1280备⽤, 接种鸡胚时将其稀释1000倍,接种: 采⽤第9-10⽇龄的鸡胚, 进⾏尿囊腔接种, 接种量0.1ml,接种步骤: a 照蛋标出⽓室和⼤⾎管位置b ⽓室底边胚胎附近⽆⼤⾎管处标记注射位置c ⽓室向上放置于卵架上, 碘酒酒精消毒蛋壳d 注射点和⽓室顶分别队蛋壳打洞,e 1ml针头以30度夹⾓刺⼊3-5mm, 注射病毒液f ⽯蜡封⼝孵育: ⽓室向上, 孵箱温度36℃,湿度40%-57%, 定时换⽓, 捡出24⼩时内死亡的鸡胚, 培养48⼩时, 搜集24⼩时以后死亡的鸡胚,收获: 48⼩时后, 4℃冰箱过夜/-20℃ 1⼩时,避免收获时流⾎.⽓室端卵壳表⾯消毒, 镊⼦击破卵壳, 除去壳膜, 撕破绒⽑尿囊膜, 吸出尿囊液和⽺⽔, ⽆菌容器4℃保存待⽤. 同时可以取出鸡胚, 观察有⽆出⾎, 卷曲等病毒的提纯、分装及保存尿囊液经低速离⼼（2800r/min，800g）30min，弃去沉渣，含NDV的上清液再经低温超速离⼼（4℃，30000r/min，90000g）60min沉淀病毒。
沉淀物⽤pH7.2、0.01mol/L PBS重悬，并⽤0.5%新鲜鸡红细胞悬液测定NDV的⾎凝单位（Hu），然后稀释成1:1280Hu/ml，分装于安瓿，置-20℃保存备⽤，临⽤前解冻病毒的鉴定:(1)⾎凝实验(HA):试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10稀释倍数1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照⽣理盐⽔(ml) 0.40 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 病毒液(ml) 0.10 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25⽣理盐⽔(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25得最好稀释倍数, 称为病毒得⾎凝滴度.(2)毒⼒测定将BSR T7/5细胞培养于九孔板, 对数⽣长期, 24⼩时前换培养液, 将所得到的病毒液倍⽐稀释(按上表), 分别感染BSR T7/5细胞培养⽫,(⼩时后)观察细胞病变情况,计数噬菌斑, 将其与病毒浓度做图, 取呈线性关系的浓度段, 判断病毒的侵染⼒所需材料:1.SPF鸡蛋2.1%鸡⾎红细胞悬液3.0.1%新洁尔灭溶液4.病毒原液5.⽯蜡6.照蛋器7.卵架8.1ml注射器9.孵箱10.4℃冰箱11.⽆菌容器12.碘酒, 酒精, 镊⼦, 剪⼑, 洗管, (打孔器)附:1.病毒⾎球凝集单位: 能使鸡红细胞凝集的最⾼稀释倍数的病毒液0.25ml称为⼀个病毒⾎球凝集单位2.病毒的效价: 每单位体积中侵染单位的数量, 如寄⽣某寄主所需最⼩量病毒是0.1ml稀释⾄1/106的病毒悬液, 其效价为:1/(10-1X10-6)= 107.3.噬菌斑形成单位(pfu): 如0.1ml病毒悬液再单层细胞上形成20个蚀斑, 则每毫升病毒悬液的pfu是(1/0.1)X20=200pfu/ml4.鸡胚的判断: 正常胚胎: 可见有清晰得⾎管⼩团, 有鸡胚迹象, 可见有胚胎主动活动⽆精卵, 经过4天孵育后未见有胚胎迹象,仅见模糊卵黄影死胚或濒死卵: 胚胎运动呆滞或不动, ⾎管昏暗, 折断或飘落。
一、实习背景鸡胚培养是生物技术领域的一项重要技术，广泛应用于病毒学、免疫学、遗传学等研究领域。
通过在鸡胚中培养病毒，可以研究病毒的复制、传播机制以及疫苗的研发等。
为了提高自身对鸡胚培养技术的掌握，我参加了为期两周的鸡胚培养实习。
二、实习目的1. 熟悉鸡胚培养的基本原理和操作流程。
2. 掌握鸡胚接种、传代、观察等实验技术。
3. 了解鸡胚培养在病毒学研究中的应用。
三、实习内容1. 鸡胚培养基本原理鸡胚培养是利用鸡胚作为宿主，在适宜的条件下，使病毒在其中复制、增殖，从而达到研究病毒的目的。
鸡胚具有以下优点：（1）繁殖速度快，易于操作。
（2）病毒在鸡胚中生长条件稳定，有利于病毒学研究。
（3）鸡胚具有广泛的病毒易感性，可以用于多种病毒的研究。
2. 鸡胚培养操作流程（1）鸡胚选择：选择健康的鸡胚，一般选用9-14天的鸡胚。
（2）鸡胚消毒：将鸡胚置于75%酒精中浸泡30秒，然后用无菌生理盐水冲洗。
（3）接种：将病毒悬液滴加于鸡胚尿囊腔中，每只鸡胚接种量为0.2-0.5ml。
（4）孵育：将接种后的鸡胚置于37℃恒温箱中孵育，观察病毒生长情况。
（5）观察：定期观察鸡胚的生长状况，记录病毒复制情况。
（6）收获：当鸡胚出现病变时，收集尿囊液，进行病毒分离、鉴定等实验。
3. 鸡胚培养在病毒学研究中的应用（1）病毒分离：利用鸡胚培养可以分离出多种病毒，如流感病毒、新城疫病毒等。
（2）病毒鉴定：通过鸡胚培养可以观察病毒的形态、生长特性等，从而对病毒进行鉴定。
（3）病毒疫苗研发：利用鸡胚培养可以筛选出具有免疫原性的病毒抗原，为疫苗研发提供依据。
四、实习收获1. 熟悉了鸡胚培养的基本原理和操作流程，掌握了鸡胚接种、传代、观察等实验技术。
2. 深入了解了鸡胚培养在病毒学研究中的应用，提高了自己的科研能力。
3. 通过实习，培养了严谨、细致的科研态度，提高了自己的动手能力。
五、实习总结本次鸡胚培养实习让我受益匪浅。
在实习过程中，我不仅学到了鸡胚培养的基本知识和操作技能，还了解了鸡胚培养在病毒学研究中的应用。
鸡胚体外培养的孵化方法
鸡胚体外培养的孵化方法是一种在实验室中研究鸡胚发育和生
物学过程的重要技术。
该方法可以为研究人员提供控制条件的机会，以研究不同因素对鸡胚发育的影响。
以下是鸡胚体外培养的孵化方法：
1. 选择鸡蛋并清洗表面，避免污染。
2. 用无菌器械打开鸡蛋端部，将胚胎取出并置于培养基中。
3. 将培养基放置于培养箱中，保持适宜的温度和湿度，并进行
必要的气体交换。
4. 观察和记录胚胎的发育情况，包括心脏和神经系统的形成等。
5. 根据需要，可以添加不同的药物或营养物质，以研究其对胚
胎发育的影响。
通过这种方法，研究人员可以研究胚胎发育的不同阶段，了解胚胎发育的调节机制，以及评估不同因素对胚胎发育的影响。
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第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
鸡胚培养
前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。
牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。
鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
基本原理
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
器材
牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；
白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；
孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤
1．准备蛋胚
孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。
孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可
以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种
1）绒毛尿囊膜接种
（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
（c）用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。
（d）用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室
（e）用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0．05— 0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。
（f）在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。
也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。
将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。
⑵尿囊腔接种
用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。
（a）将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。
（b）将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。
用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。
（c）用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液（图Ⅻ-5）。
（d）用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
⑶羊膜腔接种
（a）将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。
（b）用碘酒消毒气室部位的蛋壳。
用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。
注意勿划破壳膜。
（c）用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。
（d）用灭菌尖头镊子，两页井拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来（图Ⅻ-6）。
（e）左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液 0．1ml。
针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。
（f）用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时，保持蛋胚的钝端朝上。
3．收获
⑴绒毛尿囊膜
（a）用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。
（b）将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。
然后或用于传代，或用50%甘油保存。
⑵尿囊腔接种法收获尿囊液
（a）将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。
（b）用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。
切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。
（c）将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。
一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。
若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。
收获的尿囊液经无菌试验后可在4℃以下的温度中保存。
（d）观察鸡胚，看有无典型的症状。
⑶羊膜腔接种法收获羊水
（a）按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。
（b）先吸出尿囊液。
（c）再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0．5—1．0ml。
经无菌试验后，保存于低温中。
（d）观察鸡胚的症状。
写鸡新城疫病毒接种鸡胚培养后，鸡胚所出现的变化。
附：鸡胚培养法
一、.实验材料
（一）7—11日龄鸡胚
（二）孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33—35℃，放接种病毒后的鸡胚。
（三）照明灯，打孔器和卵盘。
（四）其它：注射器，针头，消毒剂（2.5%碘酒和75%酒精），镊子，酒精灯，试管架，蜡和胶布等。
二、接种技术
（一)活胚检查
鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：
⒈血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
⒉胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。
但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
⒊绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
(二）接种途径
尿囊腔接种
通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界，在气室交界边缘以上约1mm 处并避开血管作一标记此即为注射点。
在点周围用先用2.5%碘酒消毒，再用75%酒精脱碘。
用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤壳膜。
用注射器注入样品0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃培养。
于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
培养72h后进行收获。
收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，不能置时间过长，过长会引起散黄。
如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。
预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用碘酒或75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌注射器通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置西林瓶内4℃或低温保存待用。
血凝试验
一．仪器设备
一次性注射器，微量血凝板（V型、96孔），微型振荡器，移液器
二．所需试剂
⑴稀释液10×PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2）
氯化钠8.5g，磷酸二氢钾0.68g，氢氧化钠0.15g，上述成分溶于100ml蒸馏水后高压灭菌，于4℃保存，使用时作10倍稀释。
⑵红细胞保存液（阿氏液）
葡萄糖20.5克，氯化钠4.2克，柠檬酸0.55克，柠檬酸钠8.0克，溶于1000毫升蒸馏水中，调PH值6.8~7.2，分装，115℃15分钟灭菌，低温保存备用。
⑶1%红细胞悬液
用一次性注射器吸取2ml阿氏液，再直接采成年公鸡翅下静脉血液2ml，混匀，转移到离心管中，用1×PBS洗涤红细胞三次，头两次以1500rpm离心5min，
最后一次以2000rpm离心10min。
将1ml离心压积后红细胞加入到100mlPBS中或阿氏液中即配成。
三．操作方法
⑴于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1×PBS 50μL，根据被检样品数量定所加排数。
⑵吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。
最后一列不加样品作空白对照。
⑶于每孔中加入1%红细胞悬液25μL。
⑷置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。
⑸放室温下（18～20℃）30min，观察结果。
《发育生物学》结课实验设计
鸡胚的病毒培养
姓名：王宇
班级：生科09 2班
学号：2009061671。
