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纳豆激酶生产工艺纳豆知识1、纳豆和纳豆激酶的生产工艺(1)、纳豆的生产过程：精选小粒黄豆→浸泡→清洗→蒸煮→沥干→降温至70度→无菌接种(纳豆菌)→35-52度培养24-36小时→分装→冷冻保存→纳豆纳豆是日本的传统食品，是选用优质黄豆经纳豆菌生物发酵而成。
纳豆的外表带有一层白霜，用筷子搅拌时，会拉出粘丝，拉丝越多越好。
纳豆常配入海鲜酱油、芥末等调味料直接食用，也可烹制各类菜肴。
纳豆需要冷藏保鲜，保质期一般在7~10天。
近几十年来，随着纳豆的有益健康的功能不断被发现，纳豆在日本风靡全国，不断掀起"纳豆热潮"。
目前，日本纳豆产业的年销售额已达2000亿日元(折合150亿人民币)。
(2)、纳豆激酶的生产工艺：1：生产纳豆激酶有两种做法。
一是考虑到纳豆激酶属于高分子物质，所以只要将高分子物质抽取出来即可。
但是用这种方法纳豆中的维他命和纳豆菌也会一起被舍弃掉。
另一种方法是有选择地抽取纳豆菌和纳豆菌的副产物。
用这种方法的话，纳豆菌中所包含的全部的物质都有可能抽取出来。
两种抽取方法谁优谁劣可谓一目了然。
生产的纳豆激酶粉末含有纳豆菌所能生成的全部物质。
正因为如此，能够生产自然的、稳定性高的纳豆激酶粉末。
详细请登陆 2、纳豆激酶纳豆中的纳豆激酶是直接分解血栓的纤维蛋白酶。
具有强大的溶栓作用，比尿激酶的能力还要强，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600FU，在胃肠中不失活。
纳豆激酶对血栓的作用时间长，与尿激酶3~5分钟作用时间相比，纳豆激酶作用长达8小时，而且安全、无副作用。
食用纳豆后，测定血液中形成血栓的物质会慢慢减少，溶解血栓的物质会越来越多，达到动态平衡。
常吃纳豆还会将毛细血管中的血栓溶解掉，有效改善微循环障碍。
A、人体实验结果发现纳豆激酶有以下作用：(1)缩短血栓溶解时间(2)增加血栓溶解面积(3)增加血栓溶解产物上图()是：纳豆消除体内血栓的临床实验(西村《视膜中心静脉闭塞症的治疗效果》)。
纳豆激酶生产工艺纳豆知识1、纳豆和纳豆激酶的生产工艺(1)、纳豆的生产过程：精选小粒黄豆→浸泡→清洗→蒸煮→沥干→降温至70度→无菌接种(纳豆菌)→35-52度培养24-36小时→分装→冷冻保存→纳豆纳豆是日本的传统食品，是选用优质黄豆经纳豆菌生物发酵而成。
纳豆的外表带有一层白霜，用筷子搅拌时，会拉出粘丝，拉丝越多越好。
纳豆常配入海鲜酱油、芥末等调味料直接食用，也可烹制各类菜肴。
纳豆需要冷藏保鲜，保质期一般在7~10天。
近几十年来，随着纳豆的有益健康的功能不断被发现，纳豆在日本风靡全国，不断掀起"纳豆热潮"。
目前，日本纳豆产业的年销售额已达2000亿日元(折合150亿人民币)。
(2)、纳豆激酶的生产工艺：1：生产纳豆激酶有两种做法。
一是考虑到纳豆激酶属于高分子物质，所以只要将高分子物质抽取出来即可。
但是用这种方法纳豆中的维他命和纳豆菌也会一起被舍弃掉。
另一种方法是有选择地抽取纳豆菌和纳豆菌的副产物。
用这种方法的话，纳豆菌中所包含的全部的物质都有可能抽取出来。
两种抽取方法谁优谁劣可谓一目了然。
生产的纳豆激酶粉末含有纳豆菌所能生成的全部物质。
正因为如此，能够生产自然的、稳定性高的纳豆激酶粉末。
详细请登陆 2、纳豆激酶纳豆中的纳豆激酶是直接分解血栓的纤维蛋白酶。
具有强大的溶栓作用，比尿激酶的能力还要强，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600FU，在胃肠中不失活。
纳豆激酶对血栓的作用时间长，与尿激酶3~5分钟作用时间相比，纳豆激酶作用长达8小时，而且安全、无副作用。
食用纳豆后，测定血液中形成血栓的物质会慢慢减少，溶解血栓的物质会越来越多，达到动态平衡。
常吃纳豆还会将毛细血管中的血栓溶解掉，有效改善微循环障碍。
A、人体实验结果发现纳豆激酶有以下作用：(1)缩短血栓溶解时间(2)增加血栓溶解面积(3)增加血栓溶解产物上图()是：纳豆消除体内血栓的临床实验(西村《视膜中心静脉闭塞症的治疗效果》)。
纳豆激酶的提取、提纯程序及活性测定孙雪天津工业生物技术研究所2013E8018261011由于我们实验室较少做酶的分离提纯，所以我选择了自己比较感兴趣的一种酶——纳豆激酶。
选择此酶的理由：人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心脑血管疾病，对中老年人的身体健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者约1 500 万人，潜在的溶栓剂市场有20 亿美元[1]。
但当前的溶栓剂，如尿激酶( SK) 和链激酶(UK) ，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂，存在着价格高的缺点等，难以成为适用于大众的药品。
而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点[2] ，市场前景极为诱人。
［3］纳豆激酶(Nattokinase , N K; 也称Subtilisin NAT ,Subtilisin BSP) 是由纳豆菌( Bacill us subtilis var. nat to) 产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶( Subtilisin)，属于水解酶类，催化蛋白质的水解。
现在可以由分离纯化的纳豆激酶DNA 序列推出其氨基酸序列,根据该顺序计算出该酶的分子量为27 728 u[4 ]，远小于尿激酶的分子量54 000 u。
用Svunsson柱型电泳法等电聚焦测得纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其p I 值为8. 6 ±0. 3。
[5 ]提取提纯程序：纳豆激酶是胞外酶［6］，故可利用纳豆菌的发酵液提取，省去了细胞破碎和缓冲液抽提的步骤。
具体方法如下［7］：（1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4 000 rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。
（2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。
取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年第35卷第5期纳豆激酶(NK)是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直接溶解血栓[1]。
研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩增的具有潜在药用价值的物质。
近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸附技术、混合模式扩张床吸附技术等。
以上分离Study on technology for extracting nattokinase by ultrafiltrationCHEN Jing-xin,LIU Yan-yan,SHA Wei,ZHANG Li-ping *(The Food Science of Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319)Abstract:Objective ：Studyed the impact of membrane flux on utrafiltration system pressure,ultrafiltration temperature and pH,determined the optimum conditions of nattokinase separation.Methods:the raw materials was prepared from crude nattokinase liquid,by ultrafiltration and chromatography determined the specific activity,purification multiples and recovery rate.Results:The optimized conditions were as following:reaction pressure 0.25MPa,liquid temperature 37℃,liquid pH 7,the specific activity 9610.46IU/mg,the purification multiple 2.36and the recovery rate 92.3%,the purified enzyme was demonstrated by SDS -PAGE to be a homogeneous protein,molecular mass was about 28000u.Conclusion:It is feasible to separate and purify nattokinase by using ultrafiltration technology,and it can elevate activity and the recovery rate.Key words:nattokinase;ultrafiltration;enzyme activity;purification multiple;recovery 陈景鑫，刘妍妍，沙维，张丽萍*(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319)摘要：目的：研究超滤系统中超滤压力、超滤温度、料液pH 值主要参数对膜通量的影响，确定超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件。
（提高纳豆激酶的方法）自制纳豆,游刃有余三、提高纳豆激酶的方法材料一:纳豆激酶的生产提供一种得率高，酶活高，成本低，可进行产业化生产的纳豆激酶的生产方法。
依次包括下述两个步骤：(一)、发酵；所述第的发酵是固体发酵，该发酵过程依次有如下工序:①用特制浸泡液浸泡优质黄豆，所述的特制浸泡液的配方为：牛肉浸膏5～l0g，蛋白胨4～12g，酵母浸出汁3—8g，NaCl 5～l0g，葡萄糖l5～20g，自来水l000ml，PH值为6.8～7，浸泡到黄豆吸足水份，豆无硬心，表面无皱纹为止；②装瓶灭菌接种：采用常规灭菌方法，等瓶温自然冷却至40℃以下，在无菌条件下接种，接种所用的菌种是枯草芽孢杆菌；③培育：采用常规培养条件；采用高低温培养方法，先在37℃下培养22—32小时后马上转入3～10℃条件下保温，l2～24小时获得发酵物。
(二)、将经发酵步骤后得到的干燥物粉碎；①干燥：采用常规方法。
干燥工序中采用的是将发酵物进行低温真空冷冻干燥，发酵物水分小于l5％时干燥结束。
②粉碎是采用细胞破壁技术。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物，其特殊之处在于：制备片剂、冲剂、硬胶囊、软胶囊或口服液时，在所得产物中直接添加可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糊精(等)配料调整至每克内有200～680的酶活单位。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物每克内有200～380的酶活单位，具有预防心血管疾病的作用。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物每克内有300～680的酶活单位，具有治疗心血管疾病的作用。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的冻干粉每克内含大于800的酶活单位，制备的针剂纯度达95％以上。
下面将通过实施例对方案作详细叙述：第一部分：纳豆激酶的生产方法1、使用特制浸泡液的实施例及其与使用常规浸泡液的产物酶活比较实验条件：300ml三角瓶加入特制浸泡液浸泡过的大豆l0g，调PH7，121℃灭菌15min，接入枯草芽孢杆菌斜面菌种，在37℃条件下培养24小时，常规干燥、常规粉碎后测定酶活。
纳豆激酶的生产提取工艺
纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。
具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。
一、发酵液生产
1、菌种活化
无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
2、种子液的制备
种子培养基成分
无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L
其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）
挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。
3、发酵培养
无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L
其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）
按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。
二、预处理和固液分离
采用离心的方法。
将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。
收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。
三、提取
1、分级盐析法
使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。
将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。
再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。
将过夜的发酵液4 ℃冷冻离心10 min，离心转速10000 r/min，得到的沉淀为含有少量杂蛋白的纳豆激酶。
2、超滤的方法
由于纳豆激酶的相对分子量大于超滤膜的的截留相对分子质量，可利用小分子及水能够透过半透膜而纳豆激酶被截留的原理进行除盐。
将上述的盐析沉淀溶解后，使用超滤装置，将盐析液在空压（0.1 Mpa）下进行超滤（膜截留相对分子质量为1.0×104），期间不断向截留液补加蒸馏水。
超滤大约持续1h，超滤过程中不断取出少许透过液，加入溶液，检测是否白色沉淀产生，如无沉淀说明盐离子己除净，超滤结束。
四、精制
1、离子交换层析
离子交换层析是利用高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行分离的方法。
蛋白质的等电点是离子交换层析的重要依据，文献报道的纳豆激酶的等电点pI 8.6±0.3，选择SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换树脂对纳豆激酶进一步分离纯化。
将弱阳离子交换剂SP Sepharose Fast Flow装柱,用一定体积的0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)平衡离子交换层析柱。
静置待沉降后用缓冲液以3 mL/min 流速压住，继续用样品缓冲液润洗树脂，直到离子强度及蛋白质浓度洗脱至基线，洗脱液pH与样品缓冲液pH 一致；纳豆激酶经盐析得到的粗酶液经超滤脱盐后,调整离子强度及pH，然后将粗酶液缓慢加入层析柱中，打开柱出口，让酶液进入树脂，
直到酶液表面与树脂的表面重合，关闭出口；先用先用0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)洗脱未吸附的蛋白，然后用含0.5 mol/L NaCl 的0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH6.0)缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
2、凝胶过滤层析
凝胶过滤,亦称分子筛层吸附、排阻层析。
它是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析的一种方法。
文献报道纳豆激酶的分子量27.300-35.000 KDa，因此选择Sephadex G-75 凝胶对纳豆激酶进行进一步的分离纯化。
凝胶的预处理：称取一定量的Sephadex G-75 凝胶，加入100倍的0.2 mol/L p H7.5 磷酸盐缓冲液后恒温水浴加热，逐渐升高温度至近沸，缓慢搅拌持续2 h后取出，冷却至室温即可。
此法既可以杀菌消毒，同时可以排除凝胶内的气泡。
凝胶过滤层析：首先向凝胶柱中加入约1/3 柱高的缓冲液，打开层析柱出口，当有液体流出时关闭出口，以排除层析柱下层支撑滤片下空隙里的气泡。
然后将溶胀好的凝胶和缓冲液按3:1 的比例混匀成的凝胶浆边搅拌边缓慢、连续沿玻璃棒加入层析柱中（此过程必须一次完成，不能间断，否则柱面不平影响分离效果），当凝胶加到柱顶端后，打开柱底出口加快装住过程，然后用约3倍柱体积的缓冲液洗脱平衡凝胶柱。
打开凝胶柱下端出口，当缓冲液平面与凝胶面相平时关闭出口，将离子交换层析中有纳豆激酶酶活的洗脱液缓慢加入柱中，当酶液全部渗入凝胶中，缓慢加入约4cm 高的缓冲液后开始洗脱。
收集洗脱液。
3、SDS-PAGE 电泳检测
将凝胶过滤层析中的洗脱液收集后，进行SDS-PAGE 电泳检测。
将样品浓缩，与样品缓冲液（20μL+5μL）在离心管内混合均匀，100 ℃沸水浴中加热5 min，待冷却至室温后将20μL 样品注入点样孔中；连接好电极，调整电压为40 V，电泳约30 min 至分离胶，然后重新调整电压为100 V，电泳约 2 h 至溴酚蓝靠近凝胶的底部，关闭电源，电泳结束，得到电泳图，若得到单一的纳豆激酶蛋白条带，表明分离得到的纳豆激酶已经达到电泳纯。
五、成品制作
将上述得到的高纯度的纳豆激酶溶液用孔径的10Kda的中空纤维膜超滤浓缩，再将得到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到纳豆激酶粉末。
也可采用冷冻浓缩的方法对溶液进行浓缩，和可采用喷雾干燥的方法得到纳豆激酶干粉。
