纳豆激酶集成化分离技术

中科院力学所科技成果——低成本高纯度纳豆激酶
的生产技术
技术介绍及特点
以由黄豆或鹰嘴豆等发酵得到的粗品纳豆激酶作为原料，通过批量结晶纯化的方法获得高纯度纳豆激酶，具有的技术特点如下：（1）工艺简单
在粗品纳豆激酶溶液中通过加入多种环境友好的试剂，在室温条件下经搅拌、静置生长一段时间（2-5天）后，粗品纳豆激酶中的杂质留在溶液中，溶液中的固体为纳豆激酶晶体。

简单固/液分离后即可得到高纯度纳豆激酶。

高纯度纳豆激酶生产工艺适宜于工业化生产。

（2）产品纯度高
纳豆激酶晶体纯度不低于80%。

实验室制备的10ml级纳豆激酶晶体溶液（左图）
纳豆激酶晶体照片（右图）
（3）产品成本低
公司单价（元/g）
大和公司（日本）：84
和光纯药公司（日本）：130
燕京啤酒（中国）：124
我们制备的高纯纳豆激酶：40
备注：其他公司的产品非高纯纳豆激酶。

应用领域及前景分析
应用领域：特膳食品、功能性食品、保健品等。

前景分析：国内预制食品产业达到1万亿。

特膳食品属于功能性预制食品，目前正处于市场的起步阶段，纳豆激酶特膳食品在预制食品应用市场上是个空白，因此将有巨大的市场空间。

知识产权情况
结晶纯化工艺目前作为商业秘密，未申请专利。

检索国内外文献，未能检索到相关的纯化工艺报道，也未能检索到高纯纳豆激酶的工业化生产的报道。

纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究董志奎,杨　超,尹宗宁,李　萌(四川大学华西药学院,四川成都610041) 摘　要:目的研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质。

方法纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )分离纯化,采用T AME 法测定酶的活性,通过S DS 2PAGE 对纯化结果进行了检验。

结果S DS 2PAGE 中显示单一色带,相对分子质量28000,以T AME 为底物时纳豆激酶的米氏常数(K m )为35.47mm ol/L ,最适宜的温度37℃,最适宜pH 为8.6。

结论该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶。

关键词:纳豆激酶;分离纯化;酶学性质;米氏常数(K m ) 中图分类号:Q55;T Q464.8 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0520298204Study on puri fication and enzyme kinetics of nattokinaseDONG Zhi 2kui ,Y ANG Chao ,YI N Z ong 2ning ,LI Meng(West China School o f Pharmacy ,Sichuan Univer sity ,Chengdu 610041,China ) Abstract :Purpose T o study the techniques of the separation and purification of the nattokinase and itscharacterization.Methods The natuokinase extract was purified by gel 2chromatography (Superdex75)and poly 2acrylamide gel electrophoresis (PAGE ).The purified nattokinase was tested by S DS 2PAGE ,and the T AME method was used to determine the activity of the enzyme.R esults There was only one strip in the S DS 2PAGE atlas ,and the m olecular weight of nattokinase was 28kDa.The Michaelis constant (K m )of nattokinase was 35.47mm ol/L when T AME was the substrate ,and the best reaction tem perature was 37℃and the best reac 2tion pH was 8.0.Conclusion Purified nattokinase can be obtained by the the techniques of the separation and purification.K ey w ords :nattokinase ;separation and purification ;characterization ;michaelis constant (K m )收稿日期:2009203225基金项目:国家自然科学基金项目(30371696)作者简介:董志奎(19842),男,药剂专业在读硕士研究生;尹宗宁(19642),女,通信作者,副教授,T el :028*********,E 2mail :yzn @scu. 。

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。

1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。

研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。

进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。

为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。

1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。

纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。

血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。

主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。

文章编号： １０００－１３３６（２００９）01－0134-04纳豆激酶聂光军 岳文瑾（安徽工程科技学院生物化学工程系，芜湖２４１０００）摘要：纳豆激酶是一种枯草杆菌酶，具有较强的纤溶活性和溶栓功能，是一种治疗心脑血管疾病的理想候选药物。

目前，纳豆激酶分离方法、纳豆激酶功能、结构及其应用、纳豆激酶工程菌构建已成为纳豆激酶的研究热点，也成为未来纳豆激酶研究的导向。

关键词：纳豆激酶；基因工程菌中图分类号：Ｑ５５收稿日期：　２００８－０９－２４安徽省高校自然科学基金项目（ＫＪ２００７Ｂ１１４）；芜湖市科技计划重点项目（２００７－１２６）资助作者简介：聂光军（１９７６－），男，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｏｉｎ－ｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；岳文瑾（１９７９－），女，硕士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｗｅｎｊｉｎ＿７９＠１６３．ｃｏｍ目前，全球每年因血栓病致死人数达１２００万人，接近世界总死亡人数的四分之一。

抗血栓药物需求量很大，但临床使用的抗血栓药物普遍存在着稳定性差和药效短等缺点，迫切需要一种低价高效、易吸收、体内半寿期长以及使用方便的治疗心脑血管疾病的药物或保健品。

纳豆激酶（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，　ＮＫ）是一种高效血栓溶解酶，具有较好的纤溶活性和溶栓功能，它源于传统发酵食品，生产工艺简单，安全性高［１］。

因此，世界上很多国家都在研究ＮＫ，其中日本的研究较为广泛深入。

我国很多高校和研究院所也在进行ＮＫ的研究。

近期研究主要包括ＮＫ的酶学性质、结构、功能及其应用研究，以及ＮＫ的提取工艺、工程菌构建等。

１． ＮＫ的稳定性影响ＮＫ稳定性的主要因素有温度、ｐＨ值和金属离子等。

ＮＫ低于４５　ºC 时活性相对稳定，高于６０ºC 逐渐失活，反复冻融５次后，该酶仍能保持９５％以上的活性。

室温下，在ｐＨ　７￣１２范围内较为稳定，ｐＨ　７￣９范围内酶活性最为稳定，但ｐＨ＜５性质则不稳定。

王萍等报道［２］ＮＫ纤溶活性最适ｐＨ为８．０，ｐＨ　６￣１０溶液中４０　ºC 以下基本稳定，ｐＨ＜５失去纤溶活性。

纳豆激酶论文：纳豆激酶的优化、提取分离纯化及基因克隆【中文摘要】心脑血管性疾病,具有“发病率高、致残率高、死亡率高、并发症多”等特性。

2005年,世界卫生组织(WHO)调查表明,全世界每年约有1700万人死于心脑血管疾病。

并且随着人类生活水平的提高以及生活压力的增加,而呈现年轻化的趋势,而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病。

所以,血栓的防治已是当务之急。

虽然传统药物在心脑血管及血栓栓塞性疾病防治上疗效显著,但毒副作用严重;而传统大豆发酵食品不仅效果显著且安全无毒,可作为一种具有开发和利用价值的功能性预防保健食品。

据文献记载,纳豆源于中国的豆豉,通过佛教由中国传入日本,日本人均寿命长的原因除了与较为优良的自然环境有关外,更重要的是其膳食结构中,发酵食品特别是消费量最大的纳豆,是日本人长寿的秘方,视为国宝级食品。

寺院喜食大豆是因为其蛋白质含量高达35.3%,而由纳豆菌产出的酶,能使50%的蛋白质变为水溶性,消化率可达80%。

还含氨基酸、维生素、植物性脂肪等。

据科学研究表明,纳豆食品不仅调整胃肠功能明显,还具有治疗感冒、痢疾、胀气、胃肠炎、消化不良、残便、便秘等功效,还有防治糖尿病,抑制血栓的生成和溶解血栓的作用,是一种延年益寿、健康的美容食品。

可以说纳豆是一种自然食品,是人类生活智慧的产物。

1987年日本的Sumi博士首次从日本传统食品纳豆中分离出一种具有强烈纤溶作用的碱性蛋白酶并命名纳豆激酶(nattokinase,NK)。

它不但能直接作用交联纤维蛋白,而且还可激活体内的纤溶酶原,从而表现出很强的溶血栓作用。

据报道其制品具有水解淀粉样蛋白,降低血浆纤维蛋白原的第七因子和第八因子,降低血液粘度、降血脂、降胆固醇,降血压,改善血液循环状态,维持血细胞的正常形态和功能,有利于神经损伤的再生,抑制骨质疏松症、抑制动脉粥样硬化等多种功能。

由于NK具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血,作用时间长,胃肠道稳定性好,可由细菌发酵生产、也可由基因工程菌生产等优点,有望被开发为新一代的口服抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。

纳豆激酶分离纯化研究进展
黄妍;张勋力;张迎庆
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2017(043)012
【摘要】纳豆激酶是枯草芽孢杆菌发酵过程中产生的一种碱性蛋白酶,具有较强的溶栓作用.与其他溶栓剂相比,纳豆激酶易被吸收,作用迅速,安全性好,可做为新型溶栓剂.文中概述了纳豆激酶的理化性质和作用机制,着重介绍了纳豆激酶的几种常见的分离纯化方法,包括柱层析法、超滤法、萃取法和亲和颗粒法,以及集成化分离纯化技术,并对纳豆激酶分离纯化的新方法进行了展望,以促进纳豆激酶的深入开发和应用.
【总页数】6页(P283-288)
【作者】黄妍;张勋力;张迎庆
【作者单位】湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉,430068;北京纳百恩食品有限公司,北京,102200;湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北武汉,430068【正文语种】中文
【相关文献】
1.枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质 [J], 王刚;郭明珠;陈光
2.纳豆激酶NKⅡ分离纯化及其酶促动力学研究 [J], 李睿;阮文辉
3.纳豆激酶的制备与分离纯化研究进展 [J], 王镭
4.纳豆激酶分离纯化和酶活性测定的研究进展 [J], 法芸;张金玲;赵海杰;刘会洲
5.纳豆激酶分离纯化技术的研究进展 [J], 阳承利;邢建民;刘俊果;刘先桥;刘会洲
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纳豆激酶分离纯化工艺与缓释片剂的研究的开题报告标题：纳豆激酶分离纯化工艺与缓释片剂的研究背景：纳豆激酶是一种来源于日本传统食品纳豆（发酵大豆）的特殊蛋白质，具有多种生物学功能，如抗菌、抗氧化、消炎、降压等。

因此，其在医药和食品工业中得到了广泛的应用和研究。

纳豆激酶能够水解纤维蛋白原、胶原蛋白等蛋白质，可用于治疗血栓、血管阻塞、溃疡、动脉硬化等疾病。

目前，纳豆激酶的分离纯化和制备工艺还存在一定的难度，为了更好地发挥其生物学功能，需要进一步探索高效的分离纯化工艺。

同时，纳豆激酶的药物制剂和食品制品中使用需要考虑其制剂的稳定性和溶出度等，为此，需要研究自控释、缓释等技术，提高其处方的长效稳定性和药效。

研究内容：本研究将通过以下几个方面开展：1. 纳豆激酶的分离纯化工艺研究。

采用离子交换柱、凝胶过滤柱等层析技术和超滤、凝胶电泳等分离技术，尽可能地提高分离纯化效率和纯度，寻找高效且经济的纳豆激酶分离纯化工艺。

2. 纳豆激酶的表征与活性测定。

通过SDS-PAGE、Western blot、尺寸排除色谱和动力学测定等手段对分离纯化后的纳豆激酶进行表征与活性测定，以确定其纯度和活性，并优化分离纯化工艺。

3. 纳豆激酶缓释片剂的制备与评价。

采用聚乙二醇、羟基丙基甲基纤维素等多种缓释控释剂，对纳豆激酶制备不同控释性质的片剂，并研究其在模拟生理条件下的缓释效果和稳定性。

预期成果：1. 建立高效、经济的纳豆激酶分离纯化工艺流程，获得高纯度的纳豆激酶。

2. 确定纳豆激酶的活性与特征，为进一步研究应用提供基础数据。

3. 制备纳豆激酶缓释片剂，并评价其缓释性质和稳定性。

意义：纳豆激酶在医药和食品行业中具有广泛的应用前景，但其在分离纯化和制备缓释剂方面还存在一定的挑战。

本研究将对纳豆激酶的分离纯化、活性特征、缓释控释片剂制备、缓释控释效果等问题进行探索。

通过本研究，可以为纳豆激酶相关产品的开发和应用提供技术支持。

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2010年第35卷第5期纳豆激酶(NK)是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直接溶解血栓[1]。

研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩增的具有潜在药用价值的物质。

近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸附技术、混合模式扩张床吸附技术等。

以上分离Study on technology for extracting nattokinase by ultrafiltrationCHEN Jing-xin,LIU Yan-yan,SHA Wei,ZHANG Li-ping *(The Food Science of Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319)Abstract:Objective ：Studyed the impact of membrane flux on utrafiltration system pressure,ultrafiltration temperature and pH,determined the optimum conditions of nattokinase separation.Methods:the raw materials was prepared from crude nattokinase liquid,by ultrafiltration and chromatography determined the specific activity,purification multiples and recovery rate.Results:The optimized conditions were as following:reaction pressure 0.25MPa,liquid temperature 37℃,liquid pH 7,the specific activity 9610.46IU/mg,the purification multiple 2.36and the recovery rate 92.3%,the purified enzyme was demonstrated by SDS -PAGE to be a homogeneous protein,molecular mass was about 28000u.Conclusion:It is feasible to separate and purify nattokinase by using ultrafiltration technology,and it can elevate activity and the recovery rate.Key words:nattokinase;ultrafiltration;enzyme activity;purification multiple;recovery 陈景鑫，刘妍妍，沙维，张丽萍*(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319)摘要：目的：研究超滤系统中超滤压力、超滤温度、料液pH 值主要参数对膜通量的影响，确定超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件。

[3]Giuseppe Toscano, Domenico Pirozzi, Michele Maremonti,et al. Kinetics of enzyme deactivation: a case study[J]. Ca-talysis Today, 1994, 22: 489-510.[4]Ludikhuyze L, De Cordt S, Weemaes C, et al. Kinetics forheat and pressure-temperature inactivation of Bacillus subtilis amylase[J]. Food Biotechnology, 1996, 10(2): 105-129. [5]Lenonard S J, Merson R L, et al. Estimating thermal degrada-tion in processing of foods[J]. J Agric Food Chem, 1986, 34(3): 392-396.[6]孙梅君. 番茄中果胶酯酶耐热性的研究[J]. 食品与发酵工业, 1992, (5): 13-20.[7]汪李严. 耐高温α-淀粉酶及其在食品工业的应用[J]. 食品科学, 1991, (12): 27-29.[8]Ashim K Datta. Error Estimates for approximate kineticparameters used in food literature[J]. Journal of Food Engineering, 1993, 18: 181-199.[9]芝畸勋[日]. 新编食品杀菌工艺学[M]. 许有成, 译. 北京:农业出版社, 1990.[10]杨宗政. 耐温淀粉酶溶液蒸发浓缩过程中的质量评估[D].天津轻工业学院学位论文, 2000.[11]天津轻工业学院, 无锡轻工业学院. 食品工艺学(上册)[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1984.纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究王萍1,2，陈钧1，杨小明1，鲍艳霞1(1.江苏大学生环学院制药工程系，江苏镇江 212013；2.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045)摘 要：经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤，从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶，纯化倍数15.6，回收率10.2%，SDS-PAGE电泳显示为二个组分，分子量在29000左右。

《生物工程下游技术》综合实验——纳豆激酶的分离纯化摘要从纳豆发酵液中提取纳豆激酶，采用30~70%饱和度的硫酸铵盐析，Sephadex G-75凝胶过滤层析对活性组分进行分离提纯。

然后检测各个步骤的样品的蛋白质含量，绘制凝胶层析图，得出峰值，最后对整个纯化方案进行评价。

结果表明，本次实验纯化回收率较低。

凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。

凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。

关键词：纳豆激酶硫酸铵盐析凝胶层析目录1 前言 (4)2 材料和仪器 (4)2.1 仪器 (4)2.2 材料 (4)2.3 试剂及溶液配制 (4)3 实验方法 (5)3.1 纳豆的制作 (5)3.2 纳豆激酶的粗提 (5)3.2.1 浸提 (5)3.2.2 硫酸铵盐析 (5)3.3 Sephadex G-75凝胶层析进行纯化 (6)3.4 蛋白质含量的测定 (7)4 结果与分析 (7)4.1 蛋白质含量测定结果 (7)4.2 层析收集液测定结果 (7)4.2.2 绘制纳豆激酶的层析图 (8)4.2.3 纯化方案进行评价 (9)5 讨论 (9)5.1方法分析 (9)5.2 问题及其猜想 (10)参考文献 (12)1 前言心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。

而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。

鹰嘴豆纳豆发酵工艺优化及纳豆激酶的分离纯化研究鹰嘴豆纳豆发酵工艺优化及纳豆激酶的分离纯化研究鹰嘴豆纳豆是一种富含蛋白质、纤维素和多种矿物质的传统发酵食品，其由于其独特的味道和丰富的营养价值而备受广大消费者的喜爱。

然而，传统的鹰嘴豆纳豆发酵工艺存在一些问题，例如发酵时间长、产量低、工艺复杂等，限制了其规模化生产和市场竞争力的提升。

因此，本研究旨在优化鹰嘴豆纳豆的发酵工艺，并进一步研究纳豆激酶的分离纯化方法，为其工业化生产和功能性食品的开发提供科学依据。

首先，我们针对传统的鹰嘴豆纳豆发酵工艺进行了优化。

传统工艺中的发酵时间较长，影响了产量和产品的质量。

为了解决这一问题，我们通过改变发酵温度、发酵时间、发酵菌种和发酵容器等因素，进行了一系列试验。

结果表明，在发酵温度为30-35摄氏度，发酵时间为40-48小时，采用优质菌种的条件下，鹰嘴豆纳豆的发酵效果最佳。

相比传统工艺，新工艺缩短了发酵时间，提高了产量和产品质量，能够满足市场需求。

接下来，我们着重研究纳豆激酶的分离纯化方法。

纳豆激酶是鹰嘴豆纳豆中的一种天然酶，具有改善血液循环、预防心血管疾病以及抗凝血等功能。

然而，由于其在鹰嘴豆纳豆中含量较低且存在复杂的分子结构，传统的分离纯化方法往往效果不佳。

因此，我们采用离子交换层析、凝胶过滤和分子筛等方法，优化了纳豆激酶的分离纯化步骤。

通过紫外吸收光谱和凝胶电泳等分析方法，确定纳豆激酶的活性和纯度，从而得出具有较高纯度的纳豆激酶。

最后，我们评估了采用优化后的工艺制备的鹰嘴豆纳豆以及纯化后的纳豆激酶的功能性。

结果显示，优化后的鹰嘴豆纳豆在口感、气味和营养成分等方面均显著优于传统工艺。

同时，纯化后的纳豆激酶在改善血液循环、降低胆固醇和防治心血管疾病等方面也具有良好的效果。

这些结果表明，优化后的工艺和纯化方法不仅能够提高鹰嘴豆纳豆的品质和产量，还能够获得高纯度的纳豆激酶，为该食品的开发和应用提供了重要的科学基础。

综上所述，本研究对鹰嘴豆纳豆的发酵工艺进行了优化，并成功分离纯化了纳豆激酶。

专利名称：一种纳豆激酶的分离纯化方法专利类型：发明专利
发明人：欧志敏,程朋朋,卢媛,王金美,张楚玥申请号：CN202111586604.5
申请日：20211223
公开号：CN114250216A
公开日：
20220329
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种纳豆激酶的分离纯化方法，将纳豆激酶粗品用缓冲液溶解后过滤，滤液作为上样液进行DEAE‑SephadexA‑50阴离子交换柱层析；上样结束后，先以0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速度10s/滴，采用色谱工作站监测流出液，出峰前按每10min/管收集，出峰处每个峰收集，洗脱至流出液不出峰；合并含有纳豆激酶蛋白和酶活的流出液，超滤，滤液冻干，即为纳豆激酶纯酶。

本发明方法简化了纯化步骤，降低了纯化过程中酶的损失，大幅缩减纯化所需时间和成本，电泳纯纳豆激酶，比活达到了90080.6U/mg，纯化倍数为3.2，酶活回收率为82.62％。

申请人：浙江工业大学
地址：310014 浙江省杭州市拱墅区潮王路18号
国籍：CN
代理机构：杭州天正专利事务所有限公司
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