纳豆激酶的提取研究

纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究董志奎,杨　超,尹宗宁,李　萌(四川大学华西药学院,四川成都610041) 摘　要:目的研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质。

方法纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )分离纯化,采用T AME 法测定酶的活性,通过S DS 2PAGE 对纯化结果进行了检验。

结果S DS 2PAGE 中显示单一色带,相对分子质量28000,以T AME 为底物时纳豆激酶的米氏常数(K m )为35.47mm ol/L ,最适宜的温度37℃,最适宜pH 为8.6。

结论该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶。

关键词:纳豆激酶;分离纯化;酶学性质;米氏常数(K m ) 中图分类号:Q55;T Q464.8 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0520298204Study on puri fication and enzyme kinetics of nattokinaseDONG Zhi 2kui ,Y ANG Chao ,YI N Z ong 2ning ,LI Meng(West China School o f Pharmacy ,Sichuan Univer sity ,Chengdu 610041,China ) Abstract :Purpose T o study the techniques of the separation and purification of the nattokinase and itscharacterization.Methods The natuokinase extract was purified by gel 2chromatography (Superdex75)and poly 2acrylamide gel electrophoresis (PAGE ).The purified nattokinase was tested by S DS 2PAGE ,and the T AME method was used to determine the activity of the enzyme.R esults There was only one strip in the S DS 2PAGE atlas ,and the m olecular weight of nattokinase was 28kDa.The Michaelis constant (K m )of nattokinase was 35.47mm ol/L when T AME was the substrate ,and the best reaction tem perature was 37℃and the best reac 2tion pH was 8.0.Conclusion Purified nattokinase can be obtained by the the techniques of the separation and purification.K ey w ords :nattokinase ;separation and purification ;characterization ;michaelis constant (K m )收稿日期:2009203225基金项目:国家自然科学基金项目(30371696)作者简介:董志奎(19842),男,药剂专业在读硕士研究生;尹宗宁(19642),女,通信作者,副教授,T el :028*********,E 2mail :yzn @scu. 。

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。

1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。

研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。

进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。

为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。

1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。

纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。

血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。

主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。

纳豆激酶药用研究与开发可行性研究报告可行性计划栓塞性疾病严重地危害着人类的生命健康,尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中、老年人健康最严重而又常见的疾病之一。

血栓症日渐成为死亡率占首位的病症。

溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段。

因此,对溶栓药物的研究已被广为重视。

链激酶(SK) 、尿激酶(UK) 作为第一代溶栓药物在临床上广为应用,但它们均对纤维蛋白无特异性选择作用,容易引起全身性纤溶激活并伴有出血倾向、半衰期短等缺点。

同时SK还具有抗原性并有过敏性反应。

而作为第二代纤溶药物的tPA 尽管对纤维蛋白有很高的选择性,但临床上为了取得较好的溶栓效果而应用大剂量(100mg) 从而部分失去了对纤维蛋白的选择性。

因此依旧会导致出血等副作用。

此外临床上试用的第二代新药还有茴香酰纤溶酶原-链激酶复合物、重组单链尿激酶和葡激酶。

但茴香酰纤溶酶原-链激酶复合物对纤维蛋白的选择性并未能证实;重组单链尿激酶溶栓效果慢且易造成出血;葡激酶虽然具有较强的纤维蛋白选择性,但由于其为细菌成分,因此也具有抗原性。

尽管这些溶栓药物的纤溶作用优于第一代溶栓药,但它们依然具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。

鉴于此,开发新型溶栓药物已成为重要的研究课题之一。

目前,纳豆激酶(NK) 作为来自于食品,高效安全并可直接由消化道吸收,起到溶解纤维蛋白作用的纤溶1酶,正在成为当今溶栓药研究的焦点。

1、药理实验研究结果表明:将纳豆和纳豆的提取物置于人工制作的纤维蛋白平板上有明显的溶圈,显示出明显的溶纤作用，精制品的单位酶活约为5280u/mg。

在食用纳豆的人的血浆中观察到纤维蛋白溶解活性, 并在食用2,8h后活性逐渐提高。

在NK 服用者的血中观察优球蛋白溶解时间(ELT)、优球蛋白的纤溶活性( EFA) 以及纤维蛋白降解产物(FOP) 的变化发现,ELT大大降低,而EFA提高,且在口服后第4d 达到最高,并可维持到第8d;同时FOP 在口服后第一天即迅速达到最高值。

纳豆激酶的生产提取工艺纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。

具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。

一、发酵液生产1、菌种活化无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

2、种子液的制备种子培养基成分无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。

3、发酵培养无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。

二、预处理和固液分离采用离心的方法。

将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。

收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。

三、提取1、分级盐析法使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。

将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。

再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。

纳豆激酶液态发酵提取工艺及酶性质的研究纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌亚种纳豆菌发酵产生的一种酶,该酶安全无毒且成本低廉和能口服吸收,具有不易引起出血、无抗原性、半衰期长等优点,是一种良好的溶血栓的保健食品。

本试验为开发新一代的纳豆激酶胶囊,做了如下探讨:（1）本文从山东临沂豆豉和纳豆菌粉中分离得到数株产蛋白酶能力菌株,通过液态发酵测定蛋白酶活力,筛选出一株高产蛋白酶的菌株并命名为BN。

对BN进行菌落特征、细胞形态、生理生化试验以及16s rDNA分子生物学鉴定,确定该菌株为纳豆芽孢杆菌。

（2）将上述分离纯化的菌株BN进行发酵产酶条件的优化,通过测定种子液中的OD660nm确定其最适种龄为15²0h。

利用单因素试验优化的发酵碳源和氮源分别为:可溶性淀粉和酵母膏;采用正交试验确定的无机盐最佳的添加量为K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.1%和CaCl2 0.05%;利用响应面设计法分析优化的发酵条件为接种量3%,温度40℃,pH7.0,发酵时间84h;在优化条件下产生的纳豆激酶活力达到749.41U/mL。

（3）试验采用冷冻离心除菌体、分级盐析和透析除盐粗分离纯化纳豆激酶,将分离纯化的酶液经SDS-PAGE电泳检测,有两条条带,其中分子量为28kDa左右较深条带为纳豆激酶。

最终纳豆激酶回收率可达94.96%,纯化倍数3.81。

（4）将上述分离纯化的纳豆激酶进行稳定性的测定,确定纳豆激酶的反应温度在40℃条件下较好,纳豆激酶在高温和常温条件下储存容易失活,在-22℃⁴℃条件下保存较好;纳豆激酶的最适反应pH值为6.0,且在pH为6.0⁷.0的条件下活性较为稳定;金属离子Ca²⁺对纳豆激酶的活性有一定的促进作用,而Mg²⁺对酶的活性无明显的作用,Zn²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺对纳豆激酶存在或多或少的抑制作用。

纳豆激酶分离纯化工艺与缓释片剂的研究的开题报告标题：纳豆激酶分离纯化工艺与缓释片剂的研究背景：纳豆激酶是一种来源于日本传统食品纳豆（发酵大豆）的特殊蛋白质，具有多种生物学功能，如抗菌、抗氧化、消炎、降压等。

因此，其在医药和食品工业中得到了广泛的应用和研究。

纳豆激酶能够水解纤维蛋白原、胶原蛋白等蛋白质，可用于治疗血栓、血管阻塞、溃疡、动脉硬化等疾病。

目前，纳豆激酶的分离纯化和制备工艺还存在一定的难度，为了更好地发挥其生物学功能，需要进一步探索高效的分离纯化工艺。

同时，纳豆激酶的药物制剂和食品制品中使用需要考虑其制剂的稳定性和溶出度等，为此，需要研究自控释、缓释等技术，提高其处方的长效稳定性和药效。

研究内容：本研究将通过以下几个方面开展：1. 纳豆激酶的分离纯化工艺研究。

采用离子交换柱、凝胶过滤柱等层析技术和超滤、凝胶电泳等分离技术，尽可能地提高分离纯化效率和纯度，寻找高效且经济的纳豆激酶分离纯化工艺。

2. 纳豆激酶的表征与活性测定。

通过SDS-PAGE、Western blot、尺寸排除色谱和动力学测定等手段对分离纯化后的纳豆激酶进行表征与活性测定，以确定其纯度和活性，并优化分离纯化工艺。

3. 纳豆激酶缓释片剂的制备与评价。

采用聚乙二醇、羟基丙基甲基纤维素等多种缓释控释剂，对纳豆激酶制备不同控释性质的片剂，并研究其在模拟生理条件下的缓释效果和稳定性。

预期成果：1. 建立高效、经济的纳豆激酶分离纯化工艺流程，获得高纯度的纳豆激酶。

2. 确定纳豆激酶的活性与特征，为进一步研究应用提供基础数据。

3. 制备纳豆激酶缓释片剂，并评价其缓释性质和稳定性。

意义：纳豆激酶在医药和食品行业中具有广泛的应用前景，但其在分离纯化和制备缓释剂方面还存在一定的挑战。

本研究将对纳豆激酶的分离纯化、活性特征、缓释控释片剂制备、缓释控释效果等问题进行探索。

通过本研究，可以为纳豆激酶相关产品的开发和应用提供技术支持。

新型溶栓剂纳豆激酶的研究进展【摘要】纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶，与传统的一些溶栓剂相比，其具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血、纤溶活性强、作用时间长等优点。

有望被开发为新一代的口服抗血栓药物。

本文就纳豆激酶的结构、理化性质、活性测定方法，作用机制以及开发现状和应用前景等方面进行了综述。

【关键词】血栓；纳豆激酶；活性测定；溶栓功能【Abstract】 Nattokinase is a kind of serine proteinase that has strong fibrinolytic activity produced by Bacillus subtilis （natto）．As compared with some traditional thrombolytics，nattokinase possesses the advantages of safety，low cost，and effective by oral administration etc．Some advances in nattokinase research were reviewed in this paper，mainly its structure,physicochemical properties, biological function of dissolving fibrin, activity assay method and its prospect.【Key words】 thrombosis；nattokinase；activity assay；dissolve fibrin血栓疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，包括心血栓、脑血栓、肺栓塞和末梢动静脉血栓等常见疾病。

据估计，全世界有血栓性疾病患者约1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人。

产纳豆激酶细菌的筛选及酶学性质的研究的开题报告一、课题背景和研究意义：纳豆是一种日本传统食品，由大豆经过发酵制作而成。

在纳豆中存在着一种特殊的酶——产纳豆激酶（nattokinase）。

这种酶能够加速凝血物的溶解，具有预防心血管疾病、降低血脂、防止血栓形成等功效，因此备受关注。

为了开发纳豆中产纳豆激酶的产生技术，有必要对产纳豆激酶的酶学性质进行研究，并开展该酶生产菌株的筛选。

二、研究目的和内容：本研究旨在通过筛选纳豆中的产纳豆激酶生产菌株，并进一步研究其酶学性质，为产纳豆激酶的工业化生产提供理论基础。

1. 筛选合适的产纳豆激酶生产菌株。

首先，收集纳豆中的微生物样品，并通过筛选法得到具有产纳豆激酶能力的菌株；其次，对菌株进行鉴定和优化培养条件，提高产酶效率。

2. 测定酶学性质。

对产纳豆激酶的纯化步骤进行优化，得到较纯的产纳豆激酶，并测定其酶学性质，如最适温度、最适pH、稳定性以及酶动力学参数等。

三、研究方法：1. 细菌的样品收集与筛选收集纳豆中的不同微生物菌株，采用平板筛选法筛选出能够产生产纳豆激酶的微生物菌株。

2. 细菌的鉴定和培养条件的优化针对筛选出的菌株进行鉴定，并优化其培养条件和发酵条件，提高产酶效率。

3. 酶的纯化及酶学性质分析对产纳豆激酶的纯化过程进行优化，得到较纯的酶制备。

然后对纯化得到的酶进行酶学性质的测定，如酶的最适温度、最适pH、稳定性以及酶动力学参数等。

四、预期结果：通过本研究，将获得产纳豆激酶的优良制备菌株，并进一步研究其酶学性质，为产纳豆激酶的工业化生产提供技术支持，推动该生物活性物质在保健食品和药品领域的应用。

纳豆激酶的提取、提纯程序及活性测定孙雪天津工业生物技术研究所2013E8018261011由于我们实验室较少做酶的分离提纯，所以我选择了自己比较感兴趣的一种酶——纳豆激酶。

选择此酶的理由：人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心脑血管疾病，对中老年人的身体健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者约1 500 万人，潜在的溶栓剂市场有20 亿美元[1]。

但当前的溶栓剂，如尿激酶( SK) 和链激酶(UK) ，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂，存在着价格高的缺点等，难以成为适用于大众的药品。

而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点[2] ，市场前景极为诱人。

［3］纳豆激酶(Nattokinase , N K; 也称Subtilisin NAT ,Subtilisin BSP) 是由纳豆菌( Bacill us subtilis var. nat to) 产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶( Subtilisin)，属于水解酶类，催化蛋白质的水解。

现在可以由分离纯化的纳豆激酶DNA 序列推出其氨基酸序列,根据该顺序计算出该酶的分子量为27 728 u[4 ]，远小于尿激酶的分子量54 000 u。

用Svunsson柱型电泳法等电聚焦测得纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其p I 值为8. 6 ±0. 3。

[5 ]提取提纯程序：纳豆激酶是胞外酶［6］，故可利用纳豆菌的发酵液提取，省去了细胞破碎和缓冲液抽提的步骤。

具体方法如下［7］：（1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4 000 rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。

（2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。

取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。

[3]Giuseppe Toscano, Domenico Pirozzi, Michele Maremonti,et al. Kinetics of enzyme deactivation: a case study[J]. Ca-talysis Today, 1994, 22: 489-510.[4]Ludikhuyze L, De Cordt S, Weemaes C, et al. Kinetics forheat and pressure-temperature inactivation of Bacillus subtilis amylase[J]. Food Biotechnology, 1996, 10(2): 105-129. [5]Lenonard S J, Merson R L, et al. Estimating thermal degrada-tion in processing of foods[J]. J Agric Food Chem, 1986, 34(3): 392-396.[6]孙梅君. 番茄中果胶酯酶耐热性的研究[J]. 食品与发酵工业, 1992, (5): 13-20.[7]汪李严. 耐高温α-淀粉酶及其在食品工业的应用[J]. 食品科学, 1991, (12): 27-29.[8]Ashim K Datta. Error Estimates for approximate kineticparameters used in food literature[J]. Journal of Food Engineering, 1993, 18: 181-199.[9]芝畸勋[日]. 新编食品杀菌工艺学[M]. 许有成, 译. 北京:农业出版社, 1990.[10]杨宗政. 耐温淀粉酶溶液蒸发浓缩过程中的质量评估[D].天津轻工业学院学位论文, 2000.[11]天津轻工业学院, 无锡轻工业学院. 食品工艺学(上册)[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1984.纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究王萍1,2，陈钧1，杨小明1，鲍艳霞1(1.江苏大学生环学院制药工程系，江苏镇江 212013；2.江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045)摘 要：经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤，从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶，纯化倍数15.6，回收率10.2%，SDS-PAGE电泳显示为二个组分，分子量在29000左右。

《生物工程下游技术》综合实验——纳豆激酶的分离纯化摘要从纳豆发酵液中提取纳豆激酶，采用30~70%饱和度的硫酸铵盐析，Sephadex G-75凝胶过滤层析对活性组分进行分离提纯。

然后检测各个步骤的样品的蛋白质含量，绘制凝胶层析图，得出峰值，最后对整个纯化方案进行评价。

结果表明，本次实验纯化回收率较低。

凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、试验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，被广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化。

凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的，透明质酸(hyaluronicacid，简称HA)，是一种国际上公认的生物大分子保湿剂，分子量达几十万到几百万，而蛋白质的分子量仅为几万，所以选择合适的凝胶可以起到分离纯化的效果。

关键词：纳豆激酶硫酸铵盐析凝胶层析目录1 前言 (4)2 材料和仪器 (4)2.1 仪器 (4)2.2 材料 (4)2.3 试剂及溶液配制 (4)3 实验方法 (5)3.1 纳豆的制作 (5)3.2 纳豆激酶的粗提 (5)3.2.1 浸提 (5)3.2.2 硫酸铵盐析 (5)3.3 Sephadex G-75凝胶层析进行纯化 (6)3.4 蛋白质含量的测定 (7)4 结果与分析 (7)4.1 蛋白质含量测定结果 (7)4.2 层析收集液测定结果 (7)4.2.2 绘制纳豆激酶的层析图 (8)4.2.3 纯化方案进行评价 (9)5 讨论 (9)5.1方法分析 (9)5.2 问题及其猜想 (10)参考文献 (12)1 前言心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其死亡率已超过了癌症。

而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用于治疗血栓的药物,如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等,但是它们大多为注射用药,使用不便,且副作用大、半衰期短,很难满足血栓治疗的需要。