纳豆激酶的提取研究

纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究董志奎,杨　超,尹宗宁,李　萌(四川大学华西药学院,四川成都610041) 摘　要:目的研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质。

方法纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )分离纯化,采用T AME 法测定酶的活性,通过S DS 2PAGE 对纯化结果进行了检验。

结果S DS 2PAGE 中显示单一色带,相对分子质量28000,以T AME 为底物时纳豆激酶的米氏常数(K m )为35.47mm ol/L ,最适宜的温度37℃,最适宜pH 为8.6。

结论该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶。

关键词:纳豆激酶;分离纯化;酶学性质;米氏常数(K m ) 中图分类号:Q55;T Q464.8 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0520298204Study on puri fication and enzyme kinetics of nattokinaseDONG Zhi 2kui ,Y ANG Chao ,YI N Z ong 2ning ,LI Meng(West China School o f Pharmacy ,Sichuan Univer sity ,Chengdu 610041,China ) Abstract :Purpose T o study the techniques of the separation and purification of the nattokinase and itscharacterization.Methods The natuokinase extract was purified by gel 2chromatography (Superdex75)and poly 2acrylamide gel electrophoresis (PAGE ).The purified nattokinase was tested by S DS 2PAGE ,and the T AME method was used to determine the activity of the enzyme.R esults There was only one strip in the S DS 2PAGE atlas ,and the m olecular weight of nattokinase was 28kDa.The Michaelis constant (K m )of nattokinase was 35.47mm ol/L when T AME was the substrate ,and the best reaction tem perature was 37℃and the best reac 2tion pH was 8.0.Conclusion Purified nattokinase can be obtained by the the techniques of the separation and purification.K ey w ords :nattokinase ;separation and purification ;characterization ;michaelis constant (K m )收稿日期:2009203225基金项目:国家自然科学基金项目(30371696)作者简介:董志奎(19842),男,药剂专业在读硕士研究生;尹宗宁(19642),女,通信作者,副教授,T el :028*********,E 2mail :yzn @scu. 。

纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。

1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。

研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。

进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。

为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。

1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。

纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。

血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。

主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。

纳豆激酶药用研究与开发可行性研究报告可行性计划栓塞性疾病严重地危害着人类的生命健康,尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中、老年人健康最严重而又常见的疾病之一。

血栓症日渐成为死亡率占首位的病症。

溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段。

因此,对溶栓药物的研究已被广为重视。

链激酶(SK) 、尿激酶(UK) 作为第一代溶栓药物在临床上广为应用,但它们均对纤维蛋白无特异性选择作用,容易引起全身性纤溶激活并伴有出血倾向、半衰期短等缺点。

同时SK还具有抗原性并有过敏性反应。

而作为第二代纤溶药物的tPA 尽管对纤维蛋白有很高的选择性,但临床上为了取得较好的溶栓效果而应用大剂量(100mg) 从而部分失去了对纤维蛋白的选择性。

因此依旧会导致出血等副作用。

此外临床上试用的第二代新药还有茴香酰纤溶酶原-链激酶复合物、重组单链尿激酶和葡激酶。

但茴香酰纤溶酶原-链激酶复合物对纤维蛋白的选择性并未能证实;重组单链尿激酶溶栓效果慢且易造成出血;葡激酶虽然具有较强的纤维蛋白选择性,但由于其为细菌成分,因此也具有抗原性。

尽管这些溶栓药物的纤溶作用优于第一代溶栓药,但它们依然具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。

鉴于此,开发新型溶栓药物已成为重要的研究课题之一。

目前,纳豆激酶(NK) 作为来自于食品,高效安全并可直接由消化道吸收,起到溶解纤维蛋白作用的纤溶1酶,正在成为当今溶栓药研究的焦点。

1、药理实验研究结果表明:将纳豆和纳豆的提取物置于人工制作的纤维蛋白平板上有明显的溶圈,显示出明显的溶纤作用，精制品的单位酶活约为5280u/mg。

在食用纳豆的人的血浆中观察到纤维蛋白溶解活性, 并在食用2,8h后活性逐渐提高。

在NK 服用者的血中观察优球蛋白溶解时间(ELT)、优球蛋白的纤溶活性( EFA) 以及纤维蛋白降解产物(FOP) 的变化发现,ELT大大降低,而EFA提高,且在口服后第4d 达到最高,并可维持到第8d;同时FOP 在口服后第一天即迅速达到最高值。

纳豆激酶的生产提取工艺纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。

具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。

一、发酵液生产1、菌种活化无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

2、种子液的制备种子培养基成分无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。

3、发酵培养无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。

二、预处理和固液分离采用离心的方法。

将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。

收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。

三、提取1、分级盐析法使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。

将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。

再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。

纳豆激酶液态发酵提取工艺及酶性质的研究纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌亚种纳豆菌发酵产生的一种酶,该酶安全无毒且成本低廉和能口服吸收,具有不易引起出血、无抗原性、半衰期长等优点,是一种良好的溶血栓的保健食品。

本试验为开发新一代的纳豆激酶胶囊,做了如下探讨:（1）本文从山东临沂豆豉和纳豆菌粉中分离得到数株产蛋白酶能力菌株,通过液态发酵测定蛋白酶活力,筛选出一株高产蛋白酶的菌株并命名为BN。

对BN进行菌落特征、细胞形态、生理生化试验以及16s rDNA分子生物学鉴定,确定该菌株为纳豆芽孢杆菌。

（2）将上述分离纯化的菌株BN进行发酵产酶条件的优化,通过测定种子液中的OD660nm确定其最适种龄为15²0h。

利用单因素试验优化的发酵碳源和氮源分别为:可溶性淀粉和酵母膏;采用正交试验确定的无机盐最佳的添加量为K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.1%和CaCl2 0.05%;利用响应面设计法分析优化的发酵条件为接种量3%,温度40℃,pH7.0,发酵时间84h;在优化条件下产生的纳豆激酶活力达到749.41U/mL。

（3）试验采用冷冻离心除菌体、分级盐析和透析除盐粗分离纯化纳豆激酶,将分离纯化的酶液经SDS-PAGE电泳检测,有两条条带,其中分子量为28kDa左右较深条带为纳豆激酶。

最终纳豆激酶回收率可达94.96%,纯化倍数3.81。

（4）将上述分离纯化的纳豆激酶进行稳定性的测定,确定纳豆激酶的反应温度在40℃条件下较好,纳豆激酶在高温和常温条件下储存容易失活,在-22℃⁴℃条件下保存较好;纳豆激酶的最适反应pH值为6.0,且在pH为6.0⁷.0的条件下活性较为稳定;金属离子Ca²⁺对纳豆激酶的活性有一定的促进作用,而Mg²⁺对酶的活性无明显的作用,Zn²⁺、Cu²⁺和Fe²⁺对纳豆激酶存在或多或少的抑制作用。