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westernblot法检测⼤⿏肝组织⾎清蛋⽩的表达变化Western-blot⼀、实验⽬的1、⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析2、⽬的蛋⽩与其他蛋⽩的相互作⽤⼆、实验原理在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测的⼀项技术。
与Southern Blot或Northern Blot杂交⽅法类似，但Western Blot法采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
Western Blot显⾊的⽅法主要有以下⼏种：i. 放射⾃显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈⾊现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊，体同⽔平和实验条件的是⽤第⼀种⽅法，发表⽂章通常是⽤底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就⾏，操作也⽐较简单，原理如下（⼆抗⽤HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁⽶诺，如遇到HRP，即发光，可使胶⽚曝光，就可洗出条带。
三、实验器材及试剂1、器材：（1）可调移液器P1000、P200和P20，经消毒的相应的盒装吸头（2）经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及⽔浴锅⽤试管架（3）定时器，记号笔，⼀次性⼝罩和筒纸（4）于冷室中预冷的1.4万转台式离⼼机（5）PH试纸（6）分光光度仪，⽯英⽐⾊杯（7）烧杯，量筒，棕⾊试剂瓶（8）0.45um滤纸2、主要试剂(1)⼀抗：⼩⿏抗⼤⿏多克隆抗体（清蛋⽩，分⼦量66kD）(2)⼆抗：⽺抗⼩⿏IgG-HRP(3)定蛋⽩试剂盒：南京建成⽣物⼯程研究所。
生出盍堂鲤±兰焦监塞墨Ｑ￡墨＝！塑墨Ｑ￡耋墨在壁童疰焦意鼠赶：膣生蠢选的翌ｆ豇附图图１ＲＴ－ＰＣＲ图１．１提取的ＲＮＡ电泳图以下图中：Ｎ代表正常组（ｎｏｒｍａｌ），Ｍ代表Ｍａｒｋｅｒ，Ｓ代表假手术组（ｓｈａｍ），２、６、１２、２４、４８依次代表手术后２、６、１２、２４、４８小时。
图１．２１３一ａｃｔｉｎ电泳图图１‘３脓毒症时ｓｏｃｓ３在肝脏中的表达生出太堂硇±堂焦监塞墨Ｑ￡量：！塑曼Ｑ￡墨：３在丝壹蕉住克鼠旺！眭生盘选的殛宣图１．４脓毒症时ＳＯＣＳ３在脾脏中的表达图１．５脓毒症时ＳＯＣＳＩ在肝脏中的表达图１．６脓毒症时ＳＯＣＳｌ在脾脏中的表达虫出厶堂亟：￡堂笪迨塞ＳＱ￡墨：！塑ＳＱ￡曼：３垂：壁垄蕉体直基旺！盟主盘鲨丝型直图２免疫印迹脓毒症时ＳＯＣＳ在肝脏和脾脏中的蛋白表达图３病理切片幽３１正常肝组织ＨＥ染色（５０倍）幽３．２术后２４小时肝组织ＨＥ染色（５０倍）幽３．３正常肝组织ＨＥ染色（４００倍）幽３．４术后２４小时盯组织ＨＥ染也（４００倍）生出占堂亟二Ｅ堂鱼迨塞墨Ｑ￡墨：！塑墨Ｑ￡曼：！查壁耋蕉篮直鼠赶：蝗主塞垫盟班巍图３．５正常脾纰织ＨＥ染色（５０倍）图３．６术后２４小时脾组织ＨＥ染色（５０倍）幽３７正常脾组织ＨＥ染色（４００倍）幽３．８ＣＬＰ术后２４小时脾组织ＨＥ染色（４００倍）图４免疫组化图４１『Ｆ常肝组织ＳＯＣＳＩ免疫组化（４００倍）幽４．２术后２４小时肝组织ＳＯＣＳＩ免疫组化（４００倍）幽４．３正常肝组织ＳＯＣＳ３免疫组化（４００倍）图４．４术后２４小时片ｆ组织ＳＯＣＳ３免疫组化（４００倍）·ｊ！出盘堂堕±堂笪迨塞苎Ｑ￡曼：！型曼Ｑ￡Ｓ：３查壁生壁签直鼠８［！鲤。
！！盔鲨盐型童图５相关分析的线性拟合图图５．１肝脏ｒｐＳＯＣＳ３ｍＲＮＡ（ＷＧ３Ｎ）同蚩白表达（ＳＧ３）（ｙ＝０４８３＋４Ｉ５２×１０’３ｘ．ｒ＝０３５３．Ｆ５７０６，Ｐ＜０．０５）图５．３月｜ｍｔ”ＳＯＣＳｌｍＲＮＡ（ＷＧｌ）同蚩白袭选（ＳＧｌ）（卿．１１０＋５．７６５×１０‘ｘ，ｒ＝０８３７，Ｆ９３．３０９，Ｐ＜０．０１）倒５５脾脏。
actions of BMP signaling[J].Development,2003,130(25):6209.[11]Morgan EA,Nguyen SB,Scott V,et al.Loss of Bmp7and Fgf8signaling in Hoxa13-mutant mice causes hy‐pospadia[J].Development,2003,130(14):3095-3109.[12]Maiuri MC,Le Toumelin G,Criollo A,et al.Func‐tional and physical interaction between Bcl-XL anda BH3-like domain in Beclin-1[J].EMBO(EuropeanMolecular Biology Organization)Journal,2007,26(10):2527-2539.犀角地黄汤对脓毒症大鼠脾组织NF-κB信号通路相关基因表达的影响陈怀宇1，郑则敏2，唐雪华1，林名瑞1，何绍吾1，李玮1（1.福建中医药大学附属人民医院ICU，福建福州350004；2.福建中医药大学附属人民医院中医外科，福建福州350004）摘要：目的探讨犀角地黄汤对脓毒症大鼠脾脏组织NF-κB信号通路相关基因表达的影响。
方法将45只健康雄性Wistar大鼠随机为为对照组、脓毒症组、犀角地黄汤干预组，各15只。
脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建模。
犀角地黄汤干预组大鼠除了CLP外，术前2天开始中药胃饲，每天上、下午各给药1次，术后连续胃饲2d。
对照组仅行开腹、关腹，但不予盲肠结扎穿孔。
3组术毕均肌肉注射平衡液5mL/kg。
术后48h取脾组织提取RNA后采用RNA-seq进行基因检测，应用生物信息学方法分析脓毒症大鼠犀角地黄汤干预后NF-κB信号通路相关基因的表达变化。
结果脓毒症组及犀角地黄汤干预组，脾组织NF-κB信号通路相关基因出现同时表达上调的有2个，同时下调有18个，脓毒症组上调而犀角地黄汤干预组正常表达的有3个，仅脓毒症组下调而犀角地黄汤干预组正常表达的有5个，脓毒症组正常表达而犀角地黄汤干预组表达上调有4个（IL-1β、TNFα、MIP-1β、ICAM）。
Nrf2在脓毒症急性肝损伤（ALI）中的作用机制研究谌韦洪【摘要】Objective To investigate and analysis of Nrf2 (nuclear factor ALI (factor) on acute liver injury in sepsis sepsis) in the mechanism of action, and provide guidance to prevention and treatment for sepsis. Methods 40 cases of acute liver damage in pa-tients with sepsis from 2010 Septemberto 2013 September in our hospital as the research object, by randomly divided into control group and observation group with 20 cases in each group, at different postoperative time points were collected serum samples col-lected at the same time, separation of serum, pathological tissue of patients, determination the expression level of Nrf2. Results The observation group ALT level in the sera of patients with increasing amplitude was low, to improve the situation is relatively ob-vious, the patients in observation group were reduced, serum levels of ALT after 2D treatment to (162.44±6.52) IU/L, significantly lower than the control group (262.43±6.96) IU/L, P<0.05. The observation group p atients in different period of pathological tissue levels of Nrf2 expression compared with the control group, 2D was (0.31 ±0.02) uL, increased significantly, P<0.05. Conclusion Nrf2 is the key of oxidative stress in acute liver injury in sepsis, which can be used as an important index to judge the prevention and treatment of sepsis.%目的：探讨与分析Nrf2（核因子相关因子）在ALI（脓毒症急性肝损伤）中的作用机制，旨在为脓毒症的防治提供指导依据。
脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究摘要】目的应用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠肝脏组织细胞基因表达谱的变化。
方法健康Wistar 大鼠40 只，随机分为模型组和假手术组，每组各20 只。
通过盲肠结扎穿孔术（CLP）制备大鼠脓毒症模型，应用含有22523 个大鼠基因cDNA 克隆的表达谱基因芯片进行检测，筛选差异表达基因，用计算机软件分析脓毒症大鼠肝脏组织术后24 小时的基因表达变化。
结果与假手术组比较，共筛选出差异表达基因共285 条，占基因芯片总点数的1.26%，其中已知基因180 条，93 条基因表达上调，87 条基因表达下调。
涉及到一系列与细胞生长调节相关基因，物质能量代谢相关基因，信号转导、炎症、应激反应相关基因，转录调控及蛋白质翻译、修饰、加工、降解相关基因等相关的基因异常表达。
结论脓毒症导致的多脏器功能不全（MODS）是多种基因作用的结果，采用基因芯片技术全面揭示脓毒症肝脏基因表达的模式，有利于发现新的研究目标和治疗途径。
【关键词】脓毒症肝基因表达基因芯片【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）08-0053-03脓毒症(Sepsis) 及其所导致的多脏器功能不全（MODS），在临床上发病率高，病死率高，临床救治棘手，源于其发病机制非常复杂。
目前多数认为是过度的炎症反应与代偿性抗炎反应失衡，出现免疫系统功能紊乱的病理生理过程，并与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关，涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织损害等一系列基本问题[1]。
国内外已有学者运用基因芯片技术对经C L P 或腹腔注射脂多糖制备小鼠脓毒症模型的多个脏器组织的基因差异表达分别进行研究，其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变，但并未对脓毒症机制和治疗的研究提出新的看法。
本实验再次运用基因芯片技术研究分析脓毒症时肝脏相对应的基因表达谱变化，旨在进一步探讨脓毒症的研究治疗新途径。
1 材料和方法1.1 实验动物及模型制备雄性健康Wi s t a r 大鼠40 只，体重180 － 220g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。
实验前在清洁级环境下饲养2 周，常规饲料喂食、正常饮水。
按随机数字表法分组：假手术组（n ＝ 20 只）、模型组（n ＝ 20 只）。
模型组：采用盲肠结扎穿孔术（CLP）方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。
实验前大鼠禁食过夜，自由饮水，称体重后以氯胺酮（100mg/ kg）腹腔麻醉固定，消毒铺巾，沿中下腹正中线切开2cm 开腹提出盲肠，7 号丝线距盲肠根部1c m 处血管弓内结扎盲肠；用9 号无菌针头刺穿盲肠3次，使肠内容物流出，避免伤及肠系膜血管，然后将盲肠放回腹腔，缝合腹部切口。
假手术组：不结扎和穿刺盲肠外，其余操作同CLP组。
两组术毕皮下注射平衡液5ml/kg以补充术中丢失的体液并抗休克治疗，术后正常饮食、自由饮水。
1.2 肝组织的留取和处理两组大鼠（n＝40只）24h断颈活杀迅速开腹摘取肝脏，置入液氮罐中骤冷保存，温度－70℃，备用。
1.3 基因芯片杂交及检测分析用一步法总RNA提取试剂（Trizol）抽提液氮中肝组织总RNA。
反转录并标记探针，与RatRef-12大鼠表达谱基因芯片(由联合基因技术有限公司制作，每个芯片含有22523个大鼠基因cDNA克隆)杂交过夜，洗片、晾干后扫描，采用ScanArrav 4000型激光共聚焦扫描仪以两种不同波长扫描芯片，应用Gene Pix Pro 3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，以两次芯片两种荧光信号强度结果比值（Ratio值）均>2.0或均<0.5的基因为差异表达基因，前者示模型组的基因表达显著上调，后者示模型组的基因表达显著下调 [2]。
通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库查询基因功能并加以分类。
2 结果肝脏基因表达谱差异分析：在模型组中共筛选出差异表达基因共285条，占基因芯片总点数的1.26%，其中已知基因180条，93条基因表达上调，87条基因表达下调；未知基因105条，58条基因表达上调，47条基因表达下调。
2．2．1脓毒症组肝脏组织出现表达上调的部分已知差异基因(见表1)：表1脓毒症组肝组织出现表达上调的部分已知差异基因2.2 脓毒症组肝脏组织出现表达下调的部分已知差异基因（见表2）：表 2 脓毒症组肝脏组织出现表达下调的部分已知差异基因3.讨论肝脏是营养物质、炎症介质、激素及内毒素的主要代谢器官。
在脓毒血症的发生发展中，肝功能障碍往往在肺、肾功能衰竭发生后出现，可以加速肺脏和肾脏等器官的损伤和功能障碍，从而影响整个机体的新陈代谢，增加脓毒症的救治难度和病死率。
Roule和Kettlewell发现，脓毒症患者肝功能异常表现为：白蛋白和胆固醇的降低，以及碱性磷酸酶和血清谷草转氨酶的升高 [3]。
死于脓毒血症的患者，其肝脏组织学改变为：肝小叶中带和外带坏死，有急性炎症反应和胆汁淤积。
肝细胞坏死似乎成了脓毒血症的特征之一。
本实验对 CLP脓毒症模型大鼠晚期(24小时)肝脏组织中的差异表达基因按其所编码的蛋白质功能予以聚类分析，初步显示了脓毒症是肝脏组织中部分基因表达的特征性改变：①各种基本营养物质代谢及生物转化酶类相关基因表达明显异常： a. Pdp2 (调节糖有氧氧化代谢的关键酶)、UgP2（调节糖原合成的催化酶）等基因的表达量发生了下调；Sds、Got1（糖异生途径中的丙酮酸转运）等基因表达上调，说明机体处于糖异生旺盛状态，葡萄糖有氧氧化途径受限，糖氧化功能减少，无氧酵解供能使机体能量代谢处于衰竭状态。
b. Bhmt（蛋氨酸循环代谢）、Oat（鸟氨酸代谢）、Hspa14(热休克蛋白)、MVd（胆固醇合成限速酶）、Plala（甘油磷脂降解途径）、Fabp2（肠道脂肪酸转运）、Lpl（脂肪分解代谢）等基因表达均上调；Acbd6、Slc22a5（脂酸氧化关键酶和转运载体）、Fabp7、Hacl1（脂肪酸合成代谢酶）等基因表达均下调，提示：机体处于蛋白质代谢旺盛状态，急性期蛋白合成增加。
脂肪动员状态，脂肪分解增加，脂肪的氧化供能尚未受到充分抑制。
c . E p h x1、U g t 家族、A ld h l a1、G l y a t、G s t m3、A k r7a3、CyP450 家族等基因，以及Gclc、Gclm（谷胱甘肽生物合成）等基因均表达下调，提示肝脏的氧化还原及生物转化功能严重受损，药物、毒物及内源性物质（如激素、神经递质、胺类）等非营养性物质的代谢障碍。
本实验以上基因表达情况，说明全身炎症反应使机体处于一种严重的物质能量代谢紊乱状态，物质合成及生物转化的抑制和高分解代谢是其主要特点，这种高代谢的净效应将导致机体细胞群进行性丢失，并最终导致MODS。
肝细胞根据其结构和功能的异质性分为三个带。
其中，Ⅲ带（小叶中心带）是接近中央静脉的肝细胞，其营养条件最差，主要负责糖原生成、糖酵解、脂类生成、氨解毒、生物转化作用等。
该实验中，与这些功能相关的基因表达均明显下调，提示肝小叶中心带肝细胞的生理功能严重受损，这与病理标本的光镜下表现一致。
脓毒症肝损害的机理目前尚不完全清楚，可能的机理有：1、脓毒症时高排低阻的循环特点使肝脏供血减少，局部的高代谢，导致氧债增加，肝小叶中央或局部出现缺血[4、5]；2. 细胞因子或介质介导及氧化剂可能是导致肝损害的另一原因。
3、肝脏不仅因原发病因素受损，而且受损的肝脏本身可能参与维持这种损害的存在，如肝Kupffer 细胞所释放的细胞因子可能发挥这种作用[6]。
对于目前的认识，进行快速充分的复苏，保持内脏高血流量仍是预防肝细胞缺血坏死的最好办法，进一步研究肝小叶中心带细胞坏死的机制，可能为脓毒症的治疗提供新的靶点。
② 调控转录相关的基因有12 个表达上调，6 个表达下调；信号转导相关基因有13 个上调，11 个下调。
显示脓毒症时肝细胞的D N A 转录与信号转导处于紊乱状态。
其中，类固醇激素受体相关基因N r1i3 表达下调，可能与脓毒症时核因子-κB(NF-κB) 的过度表达有关，可导致脓毒症时的类固醇激素抵抗。
S O C S 家族蛋白是一类可被多种细胞因子诱导产生，反过来又能以负反馈方式对信号转导途径进行抑制调节的蛋白分子。
虽然SOCS 蛋白被首先证明是JAK-STAT 路径的抑制剂，但其家族中也有参与提升信号蛋白退化的细胞信号，并且与其他许多信号转导因子都有联系。
在脓毒症的免疫反应中，S O C S 蛋白在T 细胞分化为T 辅助细胞分型时有着重要的作用[7]，它还可通过调节B C L -2 家族成员来调节细胞凋亡[8]。
因此，Socs2 表达下调可导致炎症因子的量产生与释放，进一步促进了脓毒症的发展。
③ 与炎症反应相关的基因中，有7 个促炎症相关基因表达上调，如： Fabp4、Cxcl1、Cxcl9、A2m、Dusp1、Il18bp、Nfil3，2 个表达下调, 如： Kikb1、Sectmla；抗炎症相关基因表达上调5 个，如：S100a8、Btg2、Danjb4、Sgk、Procr，2 个表达下调，如：Hspb1、Il15。
表明脓毒症时机体同时存在炎症反应和抗炎反应。
临床中有一部分脓毒症患者致炎因素强于抗炎因素，表现为全身炎症反应综合征(SIRS)；也有相当一部分患者抗炎因素强于致炎因素，表现为代偿性抗炎反应综合征（C A R S）和免疫抑制[9]，但实际上在I C U 中更常见的是另一种不协调的促炎症反应和抗炎症反应同时存在的混合拮抗反应状态（MA R S）[10]。
脓毒症是由致炎、抗炎细胞因子和细胞因子拮抗物间复杂的相互作用而发生发展的。
就目前认识的水平来看，促炎症反应和抗炎症反应因素在数量和时间上的关系将决定脓毒症患者的免疫状态，任何一方的过度反应都对患者造成不良影响，特别由于MA R S 的存在，使获得一种适当的协调关系成为艰难的治疗挑战，故而任何试图去封闭、抑制或中和炎症及其调节过程的单一因素，势必矫枉过正导致新的炎症紊乱，如果能更好的了解促炎反应和抗炎反应之间的协调或失调的关系，可能寻找到脓毒症合并MODS 的有效治疗方法。
④ 该实验中发现细胞凋亡相关基因上调5 个包括：D d i t4、Ho mx1、Lcn2、Sgk、Tnfrsf12a，下调5 个包括：Aldhla1、Dnase1l3、O s g i n l、R n d3、T n f s f10；抗凋亡相关基因上调7 个包括：I g f b p1、Ntf3、Pref1、Timp1、Tspan31、S100a8、Myc，下调4 个包括：Hs pb1、Il15、Prlr、Socs2。
表明脓毒症时肝脏细胞的生长调控处于紊乱状态。
