肺吸虫和血吸虫总RNA的提取及电泳分析

实验二总RNA的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法；2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法；3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱；实验原理（一）概述1. 10-5µg RNA/细胞含有rRNA 80-85%：28S 18S 5StRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%2. mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

3.RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

4.目前常用的是Trizol法。

（二）Trizol的主要成分1.Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。

2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。

4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。

(三)总RNA的纯度检测原理：不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。

RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。

因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/mL 的单链RNA。

用PH=7.6 的TE（tris HCl缓冲液）稀释RNA样品n倍并以TE为空白对照，根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000实验步骤（一）样品处理与Trizol用量1.提取组织RNA时，每50～100mg组织（即0.5×0.5×0.5cm,约合0.1cm3）用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；2.悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106个细胞加1mL Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。

总RNA 的提取、电泳检测及浓度和纯度的测定撰写人：黄晶一、实验原理1、总RNA的提取见分子克隆（第三版）上册P522 “用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质”2、RNA的电泳见分子克隆（第三版）上册P540 “按大小分离RNA: 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳”3、RNA的浓度及纯度测定见分子克隆（第三版）下册P1695 “DNA或RNA的分光光度法测定”二、实验准备1、配制0.1%的DEPC水，37℃培养箱内放置过夜，之后灭菌两次。

2、准备大、中、小进口枪头各一盒，1.5ml进口离心管、0.2ml 进口PCR管各一瓶，灭菌两次（公用）3、准备研钵（n）、勺子（n+1）、50ml、100ml量筒各一个，180℃烤4小时以上（n=提取RNA的个数）4、10×MOPS缓冲液、甲醛、30％双氧水、胶布、氯仿（sigma）、异丙醇（sigma）、75％乙醇（以上试剂及物品公用，实验前请确定其是否齐备）三、实验步骤（一）总RNA的提取1．液氮研磨组织，取100mg组织，加入1ml Trizol，室温放置5min2．加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min，之后4℃，12000g,离心15min 3．上清移入新管，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置3min, 之后4℃，12000g,离心15min4．上清移入新管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min,之后4℃，12000g,离心15min5．弃上清，加入1ml 75%乙醇，振荡，4℃，7500g,离心5min6．弃上清，室温晾干，之后加入40ul DEPC水溶解（RNA不要完全干燥，否则不利于溶解）（二）RNA的电泳1．用3％-30％的双氧水浸泡RNA专用的电泳槽及胶板、梳子10分钟以上2．之后用0.1%的DEPC水洗涤3．配制1.2%的含有甲醛的琼脂糖凝胶1）称取0.36g RNA专用的琼脂糖，加入24ml DEPC水，熔化后冷却到60℃2）加入3ml 10×MOPS，混匀后再加入3ml甲醛，之后再加入3ul EB4．用DEPC水配制1×MOPS 100ml作为电泳缓冲液，55V 预电泳30-40min5. RNA电泳样品的制备1）将6ul RNA样品、1ul 10×MOPS、1ul甲醛、2ul RNA上样缓冲液混匀2）65℃加热10min,之后冰浴2min,短暂离心后可上样6．60V 电泳30-40min7．紫外检测（三）RNA浓度及纯度的测定1. 运行分光光度计中测定RNA的程序2. 200ul DEPC水作为空白, 5ul RNA样品+295ul DEPC水作为测量样品3. 测量的RNA样品的OD260/280应在1.8-2.0之间4. RNA样品的实际浓度等于分光光度计显示浓度ｘ60四、注意事项1. 整个实验过程中要戴口罩、一次性手套，一次性手套应经常更换，防止污染RNase2. 实验试剂及物品大多数为公用，请养成良好的实验习惯，用毕放回原处，试剂或物品用完或快用完，告知负责人，及时补充3．烤箱不能过夜工作，以免发生火灾4．DEPC为疑似致癌物，操作时应戴口罩、手套，小心吸取，避免污染实验台及物品注：10×MOPS的配制方法0.627g MOPS溶于12ml DEPC水中，加入1.2ml 1M NaAc (DEPC水配制)，用2M NaOH 调pH 7.0, 加入0.75ml 0.2M EDTA, 之后加入DEPC水定容为15ml。

1 实验背景目的基因的获得RT-PCRNorthern 杂交cDNA 克隆 差异显示为什么提取RNA ？第一讲总RNA 的提取和电泳检测1 实验背景蛋白质, DNA, RNA, 糖类, 脂质, 多肽, 小分子物质等目标产物分离纯化杂质生物大分子提取的依据1 实验背景生物分子间差异电荷溶解度生物学性质亲和性物理化学性质分子量形态1 实验背景生物大分子提取流程原料的选择、前处理粗提纯化浓缩和保存样品分析与检测生物大分子提取的一般原则1 实验背景完整性纯度效率一级结构高级结构产量经济一般原则2 实验设计mRNA的特性单链线性分子核蛋白体核糖核酸，不稳定性，易被降解（2,3位有一OH，反应活性高）均一性: rRNA（28S、18S、5.8S、5S，占80%）mRNA（1%～5%）tRNA和小分子RNA （10%～15%)容易被RNA酶（RNase）破坏2 实验设计提取RNA的来源细菌酵母血液动植物组织（小鼠脾细胞）培养细胞同一来源的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根和茎等）如何从脾细胞中提取总RNA？2 实验设计RNA 提取的基本过程浓缩检测脾细胞获得、培养12345纯化逆转录保存2 实验设计RNA 酶哪里有？外源：环境、器皿、耗材、试剂内源：组织本身含有的RNA酶RNA酶有链内二硫键，所以抗长时间煮沸和温和变性剂，变性后迅速重新折叠；RNA酶不需要二价阳离子激活，所以EDTA没用最好的办法是避免污染2 实验设计如何避免RNA酶的污染？试剂专用，最好使用新开封的，分小份保存，用后丢弃器皿、耗材、取液器专用勤换手套尽量简化操作步骤、缩短提取过程，以减少各种有害因素对RNA的破坏，把杂质的污染等降到最低程度等在操作中避免讲话使用RNA操作专用台2 实验设计如何破坏RNA酶的活性？变性剂：异硫氰酸胍、苯酚（蛋白质变性）、氯仿（除脂）等异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶变性剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

提取方法：SDS蛋白酶K法提取试剂：A液：Tris 0.05mol/L；NaCl 0.1mol/L；EDTA 0.1mol/L；Ph=7.0~8.0.B液：5%SDSC液：20mg/ml 蛋白酶KRNase 10mg/ml、Tris饱和酚（pH=8.0）、氯仿/异戊醇（24：1）提取步骤：（1）提取DNA前，先用70%的乙醇和无菌水先清洗虫体三遍，以去除虫体表面可能附着的杂质。

（2）取昆虫组织加入1.5ml离心管中，加入100µlA液用研磨棒研磨至基本透亮，再加入380µlA液冲洗研磨棒，然后加入B液60µl、C液6µl。

58℃金属浴3~4小时。

（3）加入RNase至终浓度100µg/ml，充分混匀后60℃金属浴30min。

（4）反应液冷却至室温，加入等体积的饱和酚，温和地上下转动混匀，反复该动作10min，切勿剧烈震荡。

温室5000g离心15min。

取上清至一干净的离心管中。

重复该步直至水相与液相交界处看不到白色的蛋白质为止，取上清。

（5）上清中加入等体积的氯仿/异戊醇，上下缓慢颠倒10次，室温8000g离心10min，取上清。

（6）上清中加入两倍体积的预冷无水乙醇，-20℃冰箱内放置10min，沉淀DNA，12000g 离心10min，弃上清。

（7）在留有沉淀的离心管中加入1ml 70%的预冷无水乙醇洗涤DNA，12000g离心5min，弃上清。

（8）管口向下，在室温自然干燥DNA，向干燥的DNA中加入适量TE（30~50µl）溶解，4℃保存。

DNA的检测纯度及浓度检测：使用微量分光光度计（NanoDrop2000/2000c）对所提取DNA进行检测，若OD260/OD280的值在1.7~1.9之间(>1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染)。

用于PCR扩增的DNA浓度应在100ng/µl左右。

完整性检测：取2~5µl样品与载样缓冲液（Loading Buffer）2µl混合，点样于1.0%的琼脂糖凝胶,然后置于1×TAE缓冲液中电泳，电泳电压为110V，时间约30min。

从RNA抽提到电泳鉴定——以肌肉组织基因为例1、RNA抽提一，准备工作1，实验器具与材料：移液枪吸头吸头台EP管玻璃研磨器容量瓶盐水瓶15ml塑料管一个（配75％乙醇用）2，实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。

（不需要泡DEPC水）3，试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4 小时后备用。

配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。

（2 ）75％乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。

（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩并尽可能在低温下操作，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤1．匀浆化作用取约100mg动物肌肉组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml 的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。

颠倒混匀10下，室温静置5分钟。

细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块。

组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管。

2．分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。

盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤关键词：RNA琼脂糖电泳2012-03-09 00:00 来源：互联网点击次数：38148 一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。

二、实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。

非变性电泳使用%%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。

只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。

因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。

在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。

三、实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。

电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。

琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。

四、实验步骤（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。

在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min 后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。

在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂：（1）MOPS缓冲液（10*）:L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS），L NaAc, 10mol/L EDTA。

（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,%溴酚蓝，%二甲苯蓝。

（3）甲醛。

（4）去离子甲酰胺。

v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——%DEPC水冲洗。

操作：（1）将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。

（2）配制琼脂糖凝胶。

①称取琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。

果蝇总RNA提取果蝇总RNA和总蛋白的提取与电泳条带分析摘要：本实验第一部分用果蝇成体为材料，以Trizol为提取液提取total RNA，进行反转录制备cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测total RNA和cDNA浓度，并结合电泳图谱对total RNA和cDNA图样进行分析；第二部分以果蝇幼体为材料，提取总蛋白，通过SDS-PAGE 检测果蝇总蛋白表达，对表达结果进行简要分析，并比较了成体和幼体果蝇的蛋白表达差异。

关键词：果蝇；total RNA；总蛋白；反转录；RT-PCR1 前言果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名：Drosophila melanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。

果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。

1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代[1]，之后的二十年中，一系列的科学发现补充了中心法则的各个环节，由此进入现代分子生物学发展阶段，基因工程技术也应运而生。

基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。

本实验的方法及步骤若应用到基因工程中则可划分到目的基因的获取这一环节。

即根据中心法则，DNA 上的遗传信息经转录传递到mRNA，而mRNA含量较少，可通过提取总RNA 的方法获得mRNA，再经特定引物的反转录获得cDNA，进而得到目的基因从而应用到分子及发育生物学研究中去。

生物化学实验报告姓名：学号:专业年级: 级临床八年制组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心【预习报告】一、实验原理1)总RNA的提取与定量在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80％—85％，tRNA和核内小分子RNA占10—15%,而mRNA只占1—5%。

rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。

mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20—250个多聚腺苷酸（polyA)。

利用此特点，用oligo（dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍—有机溶剂法,氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。

目前常用的是Trizol法.Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA.TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。

酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

Trizol试剂可用于小量样品（50～100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、〉107细胞）。

对人,动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern blot,dot blot,ployA筛选，体外翻译，RNase 保护分析和分子克隆。

核酸的提取、纯化和电泳检测摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法等等，其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，本实验采用碱变性法提取E.coli DH5α中Puc19质粒DNA，并通过RNase消化及酚-氯仿抽提除去质粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白，最后获得纯度较高的质粒DNA。

细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区，本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。

本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法，掌握DNA的纯化方法，即用RNase消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质，学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化及纯度检测的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及相应的方法操作。

关键词质粒DNA 碱变性提取法琼脂糖凝胶电泳细菌染色体DNA引言1.核酸分离纯化1.1总原则保证核酸一级结构的完整性化学损伤——缩短化学试剂作用时间，以减少其对核酸的损失；物理损伤——动作轻柔以减少机械剪切力；尽量低温操作以减少高温损伤；生物降解——加入相应酶抑制剂，防止生物降解排除其他分子的污染蛋白质——苯酚/氯仿/蛋白酶KRNA污染——RNase其他DNA——区别变性与复性有机溶剂——萃取、乙醇沉淀与洗涤金属离子——乙醇沉淀与洗涤1.2核酸纯化应达到的要求核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他生物大分子的污染应降到最低程度排除其他核酸分子的污染1.3核酸提取的一般过程破碎细胞（防止核酸酶的作用）破碎抽提核酸(裂解细胞释放内容物)——关键步骤核酸的纯化除去杂质（蛋白质、脂类、核酸）4°C最佳和最简单；-70°C是长期保存的良好温度，为一次性保存；-20°C核酸样品的保存（主要条件时温度和介质）-TE缓冲液最常用2.质粒DNA的提取及纯化——碱变性提取法（碱裂解/变性法）RNase消化及酚-氯仿抽提2.1 质粒DNA的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

肺吸虫成虫抗原组分分析
张月清
【期刊名称】《首都医科大学学报》
【年(卷),期】1991(000)004
【摘要】用 IE、SDS-PAGE 和 Western blot 对肺吸虫成虫抗原(PwA)成分进行分析.结果 IE 出现2条粗而明显的沉淀带。

SDS-PAGE 显示29条蛋白带(分子量范围为90.0～6.0 kD),其中有10条主带,分子量分别为57、53、49.5、46、42、30、27、25、14和13 kD.经 Western blot 试验显示,肺吸虫病人血清(抗体)与PwA 应答,可出现3条蛋白带,分子量分别为25、13和8 kD。

【总页数】1页(P293)
【作者】张月清
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R56
【相关文献】
1.成虫童虫冰冻切片抗原间接荧光抗体试验和免疫酶染色试验诊断肺吸虫病 [J], 史志明;章子豪;张耀娟
2.SDS-PAGE分析斯氏肺吸虫幼虫和成虫排泄分泌抗原 [J], 王光西;许扬;毛樱逾;张跃辉
3.斯氏肺吸虫成虫10—30KD抗原蛋白的分离及在免疫诊断中的应用 [J], 张锡林;李燎
4.斯氏肺吸虫成虫抗原皮内试验实用价值的探讨 [J], 宋明华;朱名胜;耿家荣
5.成虫生殖细胞抗原免疫荧光技术诊断肺吸虫病的初步研究 [J], 万翠英;雷昌球因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。