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耐异烟肼结核分枝杆菌相关耐药基因DNA序列分析摘要：耐异烟肼结核分支杆菌是全球范围内结核病治疗的主要难点之一。
在耐药性监测中发现，耐异烟肼结核分支杆菌耐药性逐年上升。
本研究采用PCR扩增技术，对不同的耐异烟肼结核分支杆菌样品进行耐药基因DNA序列分析。
结果显示，不同样品中共出现了9个与耐异烟肼相关的基因，其中，katG和inhA是最常见的。
本研究为耐异烟肼结核分支杆菌的耐药基因DNA序列分析提供了新的思路及实验方法。
关键词：耐异烟肼结核分支杆菌；耐药基因；DNA序列分析；PCR扩增技术1. 引言结核病是由结核分杆菌引起的一种传染病。
目前，全球仍然存在很高的结核病患者。
耐药性是结核病治疗中面临的主要挑战之一。
耐异烟肼结核分支杆菌是结核病治疗中最具挑战性的菌株之一。
目前，关于耐异烟肼结核分支杆菌的相关研究仍然不够深入。
因此，本研究旨在通过DNA序列分析技术，对耐异烟肼结核分支杆菌的耐药基因进行探索和研究。
2. 材料与方法2.1 样品采集本研究从不同地区采集了30株耐异烟肼结核分支杆菌样品，包括不同的耐药性类型。
2.2 DNA扩增和测序利用PCR扩增技术，扩增不同样品中的耐药基因DNA序列。
PCR扩增条件：反应体系总体积为25μL，反应液体系：DNA模板2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mM dNTP混合液2μL，0.5μL Taq多聚酶，1μL DNA扩增引物（10μM），MQ水16μL。
PCR反应程序：预变性（94℃，5min），30个循环（94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min）、最终扩增（72℃，10min），直至程序结束。
扩增后的PCR产物进行纯化，然后测序。
2.3 DNA序列分析利用序列比对软件对测序得到的DNA序列进行比对，找出与耐异烟肼结核分支杆菌耐药相关的基因。
3. 结果本研究共筛选出9个与耐异烟肼结核分支杆菌耐药相关的基因，包括katG、inhA、oxyR、ahpC、furA、fabG1、nalD-2、ndh、和ethA。
异烟肼耐药与结核分枝杆菌katG基因突变的研究
张宗德;贾红艳
【期刊名称】《结核病与胸部肿瘤》
【年(卷),期】1996(000)003
【摘要】探讨异烟肼耐药与结核分枝杆菌ｋａｔＧ基因突变的。
方法用ｋａｔＧ基因５‘端设计的引物对４６株结核分枝杆菌临床分离株进行了ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物进行ＳＳＣＰ分析。
结果：４６株结核分枝菌临床分离株均发现ｋａｔＧ基因序列的缺失。
对其ＰＣＲ产物进行ＳＳＣＰ分析。
结果：４６株结核分枝杆菌
【总页数】4页(P122-125)
【作者】张宗德;贾红艳
【作者单位】北京市结核病胸部肿瘤研究所;北京市结核病胸部肿瘤研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R378.911
【相关文献】
1.聚合酶链反应-测序技术快速检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG基因突变的研究[J], 予季;熊国亮;张慧慧;刘珍琼
2.基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性 [J], 戎奇吉;吕火祥;孙爱华
3.耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的研究 [J], 陈杨;陈玲;张泓;王建华;李娜娜;李开伦;甘辛;张建勇
4.痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究 [J], 杨松;张耀亭;钟敏;王易伟
5.耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究 [J], 霍亚楠;葛超荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
耐多药结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因突变特征观察王菊红;穆丽平【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2022(54)8【摘要】目的对比异烟肼和利福平在耐多药结核分枝杆菌(MTB)中相关基因的突变特征。
方法选取78例肺结核疾病患者进行研究,研究时间在2019年1月至2020年12月。
首先收集患者的痰液标本,通过病菌培养的方式检测MTB情况,判断菌株对利福平和异烟肼的耐药情况,并提取菌株中的DNA,观察其突变特征。
结果共69株菌株对利福平和异烟肼存在耐药性,其中9株单独对利福平耐药,24株单独对异烟肼耐药,36株同时对两者耐药。
利福平耐药菌株相关基因突变主要集中在rpoB450、rpoB445以及rpoB435密码子,占比75.56%,其中rpoB445和rpoB435最常见,其次是rpoB450;另外,耐药突变以单密码子突变为主,占比73.33%;组合突变的占比为26.67%。
而在异烟肼耐药相关基因突变主要涉及katG、ahpC、inhA、fabGl基因及其上游调控区域,其中katG315密码子和fabGl占比最高,在61.67%;而Ser315Thr突变最常见,占比40%,其次是Ser315Asn,占比15%;另外单基因突变47株,占比78.33%,两株基因突变13株,占比21.67%。
结论〖HTK〗MTB耐药水平受不同耐药基因突变的影响,其中利福平耐药基因突变主要集中在rpoB基因长度为81bp的热点区域;而异烟肼耐药基因突变则与hatG和inhA启动子有关。
【总页数】3页(P988-990)【作者】王菊红;穆丽平【作者单位】平顶山市传染病医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R195.3【相关文献】1.结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药水平与其耐药基因突变的相关性研究2.某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析3.扬州地区结核分枝杆菌对利福平与异烟肼耐药基因突变位点分布特征分析4.结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究5.耐多药结核分枝杆菌对氨基糖苷类及多肽类药物交叉耐药相关基因突变特征分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因及其突变的研究进展摘要】本文就报道的结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA、efpA、ini (A,B,C)及其突变位点进行综述。
【关键词】结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的慢性传染病。
随着耐药结核病，尤其是耐多药和广泛耐药结核病的出现，给结核病的防控工作带来了严峻挑战。
异烟肼是治疗结核病主要药物之一，但MTB耐异烟肼率已达17.6%，其耐药机制尚不明确，大多认为与MTB相关基因突变有关[1]。
本文综述目前国内外报道的MTB耐异烟肼相关基因及其常见突变位点，以进一步了解MTB耐异烟肼的发生机制。
1 katG基因异烟肼经MTB katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶活化后产生杀菌作用，katG突变使过氧化氢-过氧化物酶失活，导致MTB对异烟肼耐药。
KatG最常见突变位点是Ser315Thr。
Khadka JB等研究尼泊尔地区107例耐异烟肼菌株中，Ser315Thr及Ser315Ile突变率分别为77.6%及17.1%。
陈玲等研究显示Ser315Thr突变频率为66.7%[2]。
315位点还有Ser→Asn、Ser→Thr、Ser→Arg和Ser→Gly突变形式。
此外，还存在Val230Met、Pro232Gln、Gly237Glu、Gly309Cys、Asp304Glu、Asp357His、Asp357Asn、Arg463Leu、His276Met、Gln295His、Glu454Arg等突变[2-5]。
2 inhA基因inhA基因编码NADH依赖的enoyl-Acp还原酶，该酶催化α-不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸，产生的长链脂肪酸是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分。
异烟肼与分枝菌酸合成途径中的NADH依赖的enoyl-Acp复合体结合，阻断90%以上长链脂肪酸合成，从而抑制MTB生长。
３期戎奇吉等：基因芯片快速检测结核分枝杆菌ｋａｔＧ基因突变及其与异烟肼耐药相关性２３５Ｐｒｏｂｅ－ＡＰｒｏｂｅ—ＢＰｒｏｂｅ－ＣＰｒｏｂｅ－ＤＰｒｏｂｅ－ＥＰｒｏｂｅ－ＦＰｒｏｂｅ－ＧＳ３１５Ｎ（ＡＧＣ）Ｓ３１５Ｎ（ＡＧＣ—ＡＡＣ）Ｓ３１５Ｔ（ＡＧＣ—－ＡＣＣ）Ｓ３１５Ｉ（ＡＧＣ—，ＡＴＣ）Ｓ３ｌ５Ｔ（ＡＧＣ—，ＣＧＣ）Ｓ３１５Ｒ（ＡＧＣ—ＡＧＡ）Ｓ３１５Ｇ（ＡＧＣ—，ＧＧＣ）５’一Ｔｔｓ—ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡ（ｊＣＧ（；ＣＡＴＣＧＡＧ一３７５’一Ｔｌ５一ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡ（｝３’５’一Ｔ１５一ＧＣＧＡＴＣＡＣ【：ＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧ一３’５’一Ｔｌｓ—ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＧＡ（｝３’５’一Ｔ１５一ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧ一３’５’一Ｔ１５一ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＧＡＧ一３’５＇－Ｔｌｓ一（ｊＣＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣ（二Ａ（｝３７—０．２％ＳＤＳ）混合，１００℃水浴变性５ｍｉｎ后立即冰浴５ｍｉｎ。
取１０肚Ｌ加至芯片杂交区，４２℃水浴１ｈ，然后用１×ＳＳＣ一０．２％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ依次漂洗１ｒａｉｎ，室温中晾干。
用ＧｅｎｅｐｉｘＰｒｏ４００００Ｂ扫描仪扫描杂交后的芯片，检测波长为５３２ｎｍ（Ｃｙ３），分辨率为ｉ０＂ｍ，电压为５５０Ｖ，ＰＭＴ设为１０％。
扫描后的图象采用ＧｅｎｅＰｉｘＰｒ０４．０软件进行分析¨８｜。
野生型探针杂交荧光信号平均值／突变型探针杂交荧光信号平均值＞３结果判定为无突变的野生型，突变型探针杂交荧光信号平均值／野生型探针杂交荧光信号平均值＞３结果判定为突变型。
２结果２．１结核分枝杆菌对ＩＮＨ耐药率结核分枝杆菌Ｈ。
，Ｒｖ株对ＩＮＨ敏感，其ＭＩＣ值为０．０５ｍｇ／Ｌ。
１２３株结核分枝杆菌临床菌株中，３９．０％（４８／１２３）菌株对ＩＮＨ敏感，其ＭＩＣ值范围为０．０２５～０．１ｍｇ／Ｉ。
• 248 •中国防痨杂志2021 年3 月第43 卷第3 期Chin J Am itnberc，March 2021，V〇1. 43，No. 3 .论著•结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药相关基因突变与耐药水平的相关性研究王希江谭云洪贺文从欧喜超刘东鑫赵雁林【摘要】目的探究结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药基因突变谱的分布，为研发更为精准的耐药分子诊断技术和临床决策提供依据。
方法收集国家耐药监测点新疆维吾尔自治区柯坪县、岳普湖县和疏勒县193株和 湖南省怀化市、永顺县、祁东县、桃江县和耒阳市592株结核分枝杆菌。
采用微孔板法测定菌株的最小抑菌浓度(m in im u m in h ib ito ry c o n c e n tr a tio n，M IC)。
根据药物敏感性试验（简称“药敏试验”)结果选取利福平和异烟肼耐药菌株，经C T A B/N a C l法提取核酸后进行全基因组测序（w h o le g e n o m e s e q u e n c in g,W G S〉，将所得基因组原始序列过滤后上传至T B p r o f il e r分析工具以确定耐药基因型。
结果785株结核分枝杆菌中，124株（15.80%)为利福平 和(或)异烟肼耐药，包括利福平耐药74株，异烟肼耐药111株，耐多药61株(7. 77%)。
97. 22%(70/72)利福平耐药菌株检测出中出基因位点突变，其中98.57%(69/70)的突变位于利福平耐药决定区（R R I)R)，1株检测出R R D R区以外的与利福平耐药相关的罕见突变I49I F。
利福平耐药突变主要位于450、;'/^/} 445及rpoB 435 密码子，占8L43%(57/70),其中i'/wB S450L突变出现的频率最高（45. 71%，32/70),中必450位点突变对应高浓度利福平耐药452位点突变主要对应低浓度利福平耐药（M I C=2吨/m l)。
结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分子机制研究进展杨寿慧;刘惟优【摘要】结核病是由结核分枝杆菌引起的一种威胁全球健康的传染性疾病.异烟肼是结核病治疗应用最广泛的药物之一.前体异烟肼通过过氧化氢-过氧化物酶(KatG)激活,活化的异烟肼可抑制靶蛋白InhA.异烟肼耐药的分子机制涉及多个基因,其中katG基因突变是异烟肼耐药主要的原因,另外还有inhA、kasA、oxyR基因等.外排泵系统在异烟肼耐药方面也起着重要作用.了解异烟肼抗结核分枝杆菌作用机制及结核分枝杆菌耐异烟肼的分子机制将有助于异烟肼耐药结核病的诊治.【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2018(031)010【总页数】5页(P1086-1090)【关键词】结核分枝杆菌;异烟肼;耐药机制【作者】杨寿慧;刘惟优【作者单位】341000 赣州,赣南医学院第一附属医院呼吸科;341000 赣州,赣南医学院第一附属医院呼吸科【正文语种】中文【中图分类】R5160 引言结核病是由结核分枝杆菌引起的长期以来威胁人类健康的传染性疾病。
据世界卫生组织估计2015年全世界约有1040万新发结核病例，我国新发肺结核人数仅次于印度和印度尼西亚位高居全球第3位[1]。
作为一种典型的持留菌，体内潜伏感染的结核分枝杆菌难以清除并且有很强的耐药突变潜力[2]。
目前结核病治疗上应用最广泛的一线抗结核药物是异胭肼，但随着异烟肼耐药结核菌的增加，使得患者不得不更换昂贵且副作用大的二线抗结核药物。
结核病治疗方案的选择常常需要依据药敏结果，但传统药敏培养时间一般长达4～8周。
值得关注的是近年来分子生物学在结核菌耐药检测方面取得一些重要的进展，为结核分枝杆菌耐药检测提供了新思路。
1 异烟肼及其对结核分枝杆菌的作用机制结核分枝杆菌的细胞壁由长链分枝菌酸、高支链的阿拉伯多糖、肽聚糖组成的交叉连接网3个主要的组成成分。
异烟肼是作用于结核分枝杆菌细胞壁分枝菌酸合成的窄谱抗生素。
从1952年开始异烟肼作为抗结核药物应用于临床，其结构仅一个吡啶环连接一个酰肼基。
结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究【摘要】目的探讨结核分支杆菌对异烟肼(INH)的耐药分子机制，检测KatG、inhA基因突变在结核分支杆菌对INH耐药性测定中的应用价值。
方法采用PCR和PCR-SSCP方法对95株结核分支杆菌临床分离株和47例耐INH肺结核患者痰标本KatG基因突变进行检测。
结果以结核分支杆菌H37RV为对照，44株药物敏感株的KatG、inhA基因突变率分别为4.5%、0.51株耐INH分离株中，31株KatG基因发生突变，突变率为60.8%；3株inhA基因发生突变，突变率为5.9%。
47例耐INH肺结核患者痰标本中，KatG基因44例扩增阳性、inhA 基因40例扩增阳性，其基因突变检测率分别为47.7%、7.5%。
结论KatG基因突变是INH耐药性的重要分子机制，inhA基因与INH耐药性有相关性。
【关键词】结核分支杆菌；异烟肼；基因突变异烟肼(INH)作为最主要的一线抗结核药物之一，对其耐药性的研究日益受到重视。
国外也有报道认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，与inhA基因突变也有相关性［1］。
我们采用采用PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法检测了95株肺结核患者痰标本临床分离株，并对47例结核患者痰标本直接进行KatG基因、inhA基因突变检测，现将结果报告如下。
1 材料与方法1.1 材料95株结核分枝杆菌临床分离株和47例肺结核患者涂阳痰标本。
95株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中51株对异烟肼耐药，44例对异烟肼敏感。
47例肺结核患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中18例对异烟肼耐药，29例对异烟肼敏感。
1.2 方法1.2.1 DNA的提取用传统酚/氯仿抽提法提取标本中DNA［2］。
1.2.2 PCR扩增采用25ul反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mm01/l，引物终浓度为0.2 umol/L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸l min，循环30次，最后72℃延伸l0 min。
结核分枝杆菌异烟肼耐药性——一个不容忽视的问题李桂莲;万康林【摘要】异烟肼是控制结核病的主要药物之一.2018年WHO报告的结核病初治病人中利福平敏感的异烟肼耐药率明显高于2017年的耐多药/利福平耐药率.我国结核病人的异烟肼总耐药率明显高于利福平总耐药率.异烟肼耐药容易导致治疗失败或复发.异烟肼耐药机制复杂,多个基因的突变均与异烟肼耐药有关,然而这些基因突变与表型的关系尚未完全清楚,直接影响了分子药敏快速诊断方法的建立.基因组学数据证明异烟肼耐药相关基因突变先于利福平耐药性相关基因突变发生.异烟肼耐药结核分枝杆菌容易诱发菌株获得额外耐药性,其机制可能与外排泵以及氧化应激机制有关.总之,结核分枝杆菌异烟肼耐药问题不容忽视,因此应该加强异烟肼作用机制、耐药机制、协同作用机制等方面的研究.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2019(035)006【总页数】5页(P475-479)【关键词】结核分枝杆菌;异烟肼;耐药性【作者】李桂莲;万康林【作者单位】中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,北京102206;中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,北京102206【正文语种】中文【中图分类】R378.91结核病是严重危害人类健康的传染病，也是我国重点防控的重大传染病之一。
据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)估计，2017年我国结核病患者数居世界第2位，耐多药结核病(multi-drug resistant TB，MDR-TB)/耐利福平结核病(rifampicin resistant tuberculosis， RR-TB)负担居世界第2位[1]，结核病尤其是耐药结核病对我国如期完成“终止结核病流行目标”是一个重大挑战。
因此，加强结核分枝杆菌耐药性的研究尤其重要。
