下载文档原格式
分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。
以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5 菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。
整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。
其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。
各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。
整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。
我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。
分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。
实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。
因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。
在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学-3(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、选择题(总题数：10，分数：10.00)1.某种类型的贫血病患者，其红细胞内的一条β链缺失，但Northern杂交证实患者和正常人β链mRNA 条带没有差别，那么患者可能的缺陷是：（分数：1.00）A.加尾信号发生突变B.剪接位点发生突变C.启动子发生突变D.起始密码子和第二个密码子之间发生了移码突变√解析：[解析] A和B两种变异会直接影响成熟mRNA的相对分子质量，而C会导致mRNA的产量变化，因此这三种突变都会引起Nothern blotting结果的变化。
2.下列哪种因素可能防止DNA序列点突变导致的蛋白质一级序列变化：（分数：1.00）A.翻译过程中的校对作用B.密码子的简并性√C.蛋白质的翻译后修饰D.mRNA的选择性拼接解析：3.线粒体DNA的突变概率远高于核DNA，可能的原因是：（分数：1.00）A.线粒体DNA缺少组蛋白保护B.线粒体DNA进化时间短C.线粒体内大量的生物氧化反应所产生的自由基对DNA有损伤作用D.线粒体内缺少DNA修复机制√解析：4.在人体细胞内，以下哪一类反应出错的概率最低：（分数：1.00）A.DNA复制√B.DNA转录C.蛋白质翻译D.RNA拼接解析：5.大肠杆菌中的光复活修复系统能够特异性地修复下列哪种类型的损伤：（分数：1.00）A.嘧啶二聚体√B.DNA双链断裂C.DNA中错误掺入的尿嘧啶D.DNA双链中的错配碱基解析：6.与DNA甲基化修饰无关的过程是：（分数：1.00）A.错配修复B.修饰限制系统C.组织特异性基因失活D.SOS反应√解析：7.生活在高温等极端环境下的细菌，其基因组DNA的突变概率与常温下生存的原核生物相比未见升高，可能的原因是：（分数：1.00）A.高温环境下，引发基因突变的诱因降低B.基因组DNA序列比较特殊，不易发生突变C.与常温下生存的原核生物相比，有更为有效的DNA修复机制√D.与常温下生存的原核生物相比，基因组小，所以发生突变的概率低解析：8.如果大肠杆菌的dUTPase发生突变，失去活性，那么以下哪种碱基突变最易发生：（分数：1.00）A.A颠换为CB.C颠换为GC.C转换为T √D.A转换为T解析：[解析] dUTPase发生突变，细胞内的dUTP掺入DNA，CG碱基对变为UG，DNA复制中转换为UA，然后成为TA碱基对。
分子生物学实验指导书本实验指导书包括三个紧密相关、前后衔接的实验，可供16-20学时的实验课教学使用。
实验内容均为分子生物学最常用的实验技术，希望同学们能熟练掌握。
实验体系已经多次尝试和优化，虽趋成熟但非尽善尽美，更非逢做必成。
随实验条件的变化，每次实验前的预实验是有必要的。
指导书如有不妥之处敬请指出，以便再次修订。
西北农林科技大学农学院柴守诚实验一植物总DNA的提取1.实验目的通过实验学习和掌握植物总DNA提取和纯化的原理和方法，并为后续的实验准备DNA样品。
2.实验原理2.1 DNA提取的原理植物组织中总DNA的提取首先要破碎细胞。
植物细胞具有坚硬的细胞壁，液氮冷冻和研磨是破碎植物细胞壁的有效方法。
而细胞膜、核膜等膜体系的破坏则通过加入提取缓冲液中的去污剂的处理来实现。
常用的去污剂有SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)，CTAB(cetyltrimlthylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)等。
细胞壁、细胞膜及核膜破坏后，释放出细胞内含物至提取缓冲液，内含物中包括DNA、RNA和蛋白质等。
将其他组分除去或降解，然后回收DNA是常采用的一种提取和纯化DNA的技术路线。
磨碎的植物组织经提取缓冲液处理后通过离心可沉淀植物组织残渣至试管底部，取上清液、弃残渣，上清中加入苯酚和氯仿（三氯甲烷）处理后经离心蛋白质沉淀于有机相（下相）和水相（上相）的界面处。
水相中含有溶解的DNA和RNA,收集水相加入核糖核酸酶A(ribonuclease A ，RNaseA)则使RNA降解，而DNA仍完整。
加入乙醇或异丙醇可使DNA呈絮状沉淀析出，絮状沉淀可用玻棒或牙签缠绕挑出或通过离心收获，并重新溶解于适量的TE缓冲液中备用。
2.2 DNA提取的质量要求对DNA提取样品的基本质量要求是尽量保持DNA分子的完整性（即没有或很少降解）和样品的高纯度（即蛋白质和RNA等的污染程度低）。
分子生物学-三(总分：100.00，做题时间：90分钟)一、名词解释(总题数：10，分数：20.00)1.端粒酶(telomerase)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(端粒酶是一种特殊的DNA聚合酶，即自身携带RNA模板的逆转录酶。
端粒酶既含有蛋白质成分也含有RNA分子，解决了真核生物线性DNA复制时所产生的5'末端隐缩的问题。
)解析：2.引发体(primosome)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(DNA复制起始过程中，高度解链的DNA模板和蛋白质的复合体促进引物酶加入，形成引发体，合成RNA引物。
)解析：3.TAAT框(TAAT box)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(原核生物启动子的组分，位于转录起始点上游6 bp的保守序列，保守序列中心位于-10 bp处，是RNA聚合酶的结合位点，该区富含AT对，解链便于转录的起始。
)解析：4.RNA干涉(RNA interference)（分数：2.00）__________________________________________________________________________________________ 正确答案：(RNA对基因表达的调控，称RNA干涉，由双链RNA断裂而来的小RNA分子，可引发转录后基因沉默。
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册1. 简介分子生物学是研究生物体内分子结构、组成、功能以及相互作用的科学。
在高中生物学课程中，通过进行一系列分子生物学实验，可以加深对基因、DNA、RNA等内容的理解，并培养学生动手实践和科学探究的能力。
本操作手册将介绍一些适合高中副标准课程的基本分子生物学实验，帮助教师和学生更好地开展这方面的实验教学。
2. 实验一：提取DNA2.1 实验目的了解DNA的结构和提取过程，并掌握提取DNA的基本方法。
2.2 材料与仪器•成熟香蕉或其他植物材料•盐水溶液（含氯化钠）•蛋白酶（如葡萄胺酸酶）•洗涤剂（如洗衣粉）•咖啡滤纸或滤纸漏斗•烧杯•酒精1.将香蕉剥皮后放入砧板上，用刀将香蕉捣碎成泥状。
2.在烧杯中加入适量的盐水溶液，并将捣碎的香蕉放入其中搅拌均匀。
3.加入少量蛋白酶和洗涤剂，再次搅拌均匀，让细胞破裂释放DNA。
4.将混合物过滤到另一个烧杯中，通过滤纸除去大颗粒的残渣。
5.将过滤后的溶液倒入试管中，并缓慢地倾斜试管，在溶液与酒精接触的界面处，会出现白色粘稠物质，即提取到的DNA。
2.4 实验结果及分析实验中提取到的DNA呈现为白色细丝状物质。
通过这个实验可以观察到DNA 在水相和酒精相之间的界面上凝聚堆积。
说明了DNA在酒精中不溶性，从而便于提取。
3. 实验二：PCR扩增3.1 实验目的了解聚合酶链式反应（PCR）的原理和基本步骤，并能够进行PCR扩增实验。
3.2 材料与仪器•PCR试剂盒（含模板DNA、引物、聚合酶等）•热循环仪•PCR试管或反应管1.准备PCR反应体系，按照试剂盒说明书的要求加入模板DNA、引物和聚合酶等。
2.将装有反应溶液的PCR管放入热循环仪中。
3.设置PCR的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段。
4.启动热循环仪开始PCR扩增反应。
5.完成PCR后，可以通过凝胶电泳等方法检测扩增产物。
3.4 实验结果及分析通过PCR扩增，可以在较短的时间内大量复制并放大目标基因片段。
分子生物学实验技术三、外源基因在大肠杆菌中的表达（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达实验安排：每组做一份（5人/组）。
操作步骤：1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5 mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。
3、取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5 mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3 h。
4、分别取菌液1 mL于1.5 mL Ep管中，12000⨯g离心30 s，收获菌体。
5、用100 μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100 µL 2⨯SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5 min。
6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。
注意事项：1、IPTG的最佳诱导浓度的确定：将IPTG以不同浓度（0.2-2.0 mM）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG浓度作为其最佳诱导浓度。
2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的IPTG诱导6 h，其间每隔1 h（在第1、2、3、4、5、6 h）分别取菌液1 mL，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。
（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验安排：示范性操作。
实验原理：细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。
其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。
相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。
本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。
碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。
小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。
三、实验方法1.仪器用具:a.无菌操作台(laminar flow)b.台式型离心机(microcentrifuge)c.微量吸管(pipetman)d.真空干燥机(speed vac)e． 漩涡混合器f． 琼脂糖凝胶电泳仪2.材料:实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并在37 o C下振荡培养过夜。
3.药品及试剂:a.Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucoseb.Solution II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制)c.Solution III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)d.RNase A: 1mg/mle.TE buffer: 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)f.100% 乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)g.LB(Luria-Bertani)培养液: 10g tryptone, 5g yeaste extract, 10g NaCl in 1Lh．酚/氯仿（1：1）溶液i．1 x TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）j .DNA mark er：DL20004.实验步驟:1)将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000 rpm离心1分钟后，倒去上清液。
2)沉淀菌体加入50 μl Solution I，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于冰上5分钟。
3)加入100 μl Solution II，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可剧烈振荡，置于冰上5分钟。
4)加入75 μl Solution III，亦温和摇匀，置于冰上5分钟。
5）加等体积酚：氯仿(1:1)225 μl混匀。
6)以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。
7)加入2倍体积100% 酒精，混合均匀，置于冰上20分钟。
8)以12,000 rpm 离心8分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置于真空干燥机中10分钟。
9)加入15ul灭菌水，溶解DNA。
10）电泳检测（琼脂糖凝胶电泳），取5μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳半小时,电压80伏。
11）电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。
四、注意事项1．细菌培养过程要求无菌操作。
抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。
细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。
接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。
2．制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。
同时也应防止DNase引起DNA的降解。
3．酚氯仿有强腐蚀性，使用时要格外小心，不要弄到手上，必要时带手套。
4．加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。
5．用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单度作用酚或氯仿更好。
为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。
6．提取的各步操作尽量在低温条件下进行（冰裕上）。
7．电泳时，电泳缓冲液要没过凝胶。
8. 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。
所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。
超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。
本实验采用绿色荧光蛋白（GFP）对DNA进行染色，电泳显示有些脱尾，绿色荧光部分有一大片，可能是把染料直接加到质粒DNA中所致，所以我又将胶用EB（溴化乙锭）染色，紫外线照射下呈桔红色荧光，可由上图清除看到质粒DNA所在位置。
(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型实验二 PCR反应一、实验目的1、学习PCR 反应的基本原理与实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
二、实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。
利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片断，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。
由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。
PCR进行的基本条件是：（1） 以DNA为模板（在RT-PCR中模板是RNA）；（2） 以寡聚核苷酸为引物；（3） 需要4种dNTP 作为底物；（4） 有 Taq DNA 聚合酶。
PCR 每一个循环由三个步骤组成：（1） 变性 加热模板DNA，使其解离成单链；（2） 退火 降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序列结合；（3） 延伸 在适宜温度下，DNA 聚合酶利用dNTP 使引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片断的扩增可达106-107倍。
本实验扩增的片段约1.3kb，故需用LA Taq TM 扩增长片段。
三、 实验方法1、仪器用具：a．PCR 扩增仪b．琼脂糖凝胶电泳仪2、药品及试剂a．LA Taq TM（5U/μl）购于Takarab.10×反应缓冲液：0.67mol/l，pH = 8.8 Tris-HCl,0.067mol/l MgCl2，0.166mol/l （NH4）2SO4c.dNTP(2.5mM)d.引物P1，P23、实验步骤1）PCR扩增体系在150μl离心管中按体积有大到小加入下列试剂，最后加酶：模板 0.5μl引物P1 0.5μl引物P2 0.5μldNTP 3 μl10×buffer 2.5μlLA Taq 0.5μlO 17.5μlddH2Total 25 μl2）扩增程序预变性 94℃ 5min变性 94℃ 30s30个循环退火 43℃ 30s延伸 72℃ 2min末端延伸 72℃ 10min保存 16℃ 8h3）PCR产物电泳检测 反应结束后，取5μl PCR 产物用1% 的琼脂糖凝聚电泳检测，用GLP 在紫外灯下检测。
四、注意事项1、在加入各试剂时要先加体积大的试剂，再加体积小的试剂，并充分混合。
2、加Taq酶时要拿管的上部，避免用手触摸酶的部分。
3、PCR的影响因素：（1）模板 单、双链 DNA 都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。
虽然PCR 可以用极度微量的样品甚至是来自于单一细胞的DNA，但为了保证反应得特异性，一般宜用ng级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA 或104拷贝数量的待扩增片断来作起始材料。
原料可以是粗制制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。
